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Microscale LC of proteins and peptides


Microscale LC of proteins and peptides

微量液相色谱分离蛋白和多肽

Outline 概述
Microscale LC of proteins and peptides 微量液相色谱分离蛋白质和多肽 Micropreparative purification 微制备级纯化 Characterization 鉴定 Proteomic prefractionation 蛋白质组预分离

Daniel Haid GE Healthcare Bio-Sciences AB
1 11/4/2008

为什么采用微量液相色谱
满足微量分离的趋势

微量液相色谱 Microscale LC
性能 分辨率 灵敏度 重复性 回收率

技术指标 颗粒大小 层析柱直径 系统压力 死体积

? 分离组分间差异小 ? 起始物料有限 ? 目标分子浓度低 ? 缓冲液或试剂珍贵 ? 快速分离

应用需求 分离组分间差异小 处理小量样品和洗脱体积 处理稀释样品 次与次间的比较
3 11/4/2008 4 11/4/2008

技术指标
A 2 p ep m i x 1 0 0 3 : 1 0 _ U V 1 _ 2 1 5 n m @ 0 3 ,S H F T m AU A 2 p e p m ix 1 00 3 : 1 0 _ U V 1 _2 1 5 n m @ 0 0 3 U ,S H F T

微量分离
3 ?m, 2.1 x 100 mm
50

微制备级纯化
在ng-μg级采用多种色谱技术相结合的方法纯化蛋白混合物

颗粒大小

0

-5 0

1.9 ?m, 2.1 x 100 mm
4 0.0 4 5 .0 5 0 .0 5 5 .0 6 0 .0 6 5 .0 7 0 .0 m in

-1 0 0

鉴定
样品的特性和形态如纯度、浓度和多聚体、异构体或蛋白聚集体

uRPC 21 x 10 Cyt C Digests 01 004:13_UV1_215nm@0101,SUB mAU

uRPC 1 x 15 Cyt C Digests 01 005:11_UV1_215nm@0101,SUB mAU

0.1 礸 Cyt C / 8 pMol

8 pMol / 0.1 礸

4.0

8.0

层析柱内径

3.0

6.0

37.71

35.73 4.0

2.0
30.93 41.35 46.31

蛋白质组预分离
48.95

17.45 1.0 1.55 1.81 1.34 0.0 7.99 9.69 13.83 20.66

23.85

26.47

2.0 23.83 2.65 0.0 25.24

28.69 36.33 41.71 35.21 38.52

把样品复杂性降低用于深入研究蛋白质组
min

-2.0

0.0

5.0

10.0

2.1 mm

15.0

20.0

25.0

30.0

min

0.0

10.0

20.0

1.O mm
30.0 40.0

50.0

系统死体积
系统死体积增加
5 11/4/2008 6 11/4/2008

1/ GE /

Outline 概述
Microscale LC of proteins and peptides 微量液相色谱分离蛋白质和多肽 Micropreparative Purification 微制备级纯化

用IMAC和离子交换色谱微制备级纯化 His-GFP
清洗步骤

Variant 1

Variant 2
非特异性结合

A280

GFP

Characterization 鉴定 Proteomic prefractionation 蛋白质组预分离

A490

系统: 层析柱: 流速: 样品: 洗脱液 A: 洗脱液 B:

EttanTM LC HisTrapTM HP 1ml 1 ml/ml 5 ml 澄清的 E.coli 裂解物, 20 mg/ml His-GFP 20 mM Na2HPO4 pH 7.4, 500 mM NaCl, 20 mM 咪唑 20 mM Na2HPO4 pH 7.4, 500 mM NaCl, 500 mM 咪唑

系统: 层析柱: 流速: 样品体积: 洗脱液 A: 洗脱液 B:

Ettan LC Mono QTM PC 1.6/5 0.2 ml/min 4 ml (组分 A4 – A7 from DS) 20 mM 磷酸钠, pH 7.4 20 mM 磷酸钠, pH 7.4, 1 M NaCl

分析型凝胶过滤
分析从Mono Q PC 1.6/5 收集的组分 A4 和 A5
二聚体 单体

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Microscale LC of proteins and peptides 微量液相色谱分离蛋白质和多肽 Micropreparative Purification 微制备级纯化 Characterization 鉴定 Proteomic prefractionation 蛋白质组预分离

从Mono QTM 收集的组分 A4

组分 A4 主要是 His-GFP的单体

从Mono QTM 收集的组分 A5

系统:EttanTM LC 层析柱:SuperdexTM 75 PC 3.2/30 流速: 0.05 ml/min 检测:UV 490, 280 and 215 nm 样品体积:25 μl

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快速凝胶过滤鉴定蛋白质
提供有价值的样品信息,如:
纯度 分子量 聚集体 多聚体 (异构体)

快速纯度鉴定
亲和层析条件: 系统: ?KTAexplorerTM 层析柱: StrepTrapTM HP 样品: E.coli 细胞裂解液 (1.1 mg GADP-Strep (II) 和 1.1 mg M1Pase-Strep(II)). 流速: 1 ml/min

短凝胶过滤柱的优势
速度 样品消耗少 缓冲液用量少
分析没有瓶颈
凝胶过滤条件: 系统:EttanTM LC 层析柱:SuperdexTM 75 5/150 GL 样品:纯化的 M1Pase-Strep(II) 组分 纯化的 M1Pase-Strep(II) 组分 样品体积: 50 μl

GF can be run under native conditions, giving different information compared to SDS-PAGE
11 11/4/2008

12 11/4/2008

2/ GE /

鉴定未完全表达的异构体

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Microscale LC of proteins and peptides 微量液相色谱分离蛋白质和多肽 Micropreparative Purification 微制备级纯化 Characterization 鉴定 Proteomic prefractionation 蛋白质组预分离

凝胶过滤条件: 系统:EttanTM LC 层析柱:SuperdexTM 75 5/150 GL 样品:重组蛋白, 17.0 kDa 样品体积:4 μl 流速: 300 μg/ml/min

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蛋白预分离
降低样品的复杂度 提高鉴定蛋白的数目 检测低丰度蛋白的可能性提高 保留完整蛋白质和他们多肽的相关性
plasma concentration Albumin Immunoglobulins Transferrin Alkaline Phosphatase major serum proteins

降低样品的复杂度用于鸟枪法蛋白质组
RPC

质谱鉴定 蛋白酶解
IEX
样品:组分 5 ( 第一向采用 Mini QTM分离) 层析柱:SOURCETM 5RPC 4.6 x 150 mm 流速: 0.5ml/min

?M

nM

NSE PSA TNF Interleukins

disease tissue markers

pM

fM

signaling proteins
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样品: ~2.5 mg E. coli 蛋白质 层析柱:Mini QTM 4.6/50 流速: 0.5ml/min
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aM 10 100 1,000 10,000 no. of proteins

差异表达分析
比较激素刺激和未刺激的淋巴细胞
淋巴细胞

差异表达分析
蛋白预分离和肽水平预分离相比,鉴定蛋白数增加3倍

收集细胞
VEGF-A 刺激 Control VEGF-C 刺激

澄清样品 Mono QTM
酶解

RPC-MS/MS

Mono Q
Digestion RPC-MS/MS DeCyderTM MS

Mono Q 预分离
酶解

RPC-MS/MS DeCyderTM MS

RPC-MS/MS

Protein ID
DeCyderTM MS

Rel. protein levels

Protein matching/ Rel. Quantification

预分离的条件 系统: EttanTM LC 层析柱: Mono QTM PC 1.6/5

DeCyderTM MS

样品:澄清的淋巴细胞裂解物 样品体积: 1000 μl (600 μg)
17 11/4/2008 18 11/4/2008

3/ GE /

混合样品的差异分析
在预分离前进行荧光染料CyDye的标记
样品 1 样品 2

总结
预分离/RPC

微量液相色谱
填料、层析柱和系统的重要性

CyTM/ICPLTM 标记

Cy/ICPLTM 标记 混合样品 Mono QTM 预分离
RPC SDS PAGE 酶解 蛋白水平相对定量

微制备级纯化蛋白质
起始物料有限
分离结构差别非常小的蛋白
SDS-PAGE 定量分析 CyDye 标记样品

鉴定蛋白质
凝胶过滤可以在天然条件下分析
分析蛋白的聚合情况或是否被剪切 快速纯度评估

相对定量 (DIGE)
通过同位素标记进行质谱 定量分析
蛋白水平相对定量

蛋白质组预分离
样品复杂度降低
检测低丰度蛋白质 蛋白相对定量的首选
19 11/4/2008 20 11/4/2008

RPC-MS/MS

蛋白水平相对定量

相对定量

(ICPLTM)

Thank you!

?KTAexplorer, Ettan, StrepTrap, HisTrap, Mono Q, Mini Q, Cy, CyDye, DeCyder, Source and Superdex, are trademarks of GE Healthcare companies. GE, imagination at work and GE monogram are trademarks of General Electric Company. ICPL is a trademark of Toplab, GmbH. All third party trademarks are the property of their respective owners. All goods and services are sold subject to the terms and conditions of sale of the company within GE Healthcare which supplies them. A copy of these terms and conditions is available on request. Contact your local GE Healthcare representative for the most current information. GE Healthcare Bio-Sciences AB, a General Electric Company. GE Healthcare Bio-Sciences AB, Bj?rkgatan 30, SE-751 84 Uppsala, Sweden.
First published October 2008. ? 2008 General Electric Company – All rights reserved.
21 11/4/2008

4/ GE /


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