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环糊精葡萄糖基转移酶生产α-熊果苷的反应条件优化及分子改造_论文

D O I : 1 0 . 1 3 9 9 5 / j . c n k i . 1   1 —1 8 0 2 / t s . 2 0 1 7 0 6 0 0 8   环糊 精 葡 萄 糖基 转 移 酶 生产 t i t " 熊 果 苷 的反 应 条 件 优 化及 分 子 改造  张文 蕾  。 , 宿 玲 恰  。 ,陶 秀 梅  , 吴 敬  1 ( 江南 大 学 , 食 品科 学 与 技术 国 家 重 点 实 验 室 , 江苏 无锡 , 2 1 4 1 2 2 )   2 ( 江南大学 , 生 物 工 程 学 院工 业 生物 技术 教 育 部 重 点 实 验 室 , 江苏 无锡 , 2 1 4 1 2 2 )   摘  要  选 择 4种 环 糊 精 葡 萄 糖 基 转 移 酶 ( C G T a s e ) 分别 为来源 于 P a e n i b a c i l l u s   m a c e r a n s的 0 【 一C G T a s e , B a c i l l u s   c i r c u l a n s   2 5   1的 B — C G T a s e , B a c i l l u s   s t e a r o t h e r m o p h i l u s   N O 2 和A n a e r o b r a n c a   g o t t s c h a l k i i 的a l p — C G T a s e , 研 究不同种   类的 C G T a s e生 产 O t 一 熊 果 苷 的情 况 。 以麦 芽 糊 精 为供 体 , 对苯二酚 ( H y d r o q u i n o n e   I a Q) 为受体 , 通过 C G T a s e和 淀   粉 葡 萄 糖 苷 酶 的 两步 酶 法反 应 催 化 合 成  一 熊果 苷 。 分 别 优 化 不 同类 型 的 酶合 成 O t 一 熊果苷 的条件 , 发现A n a e r o ?   b r a n c a   g o t t s c h a l k i i 来源 的 C G T a s e 在 如 下最 优 条 件 下 获 得 的 I a Q摩 尔 转化 率最高 , 为2 5 %: 以葡 萄 糖 当量 ( D E )   值为 9 % 一1 3 % 的5 0   g / L麦 芽 糊 精 作 为 供 体 , 8   g / L   HQ为 受体 , 缓冲液 p H   6 . 0 , 在4 O℃ 下 反 应 2 4   h , 沸 水 浴 灭  活后 , 加 入 糖 化 酶处 理 , 高 效 液 相 色 谱 检 测 产 物 。 为 了进 一 步 提 高 C G T a s e对 底 物 的 转 化 率 , 利 用 定 点 突 变 技 术  对A . g o t t s c h a l k i i   C G T a s e进 行 分 子 改 造 , 得 到 1个 突 变 体 Y 2 9 9 A, 在 最优 的反 应条件 下 突变体 的 H Q 转化 率 可   达 4 0 %。   关 键 词  环 糊 精 葡 萄 糖 基 转 移 酶 ;  一 熊果 苷 ; 酶催化 ; 定 点 突 变  熊果 苷 ( a r b u t i n ) 又 称熊果 素 , 存在 于一 种来 源 于  杜 鹃花科 熊果 属 的灌木 植物— — 熊果 叶 子细胞 中 , 是  一 成仅 一 熊果 苷 , HQ转 化 率 为 7 . 7 7 %, 产量 为 3 . 1 7   L   。S I N D H U   MA T H E W 利用来源于 T h e r mo a n a e r —   种 新兴 的无 刺激 、 无过敏 、 配伍 性 强 的天 然 美 白活  o b a c t e r   s p .的 C G T酶 生 物催 化合 成  一 熊果 苷 , 对 H Q   转 化率 最 高可达 3 0 %  。   环糊 精 葡 萄 糖 基 转 移 酶 ( c y c l o d e x t r i n g l y c o s y l —   t r a n s f e r , C G T酶 , E C 2 .4 .1 .1 9 )是 一种 胞外 酶 , 同 时  性 物质 , 广 泛应 用 于化妆 品行 业  。依 据结 构 不 同  可将 熊果苷 分 为 O t 型 和 B型 , O t - 熊果 苷 是 1 3 一 熊 果 苷  的差 向异构 体 , 并 且 其美 白效果 是 B - 熊果苷 1 0倍 以  上, 从 安全 性上 考虑 , O t . 熊果 苷 比 B 一 熊果 苷 更 具 有 较  高 的安 全 性  。鉴 于 此 , 国 内 外 许 多 家 化 妆 品 公 司  也 是一 种多 功 能 酶 , 能 催 化 3种转 糖 基 反 应 ( 歧化 、   环 化和 耦 合 反 应 )和 水 解 反 应  。C G T a s e s共 有 5   个 结构 域 , 其 中 B域含 有 一 个 明显 的底 物 结 合 凹槽 ,   通过 凹槽 周 围氨基 酸 与底 物结 合  。在底 物 结 合 凹  槽 中存 在 9个 亚位 点 , 标 记 为 +2一一7 , 每 个 亚 位 点  能结 合一 个 葡 萄 糖 残 基  。对 C G T a s e关 键 氨 基 酸  的定 点突 变往 往 会 造 成 酶 活力 的变 化 ¨  。 +1 , +2   位点 是催 化转 糖基 的关 键位 点 , 对其 附 近 的氨 基 酸进  行突 变能 够有 效 的改 变 C G T a s e的水 解 和 歧 化 活 力 ,   而在其 他 位 点 进 行 突 变 则 效 应 不 明显 。 +1亚 位 点  附近 涉及 的氨 基酸 残基 : L e u 1 9 4、 A l a

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