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高活力碱性蛋白酶菌种的选育


第 22 卷   2 期 第 2005 年 6 月 文章编号 :100129383 ( 2005) 0220058204 高 68 % 。
60

河  北  省  科  学  院  学   报 Journal of t he Hebei Academy of Sciences

Vol. 22 No. 2 J une 2005<

br />
Abstract :A mutant st rain H26 producing alkaline protease was obtained f rom t he initial st rain Bacillus Co ,N T G and repeated heating. This mutant st rain showed good genetic

licheniformis XP2 ,t reated wit h

creased by 68 % on t he indust rial production scale. Keywords :Alkaline protease ;Bacillus licheniformis

碱性蛋白酶是我国酶制剂行业的主要酶种之一 ,主要用于洗涤剂和皮革脱毛 。地衣芽孢杆菌碱性 蛋白酶具有较强的分解蛋白质能力和较低的底物特异性 ,其耐碱性强 ,且热稳定性好 ,并表现出与洗涤 剂组分有较好的相容性和稳定性 。XP2 为地衣芽孢杆菌产碱性蛋白酶生产菌株 , 发 酵 酶 活 力 约 μ 19000 / ml 。为提高经济效益 ,我们以其为出发菌株 ,通过多因素连续处理方法选育高产碱性蛋白酶菌 株 ,获得了若干高产菌株 ,对 H26 菌株进行了发酵条件试验和酶性质的试验 。

1  材料与方法
1. 1   菌株

地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis) XP2 。 1. 2   培养基及培养条件 ( 1) 肉汤培养基 : 牛肉膏 1. 0 % ,蛋白胨 1. 0 % ,氯化钠 0. 5 % ,p H7. 5 。 ( 2) 液体培养基 : 牛肉膏 1. 0 % ,蛋白胨 0. 5 % ,淀粉 1. 1 % ,酵母膏 0. 5 % , 磷酸二氢钾 0. 05 % ,p H7.
5。

脂 2. 0 % ,p H7. 5 。 ( 4) 传代 、 保藏培养基 : 牛肉膏 1. 0 % , 蛋白胨 0. 5 % , 氯化钠 1. 0 % , 琼脂 2. 0 , p H7. 5 ,37 ℃培养 24h 。 ( 5) 摇瓶发酵培养基 : 豆饼粉 3. 8 % ,玉米粉 6. 0 % ,磷酸氢二钠 0. 5 % , 磷酸二氢钾 0. 03 % ,氯化钙
Ξ 收稿日期 :2005 - 03 - 02

kaline protease. Compared wit h t hat of t he initial st rain , t he enzyme productivity of t he st rain H26 has in2 ( 3) 分离培养基 : 可溶性淀粉 1 % ,酪蛋白 1 % ,酵母膏 0. 5 % , 磷酸氢二钾 0. 1 % ,硫酸镁 0. 02 % ,琼

stability in t he procedure of continual inoculation and preservation. This st rain can produce 32000u/ ml al2

Ξ

高活力碱性蛋白酶菌种的选育
王健华 ,朱宝成
( 河北大学生命科学学院 ,保定   071002)

γ 摘   : 以地衣芽孢杆菌 XP2 为出发菌株 , 通过采用 60 Co 2射线 ,N T G 和热处理方法筛选得到碱性蛋白酶变 要 异菌株 H26 。此菌株经过连续的传代保存 ,表现出良好的遗传稳定性 。该菌株产酶达 32000u/ ml ,比亲株提 关键词 : 碱性蛋白酶 ; 地衣芽孢杆菌 中图分类号 :Q933     文献标识码 :A

The selection of high2yield Alkaline protease stra ins
( College of L if e Science , Hebei U niversity , B aodi ng Hebei 071002 , Chi na)

WANG J ian2hua ,ZHU Bao2cheng

第2期

王健华等 : 高活力碱性蛋白酶菌种的选育

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0. 4 % p H10. 5 1. 3   诱变及选育方法 ( 1) 60 Co γ 2射线处理 : 将出发菌株接入肉汤培养基 ,37 ℃ 增殖 20h 。离心收集菌体 ,生理盐水洗涤 3

次 ,制备菌悬液 。进行60 Co γ 2射线处理 。再次转接入肉汤培养基 ,培养 、 离心 、 洗涤 ,用 p H6. 0 的磷酸缓 冲液制成菌悬液 。 ( 2) N T G 诱变 : 取上述菌悬液加 N T G 至 200 g/ ml 浓度 , 摇床培养 30min 。离心收集菌体 , 生理盐 μ

水洗涤 ,转接入肉汤培养基增殖培养 。 ( 3) 菌种的加热选育 : 将上述肉汤培养基增殖液接入液体培养基中 ,37 ℃ 增殖 30h ,于 80 ℃ 水浴加热 30min 。取加热后菌悬液 1ml 加入同前的液体培养基 ,培养 ,再次热处理 。如此反复 4 ~ 6 次 , 并进行培 养基平板培养和分离 。 ( 4) 菌株筛选 : 初筛   将涂布的分离培养基平皿 37 ℃ 培养 32h ,把培养好的平板菌落先放入 4 ℃ 冰 箱中冷藏过夜 ,能够更清楚地观察到透明圈 ,测定透明圈直径与菌落直径之比 ,以此比值来初步衡量蛋 白酶产酶能力的高低 ,挑选单菌落进入斜面 ,进行复筛 。 复筛   将初筛选出的菌株转入摇瓶发酵培养基 ,250ml 三角瓶内装 25ml 培养基 。旋转摇床转速 210r/ min ,37 ℃ 培养 44h 。 1. 4   酶活测定 按照中国轻工业部部颁标准 QB747 — 规定的 Folin 法测定酶活 。底物 2 %酪蛋白 ,p H11 硼砂 80 氢氧化钠缓冲液 ,40 ℃ 反应 10min ,680nm 测定 OD 值计算酶活力 。在上述条件下 , 每毫升酶液每分钟 μ 反应产生 1 g 酪氨酸为 1 酶活力单位 。

2  实验结果

2. 1   菌株诱变结果

经60 Co γ 2射线 ,N T G 和热处理后 ,经初筛和复筛 ,选育出 5 株高活力产碱性蛋白酶菌株 ,并进行发 酵条件试验 ,结果见表 1 。 表1  筛选出的产碱性蛋白酶高产菌株   由表 1 可 见 , 变 异 菌 株 H26 产 酶 最 高 , 达 μ 32000 / ml ,比亲株提高 68 % 。 菌株编号 H5 H26 A19 X11 M20
2. 2   菌株特性
酶活μ ml /
29200 32000 29900 31800 30700

2. 2. 1   菌株产酶稳定性实验

   对高产菌株的稳定性进行了考察 ,H26 株连续传五代 ,五代菌株同时进行摇瓶发酵实验 ,每个菌株 5 个重复 ,结果取平均值 ,表 2 是菌株发酵 44h 后的结果 ,从表 2 中可以看出 , H26 株传代五次产酶能力 变化不大 ,说明其遗传性比较稳定 。
2. 2. 2   菌株形态特性
表 2  H26 菌株稳定性试验结果
1 2 3 4

在含碳源的培养基上呈粘流态 。菌落生长的 初期中央有一凹陷 。 2. 3   产酶条件试验 2. 3. 1   发酵最初 p H 值对 H26 产酶的影响

代数

5

酶活μ ml /

32 209 31 922 32 887 32 309 33 794

为考察 H26 发酵培养基最初 p H 对产酶的影响 ,将灭菌前培养基调节不同的 p H 值 ,进行摇瓶发 表 3   值对 H26 产酶的影响 pH 酵 ,比较酶活力高低 ,结果列于表 3 。 由表 3 可见 , 发酵培养基 p H10. 5 时发酵活 培养基 p H 值 9. 0 9. 5 10. 0 10. 5 11. 0 力最高 ,定为最适产酶 p H 值 。 发酵酶活μ ml 264501 28367 29885 32168 30856 / 2. 3. 2   发酵培养基组成试验   ( 1) 各种无机盐对产酶的影响

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河北省科学院学报

2005 年第 22 卷

对磷酸氢二钠 、 磷酸二氢钾 、 硫酸镁 、 硫酸锌 、 氯化钙 、 硫酸锰等做了对比试验 。
表4  无机盐对产酶的影响 无机盐类别 添加浓度 ( %) μ 最高酶活力 ( / m) 对照 —
25281 Na2 HPO4 0. 5 27354 KH2 PO4 0. 03 26230 MgSO4 0. 2 24962 ZnSO4 0. 01 25278 CaCl2 0. 4 28753 MnSO4 0. 01 22395

通过对发酵培养基组成的各个成分进行反复实验 ,结果表明 0. 5 %磷酸氢二钠和 0. 03 %磷酸二氢 钾对产酶有利 ,同时发现钙离子可提高酶的稳定性 ,对发酵有利 。 ( 2) 不同种类碳源对产酶的作用 在以豆饼粉为氮源的情况下 ,试验了淀粉 、 、 糊精 液化的玉米粉和不经液化的玉米粉等碳源对碱性 蛋白酶产量的影响 。    由表 5 可见 ,玉米粉效果较好且相对较廉价 , 是较理想的碳源 , 其中液化的玉米粉更佳 。液化 条件 : 先将玉米粉糊化 , 加入 α 2淀粉酶 0. 06 % , 75 ℃ 液化半小时 ,再升温灭活 ,然后加入豆饼粉及 无机盐类 。 ( 3) 最佳培养基配方的选择 酶的活力最高 。 2. 4. 2   温度对酶活力的影响 ( 见图 2)
表5  碳源对产酶的影响 碳源 浓度 ( %) 淀粉
5

糊精
5

玉米粉

玉米粉

( 液化) ( 不液化) 6 26155 6 25064

μ 平均酶活力 ( / ml) 22597 23028

   考虑到培养基的经济性 ,碳氮源以玉米粉和豆饼粉为主 ,加以无机盐包括磷酸氢二钠 、 磷酸二氢钾 和氯化钙 。改变玉米粉与豆饼粉固形物浓度 ,进行培养基组成试验 ,1 — 号培养基固形物浓度是递增 5 的。 表6  最佳培养基配方的选择    可见 ,以 3 号培养基为佳 ,继续增加固形物浓 度 ,不但成本增加且产酶下降 。 培养基编号 1 2 3 4 5 2. 4   酶的性质试验 发酵终 p H 值 6. 8 6. 8 6. 7 6. 4 6. 2 μ 2. 4. 1   H 值对酶活的影响 p 平均发酵产酶 ( / ml) 30561 31490 32074 29726 29083 以不同 p H 值的缓冲液 ,在温度 40 ℃ 时测定 碱性蛋白酶的酶活 。其中 p H4 - 8 为 Na2 HPO42柠 檬 酸 缓 冲 液 ; p H9 为 硼 酸 缓 冲 液 ; p H10 - 11 为
图 1   值对碱性蛋白酶酶活的影响          2   pH 图 温度对碱性蛋白酶酶活的影响

Na2B4 O72NaOH 缓冲液 ;p H12 - 13 为 KCl2NaOH 缓冲液 。从图 1 可知 ,p H10 时地衣芽孢杆菌碱性蛋白

第2期

王健华等 : 高活力碱性蛋白酶菌种的选育

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分别在 20 ℃,30 ℃,40 ℃,50 ℃,60 ℃,70 ℃ 时测定碱性蛋白酶的活力 ,图 2 表明 ,蛋白酶活性随着温 度的升高而增大 ,在 60 ℃ 时的活力最高 。 2. 4. 3   各种金属离子对酶活力的影响 在发酵酶液中添加各种金属盐类 ,使浓度为 0. 01M ,测定酶活力 ,以对照组为 100 % ,计算各组酶活 力的百分数 。结果见表 7 。说明 Na + ,Ca2 + 对该酶有促进作用 ,Cu2 + 对该酶有抑制作用 。

3  讨论
3. 1   菌落形态

表7  金属离子对酶活力的影响 金属离子 不加 Na + Mg2 + Ca2 + Fe2 + Cu2 +

在菌种诱变和筛选过程中 , 出现了两种菌落 酶活力百分数 ( %) 100 105 99. 6 109 95. 5 17. 2 形态 。一种边缘整齐 ,质地粘稠 ,称为光滑型 ; 另 一种边缘不整齐 ,质地不粘 ,称为粗糙型 。光滑型菌落数量较多 ,我们在挑选菌落时也以光滑型为主并 得到了高产菌株 ,但粗糙型菌落由于挑选较少 ,并不能证明菌落形态与产酶之间的相关性 ,此工作有待 大量实验的证实 。 3. 2   透明圈 在菌种出筛时 ,一般认为透明圈大即产酶高 ,圈不大就被淘汰 ,我们发现透明圈与酶活之间不是很 规律性的东西 ,有的菌落透明圈虽然不大 ,但酶活并不低 。所以 ,菌落的优劣应以多次发酵摇瓶的验证 为准 。 3. 3   染菌问题 我们发现 ,诱变得到的高产菌株 H26 在发酵过程中较之出发菌株易染菌 ,要求除进行严格的无菌 操作外 ,需要更加注意周围环境的清洁卫生 。其具体原因需要进一步的探讨 。 参考文献 :
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( 上接第 57 页)

3  结论
在微生物的作用下 , 低浓度 AA2AA ( 100mg/ L 以内 ) 可被很好的降解 , 其降解率可在 25 天达到 100 % 。高浓度 AA2AA ( 100mg/ L 以上) 可以得到大部分的降解 ,其降解率可在 15 天达到 60 %以上 。
[1]   霍宇凝 ,陆柱 . 聚合物阻垢剂研究进展 [J ] . 水处理技术 ,2000 ,26 (4) :199~202. [2]   纪永亮 . ! 95 水处理药剂研究及应用学术研讨会论文评价 [J ] . 工业水处理 ,1995 ,15 (6) :1~4. [4]   熊蓉春 ,魏刚 ,等 . 绿色阻垢剂聚环氧琥珀酸的合成 [J ] . 工业水处理 ,1999 ,19 (3) :11~13. [3]   熊蓉春 ,董雪玲 ,等 . 绿色生物高分子聚天冬氨酸的合成及其阻垢性能研究 [J ] . 工业水处理 ,2001 ,21 (1) :17~20.

参考文献 :


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