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实验六从土壤中分离特定功能微生物_图文

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重要提示
? 爱护实验室公共用品,维持实验场所的清洁卫生; 爱护实验室公共用品,维持实验场所的清洁卫生; 用后的药品必须立即加盖收拾好, 用后的药品必须立即加盖收拾好,并清理天平上的 杂物。 杂物。 ? 灭菌锅锅盖上的通气软管不能弯折放置! 灭菌锅锅盖上的通气软管不能弯折放置! ? 微生物实验中用到的培养基固态为多,弃置时不得 微生物实验中用到的培养基固态为多, 倒入水池,必须倾倒入厕所的下水道。 倒入水池,必须倾倒入厕所的下水道。 ? 水池内的防堵过滤网可以有效防止水池的通畅,不 水池内的防堵过滤网可以有效防止水池的通畅, 得擅自移取丢弃。 得擅自移取丢弃。 ? 显微镜使用后一定要注意做清洁工作,特别是油镜 显微镜使用后一定要注意做清洁工作, 的清洁工作。亮度可调时要打小档后关闭。 的清洁工作。亮度可调时要打小档后关闭。 ? 以上工作,由劳动委员总负责,班委成员和组长应 以上工作,由劳动委员总负责, 在所在小组里发挥带头模范作用, 在所在小组里发挥带头模范作用,班级成员要自觉 执行。 执行。

课程内容
? 微生物所需要的营养物质 ? 培养基及其种类 ? 土壤中的微生物及其分布特点

3.1.2 微生物需要的营养物质
水(water) water) source) 碳源 (carbon source) 氮源(nitrogen source) 氮源( 无机盐( 无机盐(mineral salts) 生长因子( factor) 生长因子(growth factor)


微生物细胞含水约占细胞鲜重的70-90%, 微生物细胞含水约占细胞鲜重的70-90%, 70 水作用是多方面的 水的功能: 水的功能:
① 是细胞中生化反应的良好介质

水的比热高, ② 水的比热高,能有效的吸收代谢过程中放出的 热量, 热量,不致使细胞的温度骤然上升 物质运输载体; ③ 物质运输载体;

碳源
凡能供给微生物碳素的各种含碳化合物称为碳源。 凡能供给微生物碳素的各种含碳化合物称为碳源。 碳源功能: 碳源功能: 碳素构成细胞各种有机成分的骨架 碳素也是异养微生物代谢所需的能量来源 碳源种类: 碳源种类: 无机C CO2、碳酸盐, 无机C源:CO2、碳酸盐,只能被自养微生物利用 有机C 各种糖类,其次是有机酸、醇类、 脂类、 有机C源:各种糖类,其次是有机酸、醇类、 脂类、 烃类化合物,以及其他含碳污染物 烃类化合物,

氮源
凡是可以构成微生物细胞和代谢产物中氮素 来源的营养物质都称为氮源。 来源的营养物质都称为氮源。 氮源功能: 氮源功能: 为微生物提供合成其重要组分如蛋白质、 为微生物提供合成其重要组分如蛋白质、 核酸等的原料

氮源种类
分子态氮: 分子态氮:固氮微生物以分子氮为 唯一氮源 无机态氮:铵盐、硝酸盐, 无机态氮:铵盐、硝酸盐, 几乎所有微生物能利用 有机态氮:牛肉膏、蛋白胨、 有机态氮:牛肉膏、蛋白胨、酵母 膏 等水解程度越高越容易利 用 在利用微生物技术处理单一的缺乏 氮素工业污水时,必须添加氮, 氮素工业污水时,必须添加氮,如 尿素或人畜粪便。 尿素或人畜粪便。

无机盐
构成微生物细胞的组成成分 有些无机盐如S Fe还可做为自养微生物 有些无机盐如S、Fe还可做为自养微生物 的能源 构成酶活性基的组成成分, 维持酶活性。 构成酶活性基的组成成分 , 维持酶活性 。 Mg、Ca、 是多种酶的激活剂. Mg、Ca、K是多种酶的激活剂.

无机盐种类
阴离子盐:磷酸盐、硫酸盐、氯化物、碳酸盐、 阴离子盐:磷酸盐、硫酸盐、氯化物、碳酸盐、碳 酸氢盐。 酸氢盐。 阳离子盐: 阳离子盐:氨、钾、钠、钙、镁、铁的盐 P和S、Fe、Mg的需求量较大 同时还需要锌、 同时还需要锌、锰、钴、铝、铜、硼、钒、镍等微 量元素。 量元素。

生长因子
生长因子:指微生物需要的, 生长因子:指微生物需要的,而又不能自己 合成的微量有机物质 微量有机物质, 合成的微量有机物质,这些微量有机物对微 生物生长有极重要作用。 包括: 生物生长有极重要作用。 包括:
维生素:如B1、B2、B6、B12、VC 维生素: B1、B2、B6、B12、 氨基酸:如赖氨酸、蛋氨酸、 氨基酸:如赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸等 碱基如:嘌呤、 碱基如:嘌呤、嘧啶

请比较:微量元素和生长因子的区别? 请比较:微量元素和生长因子的区别?

培养基及培养条件 -----学会养菌 -----学会养菌

? 培养基定义: 培养基定义: 根据各类微生物的营养需求,将水、 根据各类微生物的营养需求,将水、 碳源、氮源、 碳源、氮源、无机盐及生长因子按照 一定比例配制, 一定比例配制,适合微生物的生长繁 殖及其他生理功能的组合基质。 殖及其他生理功能的组合基质。

培养基按成分来源的不同分
1.天然培养基:主要成分是复杂的天然有机 .天然培养基 主要成分是复杂的天然有机 物质,如马铃薯、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、 物质,如马铃薯、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、 血清等。 血清等。这些复杂天然有机物质的成分不完 全了解,每次所用的原料, 全了解,每次所用的原料,其中各成分的数 量也不恒定。 量也不恒定。这类培养基是实验室常用的培 养基,例如牛肉膏蛋白胨培养基、 养基,例如牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培 养基等。 养基等。 2.合成培养基 用化学成分完全了解的纯试 .合成培养基:用化学成分完全了解的纯试 剂配制而成的培养基,如高氏1号培养基 号培养基, 剂配制而成的培养基,如高氏 号培养基, 查氏培养基等。一般用于营养代谢、 查氏培养基等。一般用于营养代谢、分类鉴 菌种选育、遗传分析等。 定、菌种选育、遗传分析等。 3、半合成培养基 、

按培养基的物理状态分类
? 1.固体培养基:在液体培养基中加入凝固剂即为 .固体培养基 在液体培养基中加入凝固剂即为 固体培养基。实验用的凝固剂有琼脂、 固体培养基。实验用的凝固剂有琼脂、明胶和硅 后者用于配制自养微生物的固体培养基。 胶,后者用于配制自养微生物的固体培养基。对 其他多数微生物来讲,以琼脂最为合适, 其他多数微生物来讲,以琼脂最为合适,一般加 即可凝固成固体。 入1.5—2.5%即可凝固成固体。此培养基可供 . . 即可凝固成固体 分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等用。 分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等用。 ? 2.半固体培养基 在液体培养基中加入少量凝固 .半固体培养基:在液体培养基中加入少量凝固 剂即为半固体培养基,例如琼脂只需加入0.2— 剂即为半固体培养基,例如琼脂只需加入 . 0.7%。常用作细菌动力检查和菌种保存、噬菌 . 。常用作细菌动力检查和菌种保存、 体制剂的制备等。 体制剂的制备等。 ? 3.液体培养基 没有加琼脂,配好后成液体状态 没有加琼脂, .液体培养基:没有加琼脂 的培养基。常用于生理代谢的研究和工业发酵等。 的培养基。常用于生理代谢的研究和工业发酵等。

按培养基的用途分类
? 1.基础培养基:如牛肉膏蛋白胨培养基是 .基础培养基: 培养细菌的基础培养基; 培养细菌的基础培养基; ? 2.营养培养基(加富培养基):如培养人 ):如培养人 .营养培养基(加富培养基): 百日咳杆菌时必须添加血清的加富培养基; 百日咳杆菌时必须添加血清的加富培养基; ? 3.选择培养基: 如纤维素分解菌培养基, .选择培养基: 如纤维素分解菌培养基, 固氮培养基等; 固氮培养基等; ? 4、鉴别培养基:如EMB(伊红美兰培养基) 、鉴别培养基: (伊红美兰培养基) 可以迅速根据生长的外观判断大肠杆菌的 存在。 存在。

一些典型的培养基 (1)细菌培养基:如牛肉膏蛋白胨培养基 细菌培养基: (2)放线菌培养基:如高氏一号培养基 放线菌培养基: (3)真菌培养基:如马铃薯葡萄糖培养基 真菌培养基: 大肠杆菌鉴别培养基:EMB培养基 (4) 大肠杆菌鉴别培养基:EMB培养基

成品培养基(快餐型) 成品培养基(快餐型)

微生物的培养条件
适宜的生长温度 适宜的PH值 适宜的 值 氧气需求 光照与否

温度影响
根据微生物最适生长温度的不同, 根据微生物最适生长温度的不同,可将 微生物划为三个类型: 微生物划为三个类型: 低温型微生物(嗜冷微生物) 低温型微生物(嗜冷微生物) 中温型微生物(嗜温微生物) 中温型微生物(嗜温微生物) 高温型微生物(嗜热微生物) 高温型微生物(嗜热微生物)

氧气对微生物生长的影响 专性好氧菌: 必须在有较高的氧浓度条件 专性好氧菌 : 下才能生长。 下才能生长。 微好氧菌: 微好氧菌:只能较低的氧分压下才能正常生长 兼性好氧菌: 兼性好氧菌:在有氧或无氧条件下均能生 但有氧情况下生长得更好。 长,但有氧情况下生长得更好。

耐氧菌: 耐氧菌 : 可在分子氧存在下进行厌氧生活 的厌氧菌。 生活不需要氧, 的厌氧菌 。 生活不需要氧 , 分子氧也对它 无毒害。 无毒害。 厌氧菌:分子氧对它有毒害,短期接触空气, 也会抑制其生长甚至致死;在空气中,固体 培养基表面上不能生长,只有在其深层的无 氧或低氧化还原电势的环境下才能生长

供氧或隔氧一般措施
在培养不同类型的微生物时, 在培养不同类型的微生物时,要采用相应的措施保证不同 微生物的生长。 微生物的生长。 培养好氧微生物:需震荡或通气,保证充足的氧气。 培养好氧微生物:需震荡或通气,保证充足的氧气。 好氧活性污泥工艺中,要保持溶解氧浓度≥ 2 mg/l 好氧活性污泥工艺中,要保持溶解氧浓度≥ 培养专性厌氧微生物:需排除环境中的氧气。 培养专性厌氧微生物:需排除环境中的氧气。 培养兼性厌氧或耐氧微生物:可深层静止培养。 培养兼性厌氧或耐氧微生物:可深层静止培养。

习题
是微生物需要的,但又不能 微生物需要的, 自己分成的微量有机物质。 自己分成的微量有机物质。 微生物需要的营养物质有:________、 微生物需要的营养物质有 、 _______、 __________、 、 、 和 。 微生物的生长繁殖除了需要营养外, 微生物的生长繁殖除了需要营养外,还需要 一些合适的培养条件: 一些合适的培养条件: 、 、 和 。 实验室常用的碳源有 和__ _等,常用 等 的有机氮源有__ __和__ 的有机氮源有 和 等, 无机氮源 __和 有__ 和 等。

习题
下面哪项不属于生长因子( 下面哪项不属于生长因子( ) A.维生素 B。氨基酸 . 。 C。硫酸盐 D。核苷酸 。 。 下列属于微量元素的是( 下列属于微量元素的是( ) A: C、H 、O B: Ca. 、 Mg : 、 : C.: Zn. Cu : D: P.、 S : 、 常用来进行菌种分离鉴定的培养基是( 常用来进行菌种分离鉴定的培养基是( A 固体培养基 B 液体培养基 C半固体培养基



微生物需要的营养物质有很多, 微生物需要的营养物质有很多,但以下哪一 种是不需要的?( ) 种是不需要的?( A、水 B、无机盐 、 、 C、琼脂 D、生长因子 、 、 下面哪种培养基适合放线菌生长:( 下面哪种培养基适合放线菌生长:( ) A、生肉膏蛋白胨 B、麦芽汁琼脂 、 、 C、高氏一号培养基 D、伊红美培养基 、 、

实验六 土壤中特定功能微生物 的富集和分离纯化方法
理论讲解: 土壤中微生物分布特点; 土壤中微生物的富集和纯化方法; 特定功能微生物的种类和富集方法;

土壤微生物的种类、数量和分布 土壤微生物的种类、
土壤微生物的种类和数量; 土壤微生物的种类和数量; 细菌最多,其次是放线菌和真菌,藻类和 原生动物数量最少 土壤微生物的作用 转化土壤中各种物质的状态、改变土壤的 理化性质,是构成土壤肥力的重要因素; 是土壤自净作用的基础,也是土壤修复的 主力军;

土壤微生物的分布状况
土壤微生物的水平分布 在油田存在较多分解石油的微生物;林区 存在较多分解纤维素的微生物;果园土则 含有较多的酵母菌 土壤微生物的垂直分布 表土微生物数量少,在5 20cm的土层中 表土微生物数量少,在5—20cm的土层中 微生物数量最多,再往深处则又减少

土壤中微生物富集纯化的意义
土壤是微生物生活最适宜的环境、 土壤是微生物生活最适宜的环境、它具有微生物 所需要为一切营养物质和微生物进行生长繁殖及 生存的各种条件. 生存的各种条件.所以土壤中微生物的数量和种 类都很多。它们参与土壤的氮、 类都很多。它们参与土壤的氮、碳、硫、磷等元 素的循环作用。此外, 素的循环作用。此外,土壤中微生物的活动对土 壤形成、土壤肥力和作物生产都有非常重要的作 壤形成、 因此,查明土壤中微生物的数量和组成情况, 用。因此,查明土壤中微生物的数量和组成情况, 从土壤中分离出特定功能的微生物, 从土壤中分离出特定功能的微生物,对发掘土壤 微生物资源和对土壤微生物实行定向控制无疑是 十分必要的。 十分必要的。

实验六 土壤中特定功能微生物的富集和纯化

一、实验目的: 实验目的:
1. 进一步熟练和掌握培养基的配制和分装、灭 进一步熟练和掌握培养基的配制和分装、 菌等技术。 菌等技术。 2、了解固氮菌和纤维素分解菌的培养基组成 、 特点; 特点;了解从土壤中分离纯化特定功能微生 物的方法和操作过程。 物的方法和操作过程。

(第1、2排)固氮菌培养基(1L 水) 、 排 固氮菌培养基(
15.0g 葡萄糖 K2HPO4 0.5g MgS04 0.2g CaSO4 0.1g NaCl 0.2g CaCO3 5.0g pH 7--8 如需要做固体培养基, 所加琼脂含氮量低为好。 如需要做固体培养基 , 所加琼脂含氮量低为好 。

(第3、4排) 固氮菌培养基(1L 水) 、 排 固氮菌培养基(
甘露糖醇 K2HPO4 MgS04 CaSO4 NaCl CaCO3 pH 15.0g 0.5g 0.2g 0.1g 0.2g 5.0g 7--8

平板上固氮菌的富集培养程序
? 1、用已灭菌后冷却至50oC左右的阿斯 毕培养基倒成平板。 ? 2、用已灭菌的镊子将黄豆粒大的菜园 土摆入已冷凝的平板培养基上。 ? 3、正面放置培养箱中培养,28oC培养 3~4天后,在土粒周围有混浊半透明的 胶状菌落出现,有的在后期会产生褐色 的色素。
? 第一排、第三排做固体平板上的固氮菌富集。 第一排、第三排做固体平板上的固氮菌富集。

液体培养基中固氮菌的富集
? 将配制好的无氮液体培养基,分装于100ml 的三角瓶中,每瓶装 30ml, 灭菌冷却后, 各接种少许土壤,于 28--30度下培养 约7 天,在液面可见到灰白色菌膜,慢慢会变 为黑褐色。取液面菌膜制片,镜检。并对 菌液做进一步的分离纯化。 ? 第二排、第四排做液体培养基中的固氮菌 第二排、 富集。 富集。

(第5、6排) 、 排

富集纤维素分解菌的培养基1 富集纤维素分解菌的培养基1
? 1L水中含: KH2PO4 1.00 ; MgSO4 0.3 ; NaCl 0. 1; NaNO3 2.5 ; CaCl2·6H2O 0.1 ; FeCl3 0. 01 ; pH 自然 第五排: 第五排:固体培养基 第六排: 第六排:液体培养基

纤维素好氧分解实验步骤
1.制作平板:取已融化的纤维素好氧培养基, .制作平板:取已融化的纤维素好氧培养基, 倒入无菌培养皿中, 倒入无菌培养皿中,制成平板 2.放置滤纸;用镊子取无菌滤纸 张,放入已 .放置滤纸;用镊子取无菌滤纸1张 凝固的琼脂平板上,紧贴,使滤纸表面湿润。 凝固的琼脂平板上,紧贴,使滤纸表面湿润。 3.加放土粒:用镊子取肥沃菜园土 余粒 .加放土粒:用镊子取肥沃菜园土10余粒 或森林土粒),均匀排在滤纸表面, ),均匀排在滤纸表面 (或森林土粒),均匀排在滤纸表面,进行接 种(图5--1)。 图 。

图五 纤维素好氧分解实验

4.恒温培养:放入培养箱,28—30 C条件下培养 .恒温培养:放入培养箱, 条件下培养 7—10d。 。 5.结果检查:先观察土粒周围有无黄色、桔黄色、 .结果检查:先观察土粒周围有无黄色、桔黄色、 棕色等色斑出现。土粒周围滤纸有无破损变薄现象。 棕色等色斑出现。土粒周围滤纸有无破损变薄现象。 用解剖针从带有色斑处挑取少许滤纸至载玻片上,涂 用解剖针从带有色斑处挑取少许滤纸至载玻片上, 固定,染色,在油镜下观察并绘图。 片,固定,染色,在油镜下观察并绘图。

液体培养基中纤维素分解菌的富集
? 将配制好的纤维素液体培养基,分装于100ml的三 角瓶中,每瓶装 30ml, 灭菌冷却后,用无菌镊 子夹取滤纸条放入培养液,再接种少许土壤,于 28--30度下培养 约7天,观察培养液中滤纸条有 无被分解而透空的地方,如果滤纸有空洞或滤纸 边缘有破碎现象,表示厌氧纤维分解细菌已大量 繁殖,否则应继续培养。 ? 4。镜检:用接种环从发酵液滤纸破碎处取菌 液一环至载玻片上,涂片,固定,染色,在油镜 下观察并绘图。 ? 第六排做液体培养基中的纤维素分解菌富集。 第六排做液体培养基中的纤维素分解菌富集。

B 纤维素 厌氧分解实验
3.目检:取出试管,观察培养液中滤纸条有 .目检:取出试管, 无被分解而透空的地方, 无被分解而透空的地方,如果滤纸有空洞或滤纸 边缘有破碎现象, 边缘有破碎现象,表示厌氧纤维分解细菌已大量 繁殖,否则应继续培养。 繁殖,否则应继续培养。 4。镜检:用接种环从发酵液滤纸破碎处取菌 。镜检: 液一环至载玻片上,涂片,固定,染色, 液一环至载玻片上,涂片,固定,染色,在油镜 下观察并绘图。 下观察并绘图。

(第7、8排) 、 排

富集纤维素分解菌的培养基2 富集纤维素分解菌的培养基2
? 1L水中含: 羧甲基纤维素钠(CMC-Na) 20 ; Na2HPO4 2.5 ; KH2PO4 1.5 ; 蛋白胨2.5 ; pH 7.0—7.5 第七排做固体培养基;第八排做液体培养基。 第七排做固体培养基;第八排做液体培养基。 注意:在无菌培养基内直接接如土粒即可, 注意:在无菌培养基内直接接如土粒即可,不需要加滤纸 ,因为已经含 羧甲基纤维素钠

注意事项
? 第2、4 、6、8排做液体培养基,每人限量1 个; ? 做固体平板富集菌种的,每人 2个平板; ? 慎重选取采土地点,确保土样中相应的微生 物含量较高,易于分离。要采集多种类型的 土样,并在标签和报告中注明土样来源。

? 全班同学务必采取多种土样来源,确保实 全班同学务必采取多种土样来源, 验结果显著! 验结果显著! ? 必须确保所取土样的质量:一是要采土来 必须确保所取土样的质量: 源多样性,如森林土,草地土,沼泽土, 源多样性,如森林土,草地土,沼泽土, 菜园土等; 以下的。 菜园土等;另外取表土层 5--10cm以下的。 以下的 数量满足接种就可以了。 数量满足接种就可以了。周二下午或者周 三早上上课前取土为好。 三早上上课前取土为好。


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