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H9N2亚型禽流感病毒原位杂交检测方法的建立


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一 中 量堕兰塑 0 年7 第2卷 4 C   s Jy0  o2 N.    25 月 5  第 期 h . 以 “ u 0 V15 。  0 i, l 5 .  4 2
H9 N2亚 型 禽 流 感病 毒 原 位 杂 交检 测 方 法 的建 立 

3  7 1


张 万 坡  程 国 富 卜? 长 勤  李德 学  宋念 华  毕 丁仁  胡 薛英  胡 思 顺 ?胡 智 斌z (. ? 谷 。 。 。 。 , 。   1 华中农业大学 
动 物 医 学 院 。 北 武 汉 4 0 7  ̄.湖 北 省 动 物 疫 病 诊 断 中 心 , 北 武 汉 4 0 6 ) 湖 30 02 湖 3 0 4  摘 要 : 据 已知 禽 流 感 病 毒 ( inif e z  iu , V) 蛋 白 ( 根 Ava  nl navrs AI 核 u NP) 因 序 列 . 取 其 中保 守 区 域 设 计 出 1时 引 物 。 基 选  
以 RT— C 方 法 扩 增 出 5 3b 的 NP基 因 片 段 . 用 地 高 辛 标 记 制 备 探 针 。M I K 细 胞 人 工 感 染 H9 P R 4  p 采 X; N2亚 型 禽 流 感 

病毒 后 ? 同时 间取 样制 备 细胞 涂 片 . 行原 位 杂 交 . 究 了禽流 感 病毒 时 MD 不 进 研 CK 细 胞 的感 染 。 讨 了原 位 杂 交的 条  探 件 及其 应 用于检 测 AI 感 染的 可行性 。 果显 示 . 染 2  V 结 感 4h后 , 原位 杂 交可检 测 出细胞 内的病 毒 RNA. 且 杂 交信 号  并 的 强度 与感 染 时间 的长短 有 关 。 究表 明 。 研 原位 杂 交检 测禽 流 感病毒 , 不但 能很 好地 表现 病 毒和 细 胞的位 置 关 系 。 而且  具 有较好 的 特异 性 和灵敏 性 . 为禽 流感病 毒 的组 织原 位 杂 交检 测 奠定 了实验基 础 。  
关 键 词 : 住 杂 交 ; 流 感 病 毒 ; D K 细 胞  原 禽 M C
中 图分类 号 :826  ¥ 5 .5 文献标 识 码 :   A 文 章 编 号 :0 54 4 (0 5 0 —3 1O  1 0 — 5 5 2 0 ) 40 7 一 3

禽 流 行 性 感 冒 ( 称 禽 流 感 , inif e z 。 ) 由 A 简 Ava  nl n aAI 是 u   型 流 感 病 毒 引 起 的 一 种 禽 类 的 感 染 和 / 疾 病 综 合 征 。 致 病  或 高

14 2 RT— C 扩 增 NP 基 因 片 段  按 UNl 1 ..  P R Q一0柱 式 总 

RNA 抽 提 试 剂盒 说 明 . 提 禽 流感 病 毒 RNA. 用 一 步 法  抽 采
R P T— CR 进 行 扩 增 。 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 后 , UNI l 按 Q—O柱  式 D NA 胶 回 收 试 剂 盒 说 明 回 收 DNA 片 段 。  
14 3 地 高 辛 标 记 NP基 因 片 段   取 回 收 获 得 的 D ..  NA 片 

力 禽流 感 病 毒可 以导致 鸡 群 的 大批 死 亡 , 毒 力 毒株 则 主 要  低
侵 害 泌 尿 生 殖 道 . 致 鸡 群 的 免 疫 力 降 低 , 淘 率 增 加 , 蛋  导 死 产 量 下 降 。 养 鸡 业 造 成 惨 重 的 损 失 _ J 禽 流 感 已 被 国 际 兽 疫  给 l。 。 局 定 为 A 类 传 染 病 . 被 列 入 国 际 生 物 武 器 公 约 动 物 类 传 染  并 病 名 单  。 禽 流 感 病 毒 不 仅 感 染 禽 类 。 且 可 以 感 染 人 。 致  而 高 病 力 禽 流 感 病 毒 还 可 以致 人 死 亡 l 。 国 白 1 9   我 9 4年 在 广 东 省  首 次 分 离 到 H9 N2亚 型 禽 流 感 病 毒 以 来 . 国 各 地 均 有 禽 流  全 感 发 生 的 报 道  。   近 年 来 . 位 杂 交 已 被 应 用 于 检 测 Hl 、 V、 M D 、 原 V HP F V  P RRS S V、 VDV 等 许 多 病 毒 D NA 和 RNA. 得 了 满 意 效  取 果 。 。 对 禽 流 感 的 检 测 . 前 已 经 建 立 了 许 多 方 法 . 病 原  。 ’   目 如 分 离 、 凝 和 血 凝 抑 制 试 验 、 扩 、  S 等 . 年 来 还 出 现  血 琼 El A I 近 了 NAS A 等 分 子 诊 断 技 术 , 是 对 禽 流 感 病 毒 的 细 胞 和 组  B 但 织 原 位 检 测 的 报 道 并 不 多 见 【 】 研 究 采 用 地 高 辛 标 记 的    l 。本 e DNA 探 针 . 位 检 测 培 养 细 胞 中 的 禽 流 感 病 毒 R 原 NA. 在  旨

段 . 泳估 计 含量 . 试 剂盒 说 明进行 标 记 。 电 按   14 4 探 针 标 记 效 率 与 灵 敏 度 测 定  将 对 照 DNA 和 标 记  .. 好 的 探 针 分 别 按 试 剂 盒 说 明 进 行 稀 释 后 . 样 于 硝 酸 纤 维 膜  点 上 . 后 按试 剂盒 说 明进 行显 色 。 然   14 5 探 针 特 异 性 鉴 定  按 UNI l .. Q—O柱 式 总 RNA 抽 提 试 

剂盒说 明 , 提 禽流 感病 毒 H9 抽 N2亚 型和 H5 Nl亚 型 、 染性  传 法氏囊 病 病毒 、 传染性 支 气管 炎病 毒 、 城疫 病毒 、 DS 7 新 E 一 6病 
毒 RNA, 取 1 L点 样 于 处 理 过 的 硝 酸 纤 维 膜 上 . 然 干燥   各   自
后 . 8 ’ 烤 2h. 后 将 膜 放 人 预 热 的 预 杂 交 液 中 . O( 置 O(烘   然 4 、  

预 杂 交 3  n 0mi 。预 杂 交 结 束 后 . 去 预 杂 交 液 . 入 新 的 预 杂  倒 加 交 液 . 在 其 中 加 入 探 针 . 探 针 浓 度 为 2   g 1. O(杂 交 4 并 使 Ot / 4 、  ̄    

h以上 。杂 交结 束后 . 别用 含 o 1 S S的 2 S 和 0 5 分 .  D ×S C .  ×S C 在 5 ’ 洗 2次 , 次 1  n 然 后 按 地 高辛 标 记 及  S o(各 每 5mi.
检测 试 剂盒说 明 进行 显 色 。   15 细 胞 涂 片 的 制 备  .

为禽 流感 病毒 致病 机理 和 其他 研究 提供 资料 。  

1 材 料 与 方 法   
1 1 病 毒  禽 流 感 病 毒 湖 北 分 离 株 . N2亚 型 . 华 中 农  . H9 由

15 1 细 胞培 养 与病毒 感 染  MD . .  CK 细胞 培养 基 为含 l  o
胎 牛 血 清 和 1 0U 青 、 霉 素 的 DMEM 培 养 基 . 胞 维 持 液  0  链 细 为 含 0 0   胰 酶 的 DMEM 培 养 基 . 胞 悬 浮 液 为 含 2 胎 牛  .5 细  

业 大学 动物 医学 院微 生物 研究 室提 供…] 。  
12 细 胞 . 13 试剂 . M D K 细 胞 . 白中 国 典 型 培 养 物 保 藏 中 心 。 C 购   地 高 辛 标 记 及 检 测 试 剂 盒 . 白 Ro h 购 c e公 司 ;   U—

血 清 的 DMEM 培 养 基 。取 长 至 7  单 层 的细 胞 . 去 培 养  o 吸 基 . 用 维 持 液 稀 释 为不 同浓 度 (  2 、 血凝 单 位/   的  将 2 、  2 ml) 禽流感 病 毒 1ml接 种 于单层 细胞 上 . 于 3 ( 、 O!   , 置 7 、C 培养 箱  中. 吸附 1h后取 出 . 去病 毒 液 .   吸 用无 钙 、 离子 的 P S冲洗  镁 B
1次 . 入 维 持 液 . 于 3 、c(! 养 箱 中 培 养 。 时 设 置 不  加 置 7(、 ) 培 同 接 毒 的空 白对 照 。  

Nl 1 Q一 0柱 式 总 RNA 抽 提 试 剂盒 和 DNA 胶 回收 试 剂 盒 , 购 
自 上 海 生 工 生 物 工 程 公 司 ; 步 法 R P R 试 剂 盒 . 白 宝  一 T— C 购 生物 工 程有 限公 司 。  
14 核 酸 探 针 的 制 备  .

14 1 引 物 设 计 合 成 . . 


根 据 禽 流 感 病 毒 NP 基 因 序 列 . 取  选

15 2 细 胞 收 集 与 涂 片 分 别 于 接 毒 后 1 、 4 3  . .    2 2 、6h取 材 .   用 胰 酶 消 化 收 集 细 胞 .  0  / n离 心 后 弃 上 清 . 入 细 胞  20 0 rmi 加

段保 守 区域 . 设计 出 1对引 物 :  
P1 5 一 : AG AGCTCT A【 TGCGT一   :   A【A   3

悬 浮液 , 悬 浮细胞 滴 加在 经 多聚赖 氨酸 处理 过 的载玻 片 上 . 将  
置 于 3 、C 培 养 箱 中 1h使 细 胞 贴 壁 。 7(、 O:    

P2 5 一 : :  C【ATC【ATACCAGTTGAC一   : 3

理论 跨 幅 为 5 3b . 4  p 由上海 博亚 公 司合 成 。  
收 稿 日 期 : 0 4 0  1 2 0  30 

15 3 细 胞接 毒 后 病毒 检 测  分别 取 细胞 维 持 液和 细 胞 冻  .. 
融 物 进 行 血 凝 试 验 和 血 凝 抑 制 试 验 。取 接 毒 细 胞 和 正 常 细 胞 

基 金 项 目 : 北 省 科 技 攻 关 项 L 2 0 AA2 2 0 ) 湖 |(0 4 o B 4 
作 者 简 介 : 万 坡 ( 7 一) 男 . l 究 牛 。 张 1 4 . 顾 : 9 研   *通 讯 作 者 

冻 融物 抽 提 RNA. 进行 R P R. 物 通 过 琼 脂 糖凝 胶 电泳  T— C 产
检测。  
1 6 原 位 杂 交  .

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32 7 
l6 l 细胞 的 固定 ? ? 

中 国 兽 医 学 报 20 年 7   第 2 卷 第 4 05 月 5 期 C i ,V t c Jl 2 0 Vo 2 N .  hn. e S i uy 05       1 5 o4 .
将 细 胞 涂 片 置 于 4 多 聚 甲 醛 中 , 温    室
50 n 。  g  

下 固 定 2h 移 入 3 B  . xP S中 终 止 固 定 , l P S漂 洗 3次 . 用 X B   每 次 5mi 然 后 分 别 用 5   、 O 、 5 、 0   、 0   乙 醇    n. O 7  9  1 0 1 0 脱 水 5mi, 温 下 干 燥 。   n室  
A 

1 6 2 蛋 白酶 K 消化 .。

在细胞 涂 片上 覆盖 一层 1  / 的  0mg l
B 

蛋 白酶 K溶 液 ,7(消 化 1  n P S漂 洗 3次 . 次 3mi. 3 ’ 0mi , B 每   n 
然 后 放 入 4 多 聚 甲 醛 后 固 定 5ri , B 漂 洗 2次 , 次 5 %   nP S a 每  

mi. ×S C 漂洗 2次 , 次 5mi. 0  乙醇 脱 水 lmi 室  n2 S 每   n 10   n.
温干燥 。   I 6 3 DNA 酶 消 化  用 适 量 的 不 含 RNae的 DN s  。。  s ae 1覆 

图 2 地 高辛 标记 效率 与灵敏度 检测  A 为对照 1NA; ~ 6 ) 1 .分 别 为 
3 1,. 、. 3 0 0  g 1  7 、 0 1 0 0   . 1p / ; .纯 水 。1 标 记 探 针 . ~ 6 4  为 1 .分 

别为 1 、 、 、. ,. 、 . 3P /* ; .纯 水  0 3 1 0 3 0 1 0 0  g t  7 1

盖 细胞 .7(消化 3   n. 止 液终 止 消化 . 3 ’ 0mi 终 TE缓 冲液漂 洗 3  
次 . 次 2mi ,0   乙 醇 脱 水 lmi , 温 干 燥 。 每   n 10   n室   16 4 原 位 杂 交 .. 配 制 探 针 浓 度 为 lb /  t 1 杂 交 液 , 个  g  的 每 样 品 加 l  L, 交 膜 覆 盖 、 明 指 甲 油 封 边 后 , 于 原 位  O 杂 透 置 P CR 仪 上 . 5 ’ 性 探 针 5mi , 后 4   交 4h 以 上 . 9 (变   n然 2(杂   结  2 3 探 针 特 异 性 检 验  探 针 与 H9 . N2亚 型 和 H5 NI亚 型 禽 

流感 病 毒 R NA 杂交 结 果呈 阳性 . 新城 疫 病 毒 、 染性 支气  与 传 管 炎病 毒 、 染 性法 氏囊病 病 毒 、 蛋综 合症 病 毒 R 传 减 NA 以 及 
纯 水 杂 交 结 果 旱 阴 件 ( 3  冈 )
J   2   3   4   5   6   7   8  

束 后 , 前述 方 法洗 涤 、 色 。 时设 置不 加探 针 的空 白对 照 。 按 显 同  

2 结 果   
2 1 NP 基 因 片 段 的 R P R 扩 增  取 扩 增 产 物 进 行 琼 脂  。  T— C

糖 电泳 . 出现 5 3b 4  p扩 增 带 ( 1 . 预期 的扩增 片段大 小 一  图 )与
致。  

图 3 探 针 特异 性 检验结 果 1 纯 水 ; .新城 疫病 毒 R A; . 染    . 2 N 3传
性 支 气 管 炎 病 毒 RNA; . N2亚 型 禽 流 感 病 毒 RNA; , 4 Hg 5 

6 H N1亚 型 禽 流 感 病 毒 R A; .传 染 性 法 氏 囊 病 病 毒  .5 N 7
RNA; .减蛋综 合症 病毒 RNA 8  

2 4 细 胞 接 毒 后 病 毒 检 测 结 果  细 胞 接 毒 后 。 6h开 始 出 . 1   

现 病变 , 主要 表 现为 细胞 变圆 、 壁 能力 差 。取 细 胞维 持 液和  贴
5 3bp 4  

细 胞 冻 融 物 检 测无 血 凝 价 , 冻 融 物 进 行 R P 取 T— CR检 测 。 接  毒 细胞 扩 增 出预期 扩增 带 , 正常 细胞 没有 相 应的 扩增 带 。 而   2 5 禽漉 感 病 毒细 胞 内原位 杂 交  未接 毒 正 常细 胞 内 没有  . 

图 1 P   CR 产 物 电 泳 图  I NP 基 因 扩 增 片 段 ; .   0 0ma k r . M DI2 0   r e 

出现蓝 紫 色颗 粒 ( 4 , 交结 果 呈阴性 。 毒 1  图 A) 杂 接 6h的细 胞 

内 没 有 明 显 出现 蓝 紫 色 的 阳性 杂 交信 号 ( 4 。 毒 2    图 B) 接 4h
2 2 地 商 辛 标 记 效 率 与 灵 敏 度 检 测  相 对 应 的 对 照 DNA .    后 的 细 胞 内 开 始 出 现 蓝 紫 色 颗 粒 ( 4 . 着 感 染 时 间 的 延  图 C) 随

和标 记探 针 颜色 深 度相 似 。 明探针 标 记的 效率 符合 要求 , 表 对  照 DNA 每 微升 0 1P .  g显 色 成 功 , 针 灵 敏度 达 到 试剂 盒 要  探 求 ( 2 。和 对照 D 图 ) NA 对 比估计 . 记探 针 浓 度约 为 每微 升  标

长 . 交信 号 变 强 , 染 3   杂 感 6h的 细 胞 内 出现 深 蓝 色 杂交 信 号 
( 4 , 病 变 越 严 重 的 细 胞 蓝 紫 色 颗 粒 越 多 。 未 加 探 针 的  图 D) 且

对照 细胞 也 没有 出现 阳性 信号 ( 4 。 图 E) 

图 4 原 位杂 交结 果  
照 细 胞 

4 0   A.末感 染 的细 胞 ; .感染 后 I  0× l , 6 h的细胞 ; c.感 染后 2   4h的细 胞 ; D.感 染 后 3  6h的 细胞 ; .未加探 针 的对  E

性 信号 。试 验 发现 . 原位 杂交方 法 不仅 灵敏 性 比较 高 . 且能  而

3 讨 论   
在本 研 究 中 . 们 成 功地 将 原位 杂 交 方 法应 用 于 禽流 感  我 病 毒 的检测 . 得到 了比较 满意 的结 果 。在病 毒感 染早 期 . 毒  病
数 量不 多且 感 染性 不强 时 , 很难 用 常规 方 法检测 。 而应 用原 位 
杂交 检测 病 毒 R NA. 感 染 后 2  . 可 从 细 胞 内 检 测 到 阳  在 4h 即

很 好 地 保 持 细 胞 形 态 。 性 对 照 和 空 白 对 照 表 明 . 方 法 具 有  阴 该

良好 的特 异性 。 经过 严格 的 漂洗 . 杂交后 的 背景得 到 了很 好 的  控制。 将原 位 杂交 的灵 敏性 和 其他方 法进 行 比较 发现 . 方 法  该
的 灵 敏 性 远 远 高 于 血 清 学 方 法 . 然 比 RT— 【 方 法 灵 敏 性  虽 P: R 略 低 一 些 . 原 位 杂 交 方 法 没 有 经 过 核 酸 扩 增 . 核 酸 和 核 酸  但 是

之 问 直接 反应 . 降低 了在 扩增 过 程 中 容 易 出现 假 阳性 现 象 的 

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!  

医学报 25 月   0 年7 第2   期 C”  f u 25V15N. 0 5 第4   h .  Jy0  02 o  卷 i, l 0 .  4  

3  7 3

可 能  。应 用 核 酸 探 针 原 位 杂 交 检 测 病 毒 RNA, 可 以 很 好  还 地 保 留 病 毒 和 细 胞 的 位 置 关 系 . 对 于 病 毒 致 病 机 制 的 研 究  这
有 很重 要 的意 义 。   原 位 杂 交 的 关 键 步 骤 是 蛋 白 酶 K 消 化 的 程 度 和 探 针 的 

c n s wih Fi h I  o a e H V  ur  E 3 St v r on R. n s t   7  e e s   I   i u PCR  ombi e   t   s   o 1 c t   1 d —

igt ed r n  eida dii n t o ma tJ . n  h  oma tp r — n ts o  r n [ ] Am  itc n l o    d Boe h o 
lab a o y.   9 1 ( : 8  』 or t r 1 3. l 6) l . 9

E 3 K lu   r nnW id r Hek   h1J r e   al. m p rs n 8  a s He ma   e o n. ie Ku . u g nG l Co a io   e
0fi st  brdz to dr c  n  id rc  n st P  n— iu hy iia in. ie ta d n ie ti  iu CR  s weI a  l  

质 量 

。 蛋 白 酶 K 浓 度 过 高 或 消 化 时 问 过 长 , 仅 细 胞 形  不
[   9]

a ya d  ia a liain frte d tcin o  VE ] strmie s l mpic t   o h  eet   fHP  J . g  f o o  
H it e e Ce IBi1 1 9. l 8  9 . so h m  l   o . 99 1 l: 9 S 

态得不到保持 , 胞内的病毒核酸也可能丢失; 蛋白酶 K 细 而  
浓 度 过 低 或 消 化 时 间 过 短 , 胞 膜 的 通 透 性 太 差 , 针 和 抗 体  细 探

M a in   1 P ao M u p y r a   r t  a r h .M o a   A F r y h.Gr h m J rg   os t aa  
1es m .e a1   c l a i  o fota d 3 lha l .1o ai t z on f o   n  mou h ie s  vr s t ds a e iu  

难 以进 入 细胞 内部 而导 致 杂交 失 败。探 针 的大 小 和杂 交时 的 
浓 度 也 是 影 响 杂 交 结 果 的 重 要 因 素 。探 针 的 大 小 关 系 到 杂 交  的 效 率 , 浓 度 则 影 响 杂 交 后 的 背 景 。 们 通 过 不 同 的 蛋 白 酶  其 我 K 浓 度 、 化 时 间 和 探 针 浓 度 的 对 比 试 验 , 终 得 到 针 对  消 最 MD CK 细 胞 的 比较 合 适 的 蛋 白 酶 K 质 量 浓 度 为 l  g l, 0v / 消    化 时 间 为 l  n。探 针 浓 度 也 应 高 于 点 杂 交 时 的 浓 度 。 试 验  0mi 表 明 , 适 的 探 针 浓 度 为 每 微 升 ln 。在 这 些 条 件 下 , 们 得  合  g 我 到 了 较 强 的 杂 交 信 号 , 时 降 低 了 背 景 的 干 扰 , 且 很 好 地 保  同 并 留 了 细 胞 形 态 。虽 也 有 用 胃 蛋 白 酶 进 行 消 化 的 报 道 l , 我  l 但   们做 了 对 比试验 , 现 蛋 白酶 K 的消 化效 果更 好一 些 。 发   原 位 杂 交 方 法 由 于 其 自 身 特 点 , 病 毒 的 定 位 检 测 十 分  对

RNA b  n s u h b iiain wi i  o ie t s e [ ] Vi s   y i  i   y r zt   t n b vn  i u s J . r   t d o h s u
Re 1 9. s. 99 62: 7 6  6  7 .

r e e l  M g   Difr nt on o  r h Am e iana   at re   nd [ o  La o h le R , a arR . fe e i i   fNo l  13 Eur p a   ori er p od e iean   e pia o y s dr o e n p c n  e r u tv   d rs r t r  yn ome vr     ius

g n lp s b  nst  y r iainE ] Vi lgc lMeh d . e oy e  y i  iuh b i z t  J . r o ia d o o   to s 
1 97. 8 : 61 1 8  9 6 1 — 6 .

le   A M v n P e wi F. o ma n R J M e 1 De  k   [ 1  Mu d r W    . a   o l j  Mo r n      . la . — 1]
tc in of a l i e to     wie e iua   s a e vr s n e to    e ry nfc in ofs n  y sc lr die s   iu  i  p r i  e ls o cne e I an  s i s c i . Ae a ii  of mm u ohs  d k n e ton op rson  i n i—

t h m sr  n  n s u h bi z t nE ] Vi l i l t— o e i   a d i—i   y r i i  J . r o c   h  e t y t d ao o g a Me
o s, 99 68: 6 一 7 . d l 7, l 9 l 5 

[ 2  于康 震 . 13 付朝 阳 . 尚金 , 我 国禽流 感 防治 研 究进 展 [ ] 中  崔 等. J. 国兽 医 学 报 , 0 1 2 ( ) l 3 l 6  2 0 . l 1 :0 一 0 . [1 ] 3 
Colis  A .Ko l  R n  L S,S  K I.e “, e t ci  of g y o 』 l .D e ton  hihl  p t og nc nd o a h e i a  lw p t og nc va  i le a ub y e a h e i a in nfu nz s t p  H 5  

有用。 若将 其 和组 织 病理 学结 合起 来 , 是 一种 很好 的诊 断 方  将 法 , 们 正在 制备 不 同亚 型 的禽流 感病 毒 特异 性核 酸探 针 , 我 以 
将 此方 法应 用 于感 染组 织 的病 毒检 测 。  
( 研究 得 到湖北 省 动物 疫病 诊 断 中心 张厚 芝 、 力老 师 . 军 、 本 马 谢  

( rsa ie g )u ‘g NAS A[ ] JVi lgc l t o s  Eua inl a e sn   n i B J .  r o ia Mehd , o  
2 2。 0 2 21 — 2 . 00 1 3( ): 3 2 5  

吴 文艳 的热情 指导 和大 力协助 . 在此 表示 最诚 挚的谢 意 )  

[ 4   李 自力 . 1] 许青 荣 . 丁仁 , . 毕 等 湖北 省 禽 流感 的诊 断 及病 毒株 的  分 离 与初 步 鉴 定 [ ] J .中 国预 防 兽 医 学 报 。 0 l 2 ( ) l 6  20 ,3 2 :d一
l . 48 

参 考 文 献 
[ ] C le   1 an k BW . 禽病学 [ . 1 M] 第 0版. 高 国农业 出版 社 .997 2 19. 4.  
63  .

福. 苏敬 良 . . 京 : 译 北 中 

C e B.l , S e i   e e t     i o [ 5  1a— ng N  .sg d  ? n om b  e “ . p cfcd t ci nof 1 3   iKi   J Iii i Kig c mp lbce  jn yDNA  y rdzt na dP -] Ap l a yo atrj u i   e b h b iiai   n  CRI . p o J  
En ion M ir bi . 9 6 4 55 —  6   v r   c o o1 1 7, 3:  8 4 5 3. 9

E 3 王 红 宇. z 禽呼 吸 系统疾 病 E . 京 : M] 北 中国农 业 出版 社 .0 2 2 — 2 0 . 3  [ ] 于 康震 , 尚 金 , 朝阳 , . 流 感 与养 禽 业 发展 和 人类 健 康  3  崔 付 等 禽 [ ] 中 国预 防兽 医学报 , 0 0 2 ( ) 3 23 5  J. 20 .24 :1-1.

t y s   g wa J n E J n s M s h t   n e , D e    e [6   M o o a u Sa a .oh     o e 。 a a io Ebia,lH . te 13
to     —a p i   u a i  b  i  iu in ofK r s ontm t ton y n st PCR n c l s s en. i  el u p —    

so s c mp r o   fteidrc a d drc  to s J . u g in :o ai no h n i t n   i tmeh [ ] L n   s e  e d
Ca c r l 7,  l — 9 . n e 。 99 l 7: 8l l 5 

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兽 医 学 进 展 ,0 1 2 4 :— . 2 0 , ( ) 13  

[ 7  1]

Ko a a h  . ke e  H 。 s ki . l “ .D t c i   f b y s iR Ta u hi Sa a  M e , e e t on o Ep   — s en 1ar  iusi e toni  pih l lc lsa d l t i一3 rvr  nfci  ne t ei   e l  n  ymp c tsof a ho y e   

[ ] 陈伯 伦 , 5  张泽 纪 . 伟斌 . 流感 研 究 1. A 型禽 流 感病 毒 的  陈 禽 鸡 分离 与血 清血初 步 鉴定 [] 中国兽 医杂 志 .9 4 2 ( 0 :  . J. 1 9 。0 1 ) 35  [ ] Grse sP,.n so   MatnJR.n sr  e oai t no  6 es n  1 g tn C. ri   I iup rlc lai   f a   z o
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