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实验六_土壤微生物的分离与计数_图文

实验六
土壤微生物的分离与计数
——涂布平板法 ——涂布平板法

一、实验目的
1、学习利用平板分离法从土壤分离微生物的基 、 本操作。 本操作。

2、掌握微生物平板计数的方法。 、掌握微生物平板计数的方法。

二、实验原理
土壤是微生物生活的大本营
根据某微生物的生长条件(营养,酸碱度,温 根据某微生物的生长条件(营养,酸碱度, 氧气等)而供给它适宜的培养条件, 度,氧气等)而供给它适宜的培养条件,或加入某种抑制 剂造成只利于该菌生长,而抑制其他菌生长; 剂造成只利于该菌生长,而抑制其他菌生长;用稀释涂布 平板法获得单菌落(并不能绝对保证是纯培养, 平板法获得单菌落(并不能绝对保证是纯培养,需要结合 观察其菌落特征、个体特征,进一步分离纯化)。 观察其菌落特征、个体特征,进一步分离纯化)。

稀释到适量浓度

倾注或涂布平板

培养

菌落计数

将待测样品适当稀释, 将待测样品适当稀释,使其中的微生物充分分散成单个细 取一定量的稀释液接种到培养基上, 胞,取一定量的稀释液接种到培养基上,经过繁殖每个单细菌 长成肉眼可见的菌落,即一个菌落代表样品中的一个单细胞。 长成肉眼可见的菌落,即一个菌落代表样品中的一个单细胞。 根据菌落数,稀释倍数,接种量可推算出原样品中的含菌数。 根据菌落数,稀释倍数,接种量可推算出原样品中的含菌数。

样品充分混匀; 样品充分混匀;

同一稀释度三个以上重复, 同一稀释度三个以上重复, 取平均值; 取平均值; 每个平板上的菌落数目合适, 每个平板上的菌落数目合适, 便于准确计数。 便于准确计数。

一般用菌落形成单位( 一般用菌落形成单位(colony forming units, CFU)来表示 , ) 原样品中的细胞数。 原样品中的细胞数。

三、实验材料
1、土样:选择某一生境土壤,去表层土,挖5~20cm深度 土样:选择某一生境土壤,去表层土, 5~20cm深度 的土壤数10g 装入已灭菌的牛皮纸袋。 10g, 的土壤数10g,装入已灭菌的牛皮纸袋。 2、培养基: 培养基: 牛肉膏蛋白胨培养基: 牛肉膏蛋白胨培养基:细菌 淀粉琼脂培养基(高氏1 ):放线菌 放线菌——每300ml培 淀粉琼脂培养基(高氏1号):放线菌——每300ml培 养基加入1ml3% 1ml3%的重铬酸钾抑制细菌和霉菌生长 养基加入1ml3%的重铬酸钾抑制细菌和霉菌生长 马丁氏培养基:真菌——孟加拉红抑制细菌和放线菌 马丁氏培养基:真菌——孟加拉红抑制细菌和放线菌

四、实验方法
1、倒平板 、 2、土壤菌悬液的制备 、 10g土样 + 90ml无菌水 土样 振荡20min 无菌水 振荡 3、梯度稀释 、 土壤菌悬液移入含9ml无菌水的试管中 取1ml土壤菌悬液移入含9ml无菌水的试管中,吹吸均匀, 土壤菌悬液移入含9ml无菌水的试管中,吹吸均匀, 为稀释10倍的样品,依次进行梯度稀释10 10倍的样品 为稀释10倍的样品,依次进行梯度稀释 -1~10-6

4、涂布:取0.1ml适当浓度的稀释液涂布于相应平板,每个 涂布: 0.1ml适当浓度的稀释液涂布于相应平板, 适当浓度的稀释液涂布于相应平板 稀释度做3个平行,每种菌需要做9块平板, 稀释度做3个平行,每种菌需要做9块平板,及时 标记,涂布后静置10分钟。 标记,涂布后静置10分钟。 静置10分钟 分离对象 细菌 放线菌 稀释度 10-7 、10-8、 10-9 10-3 、10-4、 10-5 分离方法 0.1ml菌悬液, 0.1ml菌悬液,涂布法分 菌悬液 离 0.1ml菌悬液 菌悬液, 0.1ml菌悬液,涂布法分 离 0.1ml菌悬液, 0.1ml菌悬液,涂布法分 菌悬液 离

霉菌

10-2、 10-3、 10-4

5、培养 、 将细菌、真菌、放线菌培养基倒置于30℃培养 将细菌、真菌、放线菌培养基倒置于 ℃ 箱中培养3 5d。 箱中培养3-5d。 6、计数 、 7、挑菌(纯化) 、挑菌(纯化) 将培养后长出的单菌落数量、形态、 将培养后长出的单菌落数量、形态、培养特征 进行观察,分别挑取单菌落于相应平板上划线、分离, 进行观察,分别挑取单菌落于相应平板上划线、分离, 培养,检查菌落是否一致、单纯( 培养,检查菌落是否一致、单纯(也可以用显微镜涂片 染色镜检是否是单一的微生物), ),如有杂菌需进一步纯 染色镜检是否是单一的微生物),如有杂菌需进一步纯 分离。 化、分离。

每毫升菌落形成单位=同一稀释度的三次重复平均数× 每毫升菌落形成单位=同一稀释度的三次重复平均数×稀释倍数 ×5

五、思考题
1、记录利用稀释涂布法对土壤样品进行活菌计数的结果。 记录利用稀释涂布法对土壤样品进行活菌计数的结果。
重复 稀释度 细菌 稀释度 放线菌 稀释度 真菌 1010-2 1010-3 1010-4 1 2 1010-7 3 平 均 1 2 1010-8 3 平 均 1 2 1010-9 3 平 均

平板 中的 CFU 数

平板计数
1010-3 1010-4 1010-5

每克含菌样品中细菌/放线菌/ 每克含菌样品中细菌/放线菌/真菌 活细胞数= 活细胞数= 同一稀释度平板上菌落平均数× 10×稀释倍数) (同一稀释度平板上菌落平均数× 10×稀释倍数) 含菌样品克数


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