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转录组高通量测序


转录组高通量测序 2010-11-22 09:48 (第二代高通量测序技术-454) 转录组即特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有 RNA 的总和, 是研 究细胞表型和功能的一个重要手段。与基因组不同的是,转录组的定义中包含了 时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下,其基因表达情况 是不完全相同的。罗氏 GS-FLX-Titanium 第二代高通量测序仪平均

读长超过 400bp,在测序读长上遥遥领先于其它第二代高通量测序仪,使其成为转录组学 研究的首选测序平台,已被广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。

一、 罗氏 454 测序技术在环境微生物生态多样性研究中的突出优势体现在: (1) 测序序列长,便于聚类拼接,可以对转录本进行从头组装(de novo assembly)。 (2) 测序通量高,可以检测到低丰度转录本信息。 (3) 可以对无基因组参考序列的新物种进行转录组测序,发现新的转录本和亚 型。 (4) 实验操作简单、结果稳定,可重复性强。无需进行克隆的文库构建,双链 cDNA 连接 454 接头后可以直接进行测序,实验周期短。 (5) 测序数据便于进行生物信息分析,可以进行基因差异表达分析、鉴定基因 的可变剪切以及预测新基因。 二、 美吉公司在环境微生物生态多样性研究中的突出优势体现在: (1) 拥有自主实验室和高通量测序平台,可以根据客户要求灵活安排实验,实 验周期短,取样方便,质量可靠。 (2) 技术人员经验丰富,可以稳定地进行总 RNA 的提取和双链 cDNA 的合成, 可以根据顾客要求第一时间提供实验方案。 (3) 有专业的生物信息团队和大型计算机,可以为客户提供个性化的生物信息 分析服务。 (4) 开放式实验室,参与式服务。客户不但可以参与整个实验过程,而且可以 参与生物信息分析,提供最为增值的售后服务。 三、 服务流程 (1) 客户提供样本背景信息、实验目的和实验预期。 (2) 美吉公司设计实验方案,提供测序深度建议和生物信息分析建议。 (3) 客户认可实验方案,双方签订项目合作协议。 (4) 项目开始运作,美吉公司指定专人和客户保持无障碍沟通。 (5) 项目结束,美吉公司提供标准结题报告。 (6) 客户可以和美吉公司签订长期合作协议,享受折扣和 VIP 服务。 四、 送样要求 (1) 动物、植物、微生物组织: > 请提供足量的新鲜样品,样品量≥5g;植物材料应避免过老的组织,尽量用柔 嫩部位。 > 新鲜程度要求:采样后将样品立即液氮速冻-80℃保存(保存期不超过 1 个 月),干冰运输,运输时间不超过 72h。 > 样本保存期间切忌反复冻融。

> 样品质量合格与否的判断标准:RNA 提取后经变性电泳,各 RNA 条带清晰,比 例适中,完整性好,无降解。 > 填写完整的送样订单(请点击下载),提供尽量详细的物种基因组背景资料信 息,如:基因组大小,基因平均长度,预计表达的基因数量等待。用自封袋密封 后随同样本一起快递。 > 样本的送样量和其他具体要求,请致电免费电话 400-660-1216。 (2) RNA > 总 RNA>500ug,浓度>1ug/ul; > mRNA>3ug,浓度>50ng/ul; > OD260/OD280 为 1.8-2.2;28S/18S>1.8; RIN≥ 8(哺乳动物) > 质检以我方电泳胶图、紫外分析仪定量为准。。 > 送样管务必标清样本编号,管口使用 Parafilm 膜密封。 > 样本保存期间切忌反复冻融。 > 送样时使用干冰运输。 > 填写完整的送样订单(请点击下载)和 RNA 电泳检测照片,用自封袋密封后随 同样本一起快递。 (3) 双链 cDNA > 按照美吉公司提供的 cDNA 454 文库构建流程进行文库构建,去除文库中的 POLY-A。 > 总量>5ug,浓度>50ng/ul,OD260/280 在 1.8 左右。 > 送样管务必标清样本编号,管口使用 Parafilm 膜密封。 > 样本保存期间切忌反复冻融。 > 送样时使用干冰或冰袋运输。 > 填写完整的送样订单(请点击下载)和 cDNA 电泳检测照片,用自封袋密封后 随同样本一起快递。 五、 无参考基因组转录组分析(de novo Transcriptome Analysis) > 测序和基本数据处理 合成双链 Cdna 酶切去 POLY-A 两端连接 454 接头 454 测 序 基本数据处理(图像识别、碱基识别、过滤接头序列) > 生物信息分析内容 * 数据产出统计及测序数据的成分和质量评估 * Contig 长度分布 * Unigene 长度分布 * Unigene 功能注释 * Unigene GO 分类 * Unigene 表达差异分析(不少于两个样本) * Unigene 在样本间的差异 GO 分类(不少于两个样本) * Unigene 代谢通路分析 * 蛋白功能和分类预测 > 应用领域 * 全基因组 EST 测序 * 筛选 SNV、SSR 和 InDel 分子标记 * 基因表达谱研究 * 非编码 RNA 研究

六、 有参考基因组的转录组分析(Transcriptome analysis with reference genome) > 测序和基本数据处理 合成双链 Cdna 酶切去 POLY-A 两端连接 454 接头 454 测 序 基本数据处理(图像识别、碱基识别、过滤接头序列、检测可能的样本 污染) > 生物信息分析内容 * 测序数据产量及与 Reference 比对结果概述 * Reads 在基因组上的分布 * 测序随机性评估 * 基因覆盖度、测序深度的分布 * 基因差异表达分析 * 对基因结构进行优化 * 鉴定基因的可变剪切 * 预测新基因 > 应用领域 * 基因组注释 * 基因结构分析(可变剪接、基因边界等) * 转录融合基因研究 * 基因表达谱研究 * 非编码 RNA 研究 七、 实验过程模拟 八、 常见问题 (1) 是否可以进行原核生物转录组分析? > 可以。请提供 20 ug total RNA 样品即可。 (2) 需要提供什么样本? > 可以提供新鲜的动物、 植物、 微生物组织, 提取后的总 RNA 或合成的双链 cDNA 均可。 (3) 实验周期多长? > 美吉公司从获得客户样本、高通量测序到数据分析,根据合作伙伴的个性化需 求不同,一般控制在 30 到 40 个工作日内完成。 (4) 需要多少测序量? > 100 万条有效序列,平均读长在 300 到 500bp,聚类拼接后可以得到 2 到 4 万 条 Unigene,Unigene 的平均大小在 500bp 到 10Kb 之间。转录组的大小受基因数 目和基因丰度双重影响,在物种之间变化很大。此外,组织差异、状态和实验处 理等因素也会影响转录组的组成。 (5) 是否可以参与实验和生物信息分析? > 我们是开放式实验室,我们欢迎合作伙伴参与我们的实验过程和数据分析过 程,在参与中增强沟通。 (6) 全长 cDNA 的判断 > 聚类拼接后的 Unigene 是否为全长 cDNA, 需要进行判断。 > 直接从序列上可以从如下几个方面进行判断。 5′端: * 有同源全长基因的比较, 通过与其它生物已有的对应基因末端进行 Blast 来

判断。 * 无同源基因的新基因, (1)判断编码框架是否完整, a.在开放阅读框架的第一 个 ATG 上游有同框架的终止密码, 需要注意的是有时真正的翻译起始密码子并 非是出现在 mRNA 中的第一个 ATG, 在有的真核细胞中, 在起始密码子 ATG 的上 游非编码区会有可能出现一到几个 ATG, 这称为非编码的 5′ATG。 以这种 5′ATG 并不是真是的起始密码子, 以其开始的开放阅读框常常很快遇到终止密码子。 b. 无终止密码的则考虑有保守的 Kozak 序列; (2)判断是否自转录起始点, 有资料 表明, 在 5′帽结构后一般都有一段富含嘧啶的区域, 另外如果 cDNA5′序列与 基因组序列中经 S1 酶切保护的部分相同, 则可以确定得到的 cDNA 是全长的。 3′端: * 有同源全长基因的比较, 方法同 5′端; * 编码框架的下游有终止密码; * 有一个以上的 polyA 加尾信号; * 无明显加尾信号的则也有 polyA 尾。 > 同源全长基因的比较可以用 Blast 比对或多重序列比对软件来实现, 首先搜 索到其他物种( 以相似性比较高的物种为宜) 该基因全长 cDNA 序列,再将这些 序列做 Blast 或多重比对。 > 确定得到的 cDNA 序列为全长的 cDNA 序列还只是在计算机上的“虚拟克 隆”, 最终还必须通过 RT-RCR、序列测定和 Northern 杂交等方法进行实验验 证, 以保证序列的准确性。 (7) 美吉曾转录组测序分析成功案例有哪些? > 美吉完成的没有参考基因组的物种的转录组测序和分析包括花卉、昆虫、鱼、 对虾、树木等,为这些物种的深入研究奠定了良好的基础。


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