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适于双向电泳分析的番茄叶片总蛋白提取方法的优化


浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis 19 (2) :71~74 ,2007

适于双向电泳分析的番茄叶片总蛋白提取方法的优化
徐幼平1 ,徐秋芳2 ,蔡新忠2 , 3
treatment.

( 1 浙江大学 分析测试中心 ,浙江 杭州 310029 ; 2 浙江大学 生物技术研

究所 ,植物保护系 ,浙江 杭州 310029)

摘   : 比较了三氯乙酸 ( TCA) 、 要 酚和十二烷基硫酸钠 ( SDS) 3 种提取方法在所获番茄叶片总蛋白产量及其在
SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率等方面的区别 ,并对 3 种蛋白溶解液以及超声处理在蛋白质溶解中的作用进

行了分析探讨 。结果表明 ,TCA 提取法最佳 ,该方法提取番茄叶片总蛋白的得率最高 、 所获蛋白在 SDS 聚丙 烯酰胺凝胶电泳中形成条带数目最多 ,最清晰 ; 酚法次之 ;SDS 法最差 。由离液剂和去污剂组成的蛋白溶解液 复溶蛋白沉淀所获蛋白产量显著高于 Tris2NaCl 溶解液 。还原剂和两性电解质以及超声处理显著增进蛋白质 泳分辨率的番茄叶片总蛋白样品 ,该方法适用于双向电泳分析等下游操作 。 关键词 : 番茄 ; 蛋白 ; 双向电泳 ; 三氯乙酸 ; 两性电解质 ; 超声处理 中图分类号 :Q503         文献标识码 :A
CHAPS ,2 %SB3210 ,65 mmol/ L DTT ,0. 2 %两性电解质) 溶解 ,结合超声助溶的方法体系可以获得高得率和高电

的溶解 ,提高蛋白产量 。采用 TCA 提取法获得蛋白沉淀 , 再以溶解液 Ⅱ( 7 mol/ L 尿素 ,2 mol/ L 硫尿 ,2 %

文章编号 :1004 - 1524 (2007) 02 - 0071 - 04

tection , Zhejiang University , Hangzhou 310029 , China)

tion was analyzed. It was found that the TCA method was the best one resulting in the highest total protein yield , the most one. The solubilization buffer consisting of chaotropes and detergents resolubilized protein pellet much better and thus result 2 ing in much higher protein yield compared with the one consisting of Tris NaCl. Addition of a reducing agent and an am 2 2 isolation approach , resulting in high protein yield and high resolution in SDS PAGE , and suitable for the downstream ma2 2 nipulation such as two2D gel electrophoresis analysis , was established , which consists of the protein extraction by the TCA 2 Key words :tomato ; protein ;two2D gel electrophoresis ; trichloroacetic acid ; ampholyte ; supersonic treatment protein bands and the best resolution in SDS PAGE , the phenol method was less good , while the SDS method was the worst 2

pholyte , and supersonic treatment significantly enhanced protein solubilization. Taken together , a tomato leaf total protein

收稿日期 :2006 - 08 - 11 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30200179) 作者简介 : 徐幼平 (1970 - ) ,女 ,浙江诸暨人 ,博士 ,副研究员 ,主要从事植物分子生物学研究 。E2mail :ypxu @zju. edu. cn 3 通讯作者 ,蔡新忠 ,E2mail :xzhcai @zju. edu. cn ;Tel :0571 - 86971964

Abstract :In this study , three protein extraction methods based on trichloroacetic acid ( TCA) , phenol and sodium dodecyl sulfate ( SDS) respectively , were compared in total protein yield from tomato leaf and the protein resolution in SDSpoly2 2 acrylamide gel electrophoresis ( PAGE) . Effect of three solubilization buffers and supersonic treatment on protein solubiliza 2

Optimization of total protein extraction from tomato leaves for t wo2D gel elec2 trophoresis analysis
XU Y 2ping1 ,XU Qiu2fang2 ,CAI Xin2zhong2 , 3 ou
( 1 Center of Analysis and Measurement Hangzhou 310029 , China ; 2 Institute of Biotechnology , and Department of Plant Pro2

based method , followed by re2solubilization of the protein pellets with the solubilization buffer consisting of 7 mol/ L urea ,2 mol/ L thiourea ,2 %CHAPS ,2 % SB3210 ,65 mmol/ L DTT ,0. 2 % ampholyte (pH 3 - 10) , in combination with supersonic

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浙江农业学报   19 卷 (2007) 第

   随着越来越多生物基因组全序列测定工作 的完成 “后基因组” , 时代已悄然而至 。蛋白质组 学是 “后基因组” 时代的主要研究领域之一 。蛋 白质是生物功能的主要执行者和体现者 ,通过蛋 白质组的分析可以检测生命活动变化过程中蛋 白质表达量及翻译后修饰等的变化 ,从而阐明生 物功能产生的机制 。近年来植物蛋白质组学的 研究有了长足的发展 , 被广泛应用于植物发育 、 环境信号应答等各方面的研究 [1 ] 。蛋白质的提 取是进行蛋白质组学研究的前提和基础 。与悬 浮细胞相比 ,植物组织样品由于富含色素 、 、 酚 脂 类、 多糖等干扰物质 , 因而较难获取提纯的蛋白 质 。现有的用于双向电泳的总蛋白提取方法主 要包括三氯乙酸 ( trichloroacetic acid , TCA) 法 , 酚 法和十二烷基硫酸钠 ( SDS) 法等 [1 ] 。 有关番茄蛋白质组的研究报道较少 。本研 究就 TCA ,酚和 SDS 等 3 种方法对提取番茄叶片 总蛋白产量的影响 ,及其在 SDS 聚丙烯酰胺凝胶 电泳分辨率等方面进行了比较分析 ,并就还原剂 和两性电解质以及超声处理对蛋白质溶解性的 促进作用进行了分析 ,以期探索出一种适合番茄 蛋白质组分析的提取方法 。

淀。
SDS 法 。研钵用液氮预冷 , 放入 1 g 左右番

茄叶片 ,在液氮中研磨成粉末 , 加入 5 ml 提取液 油 ,0. 03 mol/ L 二硫苏糖醇 ( DTT) ] , 继续研磨 30
[0. 175 mol/ L Tris2HCl ,pH 8. 8 ,5 % SDS ,15 %甘

s 后 ,转入 50 ml 离心管 。立即加入 4 倍体积的 5 000 × ,4 ℃ g 离心 15 min ,弃上清 。以 15~20 ml

- 20 ℃丙 酮 , 涡 旋 混 匀 , - 20 ℃沉 淀 至 少 1 h 。

80 %冷丙酮洗沉淀 ,涡旋 、 枪混打碎沉淀 ,洗沉淀

至无色 。离心后弃上清 。冷冻干燥沉淀 。

酚法 。研钵用液氮预冷 ,放入 1 g 左右番茄 叶片 ,在液氮中研磨成粉末 ,加入 2. 5 ml Tris (pH
8. 8) 饱和酚和 2. 5 ml 提取液 ( 0. 1 mol/ L Tris2 HCl ,pH 8. 8 ,10 mmol/ L EDTA ,0. 4 %巯基乙醇 , 0. 9 mol/ L 蔗糖) ,继续研磨 30 s 后转入 50 ml 离

心管 , 混匀 ,4 ℃放置 30 min 。5000 ×g ,4 ℃离心

10 min , 吸取上层酚相 , 剩余液体用 2. 5 ml Tris (pH 8. 8) 饱和酚和 2. 5 ml 提取液重新抽提 ,再次

吸取上层酚相 ,并合并前一次提取的酚相 。加入 液 ,涡旋混匀 , - 20 ℃放置至少 1 h ,20 000 ×g ,

5 倍体积的 - 20 ℃ 0. 1 mol/ L 醋酸铵的丙酮溶 含 4℃ 离心 20 min 。分别以 - 20 ℃含 0. 1 mol/ L 醋

1  材料与方法
1. 1   供试植物材料和试剂

酸铵的丙酮溶液 ,及 80 %丙酮分别洗沉淀两次 ,

再以 - 20 ℃ 70 %乙醇洗沉淀一次 。洗沉淀时充

分悬浮沉淀 , 每次洗沉淀均先于 - 20 ℃放置 15 冷冻干燥沉淀 。

采用以下 3 种方法提取番茄叶片的总蛋白 , 获取蛋白沉淀 。 TCA 法 。研钵用液氮预冷 , 放入约 0. 5 g 番 茄叶片 ,在液氮中充分研磨成细粉末后转入无菌 离心管 ,称取组织净重 。加入 - 20 ℃ 10 % ( W/ 含 V) TCA 和 0. 07 % (V/ V) 巯基乙醇的丙酮溶液 ( 每 0. 3 g 组织加 1 ml ) ,涡旋振荡后 - 20 ℃ 放置至少 2 h 。13 000 r/ min ,4 ℃ 离心 20 min 。弃上清 。加 入 1 ml 含 0. 07 %巯基乙醇的丙酮 , - 20 ℃ 放置 1
h ,同上离心 。重复洗沉淀至无色 。冷冻干燥沉

供蛋白提取研究的植物材料为番茄叶片 ,品 种为 Moneymaker 。 硫脲 ( thiourea ) 和 SB3210 为 Sigma 产品 。两 性电解质 Bio2lyte 为 Bio2Rad 产品 。其余试剂来 自 Amresco 和上海生工生物工程公司 。 1. 2   总蛋白提取方法

min ,然后 12 000 r/ min ,4 ℃ 离心 10 min , 弃上清 。

1. 3   蛋白沉淀的溶解

分别称取 40 mg 蛋白质沉淀 , 以 1 ∶ ( mg ∶ 15

μ ) 加入蛋白溶解液复溶 ,涡旋混匀后 ,一份不超 l 声 ,另一份进行 5 s × ( 置冰上超声 5 s 后静置 15
13 000 r/ min ,4 ℃ 离心 30 min , 取上清 , 用于蛋白

55 s , 连 续 15 次 ) 处 理 , 放 摇 床 室 温 振 荡 1 h ,

含量测定和电泳分析 。采用的蛋白溶解液如下 :

2 %CHAPS ,2 %SB3210 ,65 mmol/ L DTT , 0. 2 %两

性电解质 Bio2lyte (pH 3~10) 。
mol/ L NaCl 。

蛋白溶解液 Ⅰ: 7 mol/ L 尿素 ,2 mol/ L 硫脲 ( thiourea) ,2 %CHAPS ,2 % SB3210 。

蛋白溶解液 Ⅱ:7 mol/ L 尿素 ,2 mol/ L 硫脲 ,

蛋白 溶 解 液 Ⅲ: 0. 1 mol/ L Tris2HCl , 0. 05

徐幼平等 : 适于双向电泳分析的番茄叶片总蛋白提取方法的优化

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1. 4   总蛋白含量的测定

2  结果与分析

of extraction and solubilization ( mg? ) g
蛋白产量 TCA 法 溶解液 Ⅰ+ 超声处理 6. 86 ± 87 0. 溶解液 Ⅱ+ 超声处理 8. 83 ± 05 1. 溶解液 Ⅲ+ 超声处理 2. 73 ± 54 0. 仅用溶解液 Ⅱ,不作超声处理 4. 26 ± 94 0. 溶解和超声处理

采用 Bradford 法测定蛋白浓度 [2 ] 。 1. 5   聚丙烯酰胺凝胶电泳 制胶和电泳系统为 Bio2Rad MP3 及 Power2 Pac300 系统 。配置 12 %分离胶和 5 %浓缩胶 , 上 样量为 8 μ 。浓缩胶内电泳时设置电压为 80 V , l
1. 6   数据统计分析 2. 1   三种蛋白提取方法的比较

当溴酚蓝线到达分离胶时把电压提高到 120 V 。 当溴酚蓝线到达分离胶底部时停止电泳 ,进行考 马斯亮蓝染色 。染色和脱色按标准方法进行 [3 ] , 只是将脱色液中 30 %甲醇改为 10 %乙醇 。 各试验至少进行 3 次 ,最后结果以平均值 ± 标准误表示 。

注 : 最左边泳道为蛋白分子量标准 。蛋白样品上样量均为 8 μ 。不同蛋白样品显示的典型差异条带以箭头和星号表示 l

采用三种提取方法获取番茄叶片总蛋白产 率 ( 表 1) 。表 1 表明 ,无论以哪种蛋白溶解液溶 解 ,均以 TCA 法得率最高 , 酚法次之 , SDS 法最

品次之 ,SDS 法样品条带数量相对较少 , 分离度 相对较差 。如图 1 中箭头所示条带 , 在 TCA 法 所得样品中清晰可见 ,而在酚法和 SDS 法样品中 没有形成明显条带 ,或只形成微弱条带 。 2. 2   三种蛋白溶解液的比较 不同蛋白质溶解性质有显著差异 。比较不 含还原剂和两性电解质的尿素 — 硫脲缓冲液 ( 溶 ) 解液 Ⅰ ,含有还原剂和两性电解质的尿素 — 硫
表1  不同抽提和溶解方法所获蛋白产量 ( mg? - 1 ) g
- 1

差 。将相同体积蛋白溶解液上样进行 SDS 聚丙 烯酰胺凝胶电泳 ( SDS2PAGE) ,结果见图 1 。图谱 显示 ,3 种提取方法所获番茄叶片总蛋白在凝胶 电泳中显示的条带数目以及清晰度均有差异 。 TCA 法所得样品条带数量最多 , 最清晰 , 酚法样
Table 1   Protein yield of samples obtained by different methods
SDS 法

酚法

3. 41 ± 79 0. 5. 65 ± 77 0. 1. 81 ± 85 0. 2. 71 ± 65 0.

3. 72 ± 88 0. 7. 14 ± 92 0. 1. 95 ± 83 0. 2. 53 ± 71 0.

2. 3   超声处理对蛋白沉淀溶解性的影响

) 脲缓冲液 ( 溶解液 Ⅱ 和 Tris2NaCl 缓冲液 ( 溶解 ) 液 Ⅲ 等 3 种蛋白溶解液对总蛋白产率的影响 ( 表 1) 。发现 ,对于 3 种提取方法所获番茄叶片

总蛋白沉淀 ,均以尿素 — 硫脲缓冲液溶解得率最

高 ,Tris2NaCl 缓冲液溶解得率显著低于尿素 — 硫 ( 溶解液 Ⅰ Ⅱ 。在尿素 — ) 脲缓冲液 和 硫脲缓冲 液加入还原剂和两性电解质进一步提高蛋白溶 解得率 ,但在不同提取方法所获总蛋白沉淀的溶 获得沉淀的溶解中 , 得率提高幅度明显高于由
TCA 法提取获得沉淀的溶解 。

解中 ,得率提高的幅度不同 。对由酚法和 SDS 法

聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果 ,进一步证实以上蛋

白含量测定结果 , 而且发现 , 以不同蛋白质溶解

液溶解所得总蛋白的电泳条带数和带谱有差异 (图 1 ) 。尿素 — ) 硫脲缓冲液 ( 溶解液 Ⅰ和 Ⅱ 溶 解所得总蛋白的电泳条带数明显多于 Tris2NaCl 明这些缓冲液所能溶解的蛋白对象有差异 。

缓冲液 ,如图 1 中箭头所指条带 , 但并非尿素 — 硫脲缓冲液溶解所得总蛋白的所有条带浓度均 高于 Tris2HCl 缓冲液所得样品 ,有些条带 ,如图 1 中的浓度高于尿素 — 硫脲缓冲液所得样品 。说 为明确超声处理对蛋白沉淀溶解的可能作

中星号所示条带 , 在 Tris2NaCl 缓冲液所得样品

图1  不同提取方法和溶解液所得番茄叶片总蛋白的 SDS2PAGE 图谱比较 Fig. 1  Comparison of SDS PAGE patterns of total protein 2 samples obtained by different extraction methods and solubi2 lization buffers

对不同蛋白质溶解液溶解所得总蛋白进行

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浙江农业学报   19 卷 (2007) 第

用 ,本研究对不同提取方法所获番茄叶片总蛋白 沉淀 ,加入不同溶解液后 , 分别进行冰上超声处 理 。发现 ,无论以哪种提取方法所获番茄叶片总 蛋白沉淀 ,也无论以哪种蛋白溶解液溶解所得样 品 ,超声处理均显著增进蛋白沉淀的溶解 ( 表 1 显示溶解液 Ⅱ 的研究结果) 。对不同蛋白质样品 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果 ,进一步证实以 上蛋白含量测定结果 ( 图 2) 。这些结果说明 , 冰 上超声处理显著促进蛋白质的溶解 。

注 :最左边泳道为蛋白分子量标准。蛋白样品上样量均为 8 μ l

图2  超声处理对蛋白沉淀溶解性的影响 Fig. 2  Effect of the supersonic treatment on the solubility of protein precipitation

3  讨论
蛋白样品的提取和制备是进行蛋白质组学 分析的关键一环 。本研究比较分析了 TCA 法 、
SDS 法和酚法等 3 种提取番茄叶片总蛋白的方

法 ,发现 ,TCA 法蛋白产率最高 ,所获蛋白在凝胶 电泳中显示的条带数量最多 ,最清晰 。从操作步 骤上看 , TCA 法最简便 , 小量研究时 , 使用 2 ml 离心管和一般实验室都具备的台式冷冻离心机 即可进行 ,是一种相对较理想的方法 。酚法所提 蛋白的条带数量较多 ,但与 TCA 法比 ,其得率较 低 。SDS 法提取的蛋白的谱带较弥散 ,可能是因 为所提取的蛋白纯度不高 ,含杂质较多 。酚法和
SDS 法需利用 50 ml 离心管在大型超低温离心机

中完成 ,操作步骤较繁琐 。 要获得细胞内的总蛋白 ,除对细胞进行有效 的破碎外 , 利用变性剂 、 表面活性剂 、 两性电解 质、 还原剂等成分可以实现蛋白的有效溶解 。本

试验从下游的双向电泳分析的角度出发 , 选用 3 种溶解液进行了蛋白溶解对比分析 。研究发现 , 含有尿素 、 、 硫脲 CHAPS 和 SB3210 的溶解液的蛋 白得率远远高于只含 Tris2NaCl 的常规蛋白提取 缓冲液 ( 表 1 和图 1 ) 。这可能是因为高浓度尿 素和硫尿联用 , 强烈破坏蛋白分子间形成的氢 键 ,从而防止由氢键引起的蛋白质聚集及蛋白迁 移中的二级结构的形成 。去污剂和表面活性剂 CHAPS 和 SB3210 可以减少脂类污染 , 破坏蛋白 之间的疏水性互作 ,增加疏水性蛋白的溶解 。 参考文献 :
in proteome establishment [ J ] . J Chromatography B , 2005 , 815 : 109 - 123. binding [J ] . Anal Biochem , 1976 , 72 : 248 - 254. [3]   Sambrook ( 萨姆布鲁克)J ,Fritsch ( 弗里奇) EF ,Maniates ( 曼 ( 第二版) [M] . 北京 : 科学出版社 ,1995. 880 - 886.

本研究发现 ,加入还原剂和两性电解质显著 提高蛋白得率 ,这可能是因为有些蛋白质仅有变 性剂和表面活性剂存在的条件下仍不溶解 ,加入 低浓度的两性电解质 ,通过电荷与电荷之间的相 互作用可以减少蛋白聚合 , 从而增强其溶解性 。 另外 ,还原剂能帮助打开蛋白质的二硫键 , 使待 分析的蛋白质分离成为单一的蛋白亚基 ,使变性 的蛋白质展开更完全 ,溶解更彻底 。 另外 ,超声处理强烈促进蛋白溶解 ( 表 1 和 图 2) 。不过 , 必须注意超声处理的强度和持续 时间 ,强度过小持续时间短 , 达不到充分助溶的 目的 ; 而强度过大持续时间过长 , 则会导致蛋白 质降解 。为防止蛋白质降解 , 一般应在冰上进 行 ,而且两次处理之间必须有合适的低温静置时 间 ,防止超声处理产热过高而导致蛋白质降解 。 总之 ,采用 TCA 提取法获得蛋白沉淀 , 再以 溶解液 Ⅱ 溶解 ,结合超声助溶的方法体系可以获 得高得率和高电泳分辨率的总蛋白样品 ,适合用 于双向电泳分析等下游操作 。

[1 ]   Agrawal GK, Y onekura M , Iwahashi Y, et al . System , trends and perspectives of proteomics in dicot plants Part I : Technologies

[2]   Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein

尼阿蒂斯) T. ( 金冬雁 ,黎孟枫等译) . 分子克隆实验指南

( 责任编辑   陈华平)


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