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单克隆抗体与多克隆抗体配对ELISA方法比较


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生物技术通报
?研究报告?
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第1 1期

单克隆抗体与多克隆抗体配对ELISA方法比较
张小兵1

邸禄芹2

吴萌1

/>闫静辉1

(1河北省生物研究所,石家庄050081;2河北医科大学第三医院,石家庄050051)

摘要:

以人绒毛膜促性腺激素(HCG)为抗原,制备出对HCG的多克隆抗体和特异性单克隆抗体,并进行抗体纯化和

特性分析,利用辣根过氧化物酶(HRP)分别对其进行了标记。采用双抗夹心ELISA试验,探讨了多克隆抗体与单克隆抗体配
对的若干事项。结果表明,利用单克隆抗体和酶标多克隆抗体配对,并用含动物血清的稀释液稀释酶标抗体,可实现对检测 原的高特异性和高灵敏度检测。 关键词:?单克隆抗体多克隆抗体抗体配对ELISA法

Study of the Optimum Pairing of Polyclonal Antibodies and

Monoclonal

Antibodies with
Di Luqin2

Sandwich
Yan

ELISA

Zhang Xiaobin91

Wu Men91

Jinghuil

(1 Biology Institute o,Hebei,Shijiaahuang 05008 1;


The Third Hospital

ofHebei Medical University,Shijiazhuang 050051)

Abstract:Using human chorionic specific for HCG
were

gonadotrophin(HCG)as the antigen,polyclonal antibodies and monoelonal antibodies(McAbs)
these antibodies
were

generated,characterized and highly purified.Then

labeled with horseradish peroxidase

(HRP).By



double antibody sandwich enzyme-linked immunosorhent assay,several problems of the optimum pairing of
were

polyelonal舳一

tibodies and monoclonal antibodies

discussed.The results showed that with monoclonal

antibody
sera as

as trapping antibody and poly-


clonal antibody labeling with enzyme highly specificity and sensitivity Key words:
Monoclonal to

as testing antibody which should be diluted with animal
antigen. antibody Optimum pairing of

diluent,the sandwich ELISA had

detect

antibody

Polycloasl

antibodies

Sandwich

ELISA

当前,抗体不仅仅用于医学和生物学,它的应用 范围已扩大到农业、工业、基础研究、环境保护和食 品检测等各个方面。特别是近几年来,抗体在动植 物疾病的防治方面越来越活跃。尤其今年,在快速 大量检测奶粉中三氯氰胺的过程中,抗体类试剂盒 更是凸显了其无比的优越性。但对于抗体配对问题 探讨的报道很少。笔者以HCG为抗原,制备了多克 隆抗体和单克隆抗体,并以其为模式抗体,利用一种 抗体标酶另一种抗体包被酶标板的方式,组装了双 抗夹心式ELISA试剂盒。并对检测中出现的一些 问题,做了初步探讨,以期为对其他种类标志抗原的 ELISA检测提供依据和参考。

1材料与方法
1.1

主要试剂和仪器 新西兰大白兔(河北实验动物中心),雌性BALB/c

小鼠(河北实验动物中心),HCG抗原(1

450 U/mg,

系自行提取),LH、FSH两种标准品均系卫生部上海 生物制品研究所产品,HAT、HT、PEG、福氏完全佐剂 和福氏不完全佐剂(Sigma公司),辣根过氧化物酶 标记羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公 司),小鼠Sp2/O-Agl4骨髓瘤细胞(本研究室保 存),DMEM培养基、细胞培养板(GIBCO公司),辣 根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥生 物技术有限公司),小鼠单克隆抗体亚型试剂盒

收稿日期:2009?07—13 作者简介:张小兵(1973一),男,河北景县人,高级工程师,主要从事生物技术的应用研究;E—mail:9xiaobin99@sins.COlll

通讯作者:同静辉(1963-),男,河北辛集市人,副研究员,主要从事细胞生物学及抗体工程技术的研究;E—mail:Yanjin#ui@126.c锄

万方数据

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(Sigma公司),辣根过氧化物酶(HRP,250 它试剂均为分析纯。

U/mg

争酶免疫试验【31对单克隆抗体的亲和力常数进行 测定。 1.4抗体的纯化与鉴定 用辛酸一硫酸铵沉淀法纯化兔抗血清和小鼠腹 水H’51。用SDS-PAGE法对抗体纯度进行鉴定哺1。 并用凝胶成像系统进行分析。采用紫外吸收法"1 对抗体浓度进行测定。 1.5抗体的标酶 利用改良过碘酸钠氧化法旧1进行抗体标酶。 首先称取适量HRP酶,溶于三蒸水中,加入新近配 制的过碘酸钠溶液,混匀后置4℃,30 min;加入乙二 醇溶液,室温,30 min;加入适量纯化抗体,混匀,调 pH值至9.0,放4。C,过夜;加入硼氢化钠,混匀,置
4℃,2 h;将酶标抗体混合液加入等体积饱和硫酸铵

material,RZI>3.0,北京华美转导科技有限公司),其 96孔聚苯乙烯酶标板(厦门云鹏科技发展有限 公司)、酶联免疫检测仪(TECAN)、凝胶成像仪 (UVP)。 1.2多克隆抗体的制备… 用于免疫的新西兰大白兔为健康雄性,体重为
2~3

kg。免疫方案:取HCG700斗g用1 ml生理盐

水稀释,加等体积福氏佐剂充分乳化后,于兔背部皮 下多点注射。第一次基础免疫用福氏完全佐剂,以 后的加强免疫用福氏不完全佐剂。每次免疫间隔2 周。每次免疫后10 d在兔耳缘静脉抽取少许血,分 离血清,检测免疫效果。在血清效价达到l:40万以 上时,从颈动脉放血,分离血清。 1.3单克隆抗体的制备 1.3.1动物免疫及杂交瘤细胞株的建立¨1 用3

溶液,置4℃,30 min;离心后,用pH7.4的磷酸盐缓 冲液透析过夜。包被HCG抗原,直接ELISA法测定 酶标抗体效价。
1.6

只7—8周龄雌性BALB/c小鼠,首次基础免疫用福 氏完全佐剂与等体积HCG溶液(HCG用量为100 斗g/只小鼠)混合乳化后颈背部多点注射。两周后 作第2次免疫,用福氏不完全佐剂与首次相同剂量 抗原乳化后颈背部多点注射。再两周后ELISA法 测小鼠血清抗HCG效价,选取一只最佳免疫小鼠融 合前3 d腹腔注射抗原液100“g作加强免疫。 取对数生长期的小鼠骨髓瘤sp2/o细胞与免疫 脾细胞按常规方法用50%PEG进行融合。用间接 ELISA检测培养上清。选择强阳性克隆,用有限稀 释法连续克隆化2~3次,直至有克隆孔HCG抗体 100%阳性。将建立的稳定分泌高特异、高效价 HCG单克隆抗体的杂交瘤细胞株扩增培养后,置液 氮中保存。 1.3.2腹水抗体的制备及特性分析将各种抗HCG 杂交瘤细胞分别接种于预先注射石蜡油致敏的成年 雌性BALB/c小鼠腹腔内,7—10 d后收集腹水。 以间接ELISA法对各种杂交瘤腹水的抗体效 价进行测定;将LH、FSH两种标准品分别包被酶标 板,采用间接ELISA法对单克隆抗体特异性进行测 定;以免疫小鼠血清为阳性对照,Sp2/0细胞培养上 清为阴性对照。采用SIGMA公司抗体亚型检测试 剂盒对单克隆抗体抗体类型及亚类进行测定。非竞

ELISA法标酶抗体配对及优化
mol/L

1.6.1双抗夹心ELISA检测方案用0.01

pH9.6碳酸盐缓冲液将多克隆抗体或单克隆抗体稀 释至5¨g/ml包被酶标板,4℃过夜;用PBS/T20洗 板3次,每次3 min;用含3%小牛血清的PBS/T20 封闭,37℃孵育l h,洗板;加入倍比稀释的HCG溶 液,37℃孵育45 min,洗板;加入HRP.单克隆抗体或 HRP一多克隆抗体,37℃,30 rain,洗板;加入TMB显 色液,37℃避光反应15 min后,加入终止液;读取波 长为450 am时的OD值。 1.6.2检测方案及其优化基本方案l:多克隆抗 体包被酶标板,HRP.单克隆抗体检测;基本方案2: 单克隆抗体包被酶标板,HRP一多克隆抗体检测。 为了最大限度地减小非特异性吸附造成的阴性 对照和空白对照读数过高,提高检测灵敏度,根据统 计学原理设计优化处理。酶标板采取封闭和不封闭 处理,HRP一抗体分别采用PBS/T20、含3%小牛血清 的PBS/T20、含3%兔阴性血清的PBS/T20和含3% 小鼠阴性血清的PBS/T20稀释。做完封闭或不封 闭后,直接加入用稀释液稀释的HRP.抗体或用含有 其他动物血清的稀释液稀释的HRP.抗体,其他试验 操作严格按ELISA试验步骤进行。每个处理做6 个重复。具体优化处理策略如表1。

万方数据

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张小兵等:单克隆抗体与多克隆抗体配对ELISA方法比较

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2结果与讨论
2.1

酶后,效价为80万,工作浓度调整到1:1万。 2.4双抗夹心ELISA检测结果
2.4.1

兔抗HCG多克隆抗体的获得 共免疫1只新西兰大白兔。免疫3次后,测定

基本方案各优化结果

基本方案1各优化

效价达到1:40万以上,一次性获得抗血清56

ml。

处理结果如图1。处理A.②与处理c.⑥、处理B一③ 与处理D-⑧和处理B一④与处理E.⑩各组数据通过 单因数数据分析发现,在基本方案1中酶标板的封 闭处理与不封闭处理显著性差异不明显(0.05水 平),即在该试验条件下酶标板可以不封闭。同时 该试验结果也提示,在用包被蛋白包被酶标板时,只 要蛋白浓度足够大,其完全可以占据所有的吸附位 点,从而在试验伊始就杜绝了酶标板壁空白位点的 非特异性吸附。在ELISA试验中,阴性对照和空白 对照的OD值通常要控制在0.200以下,因此基本 方案1各处理数据是可以接受的。但分别对封闭条 件下各处理组间的数据和不封闭条件下各处理组间 的数据进行分析时,笔者发现HRP标记的鼠单抗用 含动物血清的稀释液稀释比单纯用稀释液稀释,其 所测得的OD值要明显得低。说明稀释酶标单克隆 抗体时,用含动物血清的稀释液会降低非特异性 显色。 基本方案2各试验处理结果如图2,试验结果 显示只要包被蛋白浓度足够大,在基本方案2中封 闭处理的意义并不大,与基本方案1的结果相似;但

随后取2.8 ml进行纯化,获得300¨l纯化抗体。纯 化兔抗HCG多抗蛋白含量用紫外分光光度法测定 为10.83 mg/ml,凝胶成像软件分析纯度可达88%。 纯化后该多抗效价为1:20万。 2.2鼠抗HCG单克隆抗体的获得 2.2.1分泌抗HCG单克隆抗体的杂交瘤细胞株的 建立共进行了两次细胞融合,每次用6块96孔 板,平均每孔有1—2株融合细胞生长,融合率为 100%。经过对阳性杂交瘤细胞株进行多次有限稀 释克隆,共获得8株稳定分泌抗HCG单克隆抗体杂 交瘤细胞株,经过初步的试验优选其中的5株细胞 株进行下一步试验,分别命名为4F6、4A9、3H9、2E3
和4811。

2.2.2单克隆抗体的制备及纯化5株杂交瘤细 胞株分别注射到小鼠腹腔诱发腹水,每只获取4—


ml的优质腹水,腹水效价为40万一800万。分别

取2—3 m1进行纯化,获得抗体约250斗l一300恤l。 纯化后蛋白含量15.6
mg/ml一23.5

ms/ml,凝胶成 在包被FSH和

像分析纯度达到84%一87%。 2.2.3单克隆抗体的免疫学特性

酶标记多克隆抗体用含动物血清的稀释液稀释与用 单纯的稀释液稀释,各处理组间却存在着极显著的 差异。 《抗体技术实验指南》p】一书中指出:血清中总 抗体浓度是10 ms/ml,特异性抗体的浓度通常小于
0.5

LH的间接ELISA试验中,只有4A9单克隆抗体与 FSH和LH有交叉反应,其余皆无交叉反应。经亚 型检测试剂盒鉴定,5株抗体均为IgGl。5株抗体 的亲和力常数为1×10 7一×10”L/mol。经比较后, 选择2E3做下一步试验。
2.3

ms/ml;而腹水中总抗体的浓度是1—10 ms/ml,

HRP酶标抗体的获得 兔多克隆抗体标记HRP酶后,效价为20万,工

特异性抗体的浓度是0.9~9 mg/ml。既然如此,设 想理想状态下,纯化后的多克隆抗体溶液中存在一 个特定的单位体积。在这个单位体积中,各种类抗

作浓度调整到1:1万。2E3单克隆抗体标记HRP

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体间分子的个数是最大公约数。例如,在这个单位 体积中,各种类抗体的分子个数的总数是1 000个, 特异性抗体分子的个数可能是49个,其他951个抗 体分子就是非特异性抗体,即针对其他抗原或者非
4 5

目标抗原的抗体。在如此多得非特异性抗体中肯定 有与小鼠抗体IgG结合的抗体,但数量不会太多,假 设是10个抗体。



趔 者



2 5 1



m们n蛇仉¨仉∞.O

[图。。,豳.豳.豳.豳I豳.豳I豳.皇.
l 2 3 4 5 6







10

1.A—①;2.A—②;3.B--③;4.B-④;5.C--⑤

6.c—⑥;7.D-⑦;8.D-@;9.E—⑨;10.E-@
处理

图1基本方案1优化处理结果

0.4
0.35

0.3

趔0.25
§0.2



0.15 0.1 O.05 O

f寓.豳.。.豳.豳。。.豳。豳.廖.。.


















10

6.C-@;7.D岣;8.D—⑧;9.BJ⑦;10.E-@
处理

1.A—①;2.A—②;3.B—③;4.B-@;5.c—⑤;

图2基本方案2优化处理结果

第一种情况:用多克隆抗体包被酶标板,HRP一 试单克隆抗体检测。在包被过程中,“Y”字型的蛋 白分子吸附到酶标板壁上,其方向性是随机的,可能 是Fab端吸附到酶标板壁上,也可能是Fc端或其他 的部位。但由于空间位阻的原因,只有Fab端充分 暴露的多克隆抗体才能有效抓住抗原分子。如此算 来,用1个上述单位体积多克隆抗体包被酶标板,其 中能有效抓住抗原分子的分子个数一般不会超过3 个。此时,加入HRP一试单克隆抗体会引起非特异性 吸附显色,可以将此时的显色强度定为3。 第二种情况:用单克隆抗体包被酶标板,HRP. 试多克隆抗体检测。单克隆抗体的理化性状高度均 一,生物活性单一,并且与抗原的结合特异性强。因 此,如果用1个单位体积的单克隆抗体包被酶标板,

吸附在酶标板上的能被多克隆抗体非特异结合的单 克隆抗体分子个数肯定要大大超过10个。此时,加 入HRP一试多克隆抗体所引起非特异性吸附显色强 度应该是10,接近于第一种情况的3倍,能与试验 结果相印证。 在第二种情况中,若HRP一试多克隆抗体与浓度 远远高于它的动物血清一起加入酶标孔中,由于动 物血清中蛋白的种类和数量的庞大性,因此,对引起 非特异性吸附显色的HRP.试多克隆抗体能起到竞 争性抑制的蛋白质分子,仅从数量上来说就非常庞 大。因此,在方案2中,若用含动物血清的稀释液稀 释HRP.多克隆抗体,可以解决空白对照和阴性对照 OD值高的问题。在方案1中,用含动物血清的稀 释液稀释HRP一单克隆抗体,本来已经很低的空白

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张小兵等:单克隆抗体与多克隆抗体配对ELISA方法比较 标多克隆抗体。这可能就是两个检测方案检测灵敏 度高低不同的关键所在。
O.8
O.7 O.6

对照和阴性对照的OD值也会有所降低,只是效果 不如方案2明显而已。 腹水单克隆抗体中,特异性抗体数量约占总抗 体的90%,非特异性抗体仅占到10%,即非特异性 抗体中能结合兔源抗体的鼠源抗体的量非常少,所 造成的非特异性显色的强度也就非常小。虽然,抗 体间相互作用的情况远非讨论所叙述的那样简单, 但总的趋势大致如此,并且基本符合试验结果。 在后续的试验操作中,都未做封闭处理,只是酶 标抗体的稀释均采用含3%小牛血清的PBS/T20稀 释,其他步骤未做调整。
2.4.2

O.5 0.4
0.3 O.2 O.1



圈4基本方案2 ELISA检测结果

基本方案ELISA检测结果

在双抗夹心



总结 总结以上试验结果,笔者认为用单克隆抗体包

ELISA检测所有中,检测HCG的初始浓度是60斗g/ ml,按2“倍比稀释为不同的浓度,加入检测孔中。 基本方案1的检测结果如图3所示。由图3可以看 出,基本方案1的检测灵敏限是29.297
ng/ml。

被酶标板,捕获检测原,可保证检测的特异性;用酶 标多克隆抗体来检测,可提高检测的灵敏度;用含动 物血清的稀释液稀释酶标抗体,可保证对检测原的 高特异性和高灵敏度检测,此即双抗夹心ELISA检 测的最优方案。





参考文献
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图3磊本方累1 ELISA检铡结果



董志伟,王琰.抗体工程(第2版)[M].北京:北京医科大学出 版社,2002,218~225,280—282.

基本方案2的检测结果如图4所示。基本方案 2的检测灵敏限是3.662 ng/ml。由此可知基本方 案2要比基本方案1优越,灵敏度提高了约9~10 倍。基本方案1与基本方案2的区别在于方案1是 多克隆抗体捕获HCG后,HCG再结合酶标单克隆

4 5

Mckinney

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抗体显色;方案2是单克隆抗体捕获HCG后,HCG 再结合酶标多克隆抗体显色。在方案1中,每个被 捕获的HCG分子只能结合1个酶标单克隆抗体;而 方案2中,每个被捕获的HCG分子可以结合多个酶
9 8

刘玉翠,邹岳奇,同静辉.河北省科学院学报,1991,(1):39
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哈洛,莱思著,沈关心,等译,抗体技术实验指南[M].北京:科学 出版社,2002,3:49.

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单克隆抗体与多克隆抗体配对ELISA方法比较
作者: 作者单位: 刊名: 英文刊名: 年,卷(期): 被引用次数: 张小兵, 邸禄芹, 吴萌, 闫静辉, Zhang Xiaobing, Di Luqin, Wu Meng, Yan Jinghui 张小兵,吴萌,闫静辉,Zhang Xiaobing,Wu Meng,Yan Jinghui(河北省生物研究所,石家庄 ,050081), 邸禄芹,Di Luqin(河北医科大学第三医院,石家庄,050051) 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009,(11) 1次

参考文献(9条) 1.裘法祖.武忠弼.吴在德 现代免疫学实验技术 2002 2.金伯泉 细胞和分子免疫学实验技术 2002 3.董志伟.王琰 抗体工程 2002 4.Mckinney MM.Parkinso A 查看详情 1987 5.刘玉翠.邹岳奇.闫静辉 查看详情 1991(02) 6.奥斯伯 F.王海林 新编分子生物学实验指导 1998 7.温进坤.韩梅 医学分子生物学原理与实验技术 1999 8.刘玉翠.邹岳奇.闫静辉 查看详情 1991(01) 9.哈洛.莱恩.沈关心 抗体技术实验指南 2002

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粒体蛋白。免疫组织化学鉴定显示两者可特异性结合肝胞浆中的hCE-II蛋白,而不与血管平滑肌细胞结合。<br>   结论:制备的pAb有较高的效价和较好的特异性,为肝癌诊断试剂盒的研究奠定了实验基础;制备的杂交瘤细胞为单克隆抗体的制备提供了原料。

3.学位论文 赵海丹 抗多囊蛋白-1单克隆抗体和多克隆抗体的制备及其在常染色体显性遗传性多囊肾病发病机理研 究中的应用 2003
探讨体液中多囊蛋白-1的定量检测在临床ADPKD诊治中的应用价值.该研究由三部分组成.一、多囊蛋白-1胞外区的重组表达及纯化.提取健康人肾组 织总RNA,根据已知的PKD1cDNA序列(GenBankL33243),自行设计2对引物跨越多囊蛋白-1成熟蛋白的氨基端部分LRR区和部分WSC区.用一步法RT-PCR选 择扩增编码多囊蛋白-1这一多拷贝区的两个cDNA片段(其大小分别为502bp和471bp),并将之克隆到融合蛋白表达载体pQE30中,构建的表达载体pQE30PKD1e1和pQE30-PKD1e2,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实为所需要的质粒后,将其转染含有阻遏质粒pREP4的大肠杆菌M15.异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达氨基端有6个连续组氨酸的融合蛋白,用Ni-NTA Agarose行亲和层析纯化融合蛋白.纯化产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示 出相对分子质量分别为19.8kD、18.9kD的融合蛋白,经Western blot鉴定为多囊蛋白-1的融合蛋白.这2段多囊蛋白-1氨基端的融合蛋白都可用于免疫动 物,制备抗多囊蛋白-1氨基端的融合蛋白都可用于免疫动物,制备抗多囊蛋白-1胞外区氨基端的抗体.二、抗多囊蛋白-1单克隆抗体和多克隆抗体的制备 .将纯化好的分子量18.9kD的多囊蛋白-1的融合蛋白皮下免疫Balb/C小鼠和新西兰大白兔,分别制备抗多囊蛋白-1的单克隆抗体和多克隆抗体.三、多囊 蛋白-1的组织细胞学定位和体液中多囊蛋白-1胞外段的定量检测.1.多囊蛋白-1在肾组织和细胞中的表达研究.2.体液中多囊蛋白-1胞外段的定量检测 .Qian等人最近提出多囊蛋白-1在G蛋白偶联受体的蛋白分解位点(多囊蛋白-1的GPS区)发生剪切,GPS区的蛋白分解剪切功能可能与多囊蛋白-1在肾脏 中的正常功能有关.按照这种理论,多囊蛋白-1虽不是分泌蛋白,但在体液中应该能检测到多囊蛋白-1的胞外区部分,而且正常人体液中的多囊蛋白-1含 量将高于ADPKD病人.由于体液中多囊蛋白-1的含量在ADPKD病人和正常人之间有显著差异,我们在设法探讨其发生机制的同时,正在考虑将实验条件、标 本处置及夹心ELISA方法技术进一步优化,将这一国内外首先的发现应用于ADPKD的临床诊断和鉴别诊断,这将具有非常现实的临床意义,可为临床提供 一种简单、方便、敏感和特异的诊断多囊肾病的理想方法.

4.期刊论文 李静.蔡芳.宋莉莉.高强 抗BSA多克隆抗体和单克隆抗体筛选及双抗体夹心ELISA法的建立与验证 -浙 江临床医学2009,11(9)
目的 建立高灵敏度检测生物制品中牛血清白蛋白(BSA)残留量的双抗体夹心ELISA法并验证.方法 筛选高亲和力、高纯度的抗BSA单克隆抗体作为包 被抗体,高纯度、高效价、特异性高的兔抗RSA多克隆抗体为酶标抗体,采用双抗体夹心ELISA法,以系列含量的BSA标准品作为标准,制作标准曲线,对样品 中所含BSA进行定量检测;并对该方法各项指标进行验证.结果 优化确定了ELISA试验条件,回归曲线相关系数r≥0.99;对BSA最低检测限为1.25ng/ml;准确 性试验回收率为90%~106%;精密性变异系数为6.1%~8.4%;与豚鼠、小鼠、兔、鸡血清均无交叉反应.结论 该方法线性好,特异性强,灵敏度高,准确性、 重复性和稳定性好.方法 可靠,易于操作,适用于生物制品的BSA残留量定量检测.

5.期刊论文 杨磊.张春明.郝建秀.佘义.王德芝.YANG Lei.ZHANG Chun-Ming.HAO Jian-Xiu.SHE Yi.WANG De-Zhi 人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体及多克隆抗体的制备 -生物技术通讯2010,21(4)
目的:以重组人心肌肌钙蛋白I(cTn I)为抗原制备鼠源单克隆抗体(McAb)及兔源多克隆抗体,并鉴定抗体的特性.方法:以纯化的重组人cTn I为抗原免 疫BALB/c小鼠,取鼠脾细胞同Sp2/0骨髓瘤细胞融合,利用选择培养基筛选融合的杂交瘤细胞,用有限稀释法分离获得能够稳定分泌抗cTn I的McAb阳性克隆 ,并利用体内诱生法大规模制备McAb,用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体;兔多抗制备以cTn I为抗原常规免疫后取其血清;用间接ELISA和Western印迹鉴定抗 体的性质.结果:经ELISA鉴定,筛选出5株能分泌cTn I McAb的杂交瘤细胞株,即C5B2、C5B3、C5B4、C5B1、B1A6,效价最高的B1A6株分泌的McAb为IgG3型 ,纯化后效价为1:10 000,亲和常数为1.08×10-9 mol/L,Western印迹鉴定表明cTn I McAb有良好的特异性;兔多抗纯化后的效价为1:8000.结论:制备了具 有良好特性的cTn I McAb和多克隆抗体.

6.期刊论文 万文徽.王青.李振甫.高学硕.鄂征.蔡红 抗p16单克隆抗体的制备及鉴定 -中国肿瘤临床2000,27(4)
目的:制备抗p16单克隆抗体并进行鉴定.方法:以p16合成肽为抗原免疫纯系小鼠.利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,并利用亲和层析等法纯化抗体.通 过酶免疫测定及免疫印迹等法对单克隆抗体进行分析及鉴定,并通过免疫组化方法与进口多克隆抗体进行比较.结果:获得4株稳定分泌抗p16单克隆抗体杂 交瘤株,与进口多克隆抗体比较,检测阳性及阴性符合率达100%.但使用单克隆抗体时,组织切片不需进行抗原修复,染色效果稳定.结论:抗p16单克隆抗体 的获得弥补了国内p16检测试剂的空白.

7.学位论文 张程 抗AKR1B10单克隆抗体的制备及初步应用 2009
醛糖还原酶相似蛋白(AKR1B10,ARL-1)属于醛酮还原酶超家族(AKRs),通过代谢醛、酮类产生醇发挥解毒功能。AKR1B10在许多正常组织中都不 表达,但在肝脏低水平表达。已有报道,AKR1B10在非小细胞肺癌异常高表达,吸烟史与AKR1B10的表达有相关性,在乳腺癌、直肠结肠癌、宫颈癌和口 腔癌等均发现AKR1B10高表达。目前关于AKR1B10与肝癌的关系报道很少。AKR1B10与多种肿瘤相关,但该分子表达与肿瘤发生发展的关系等还有待进一步 深入研究。因此,制备高特异性抗AKR1B10单克隆抗体有重要意义。本实验室主要从事肝癌发生发展的相关机制研究,为了进一步了解AKR1B10与肝癌的 关系,制备并纯化了抗AKR1B10的单克隆和多克隆抗体,并初步探讨其应用价值。 本研究通过原核表达并纯化AKR1B10全长蛋白。用纯化的AKR1B10-GST蛋白免疫新西兰白兔,获得多克隆抗体(PcAb),间接ELISA法测定多克隆抗体 效价为1:96000。用纯化的AKR1B10-GST蛋白免疫Balb/c雌鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体(McAb)。采用间接ELISA法对抗AKR1B10单克隆抗体进行 筛选,共获得15株稳定分泌抗AKR1B10抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为 1D2,1D6,1E4,2D8,3E2,4F8,5E3,5G12,10A2,1085,10D2,11B2,1287,12C3,12C12。制备并纯化了5株抗AKR1B10单克隆抗体 (1D6,1E4,2D8,5G12,10A2),经鉴定该5株抗AKR1B10单克隆抗体的Ig亚类均为IgG1,轻链属于κ型。用Western blot对这些单克隆抗体进行特异性 鉴定,结果均与AKR1B10-GST。特异性结合,而与AKR1B1-GST和GST蛋白无交叉反应。经Western blot技术检测10株肝癌及癌旁细胞系,AKR1B10在有相同 来源的高转移肝癌细胞系MHCC97H和低转移肝癌细胞系MHCC97L均高表达。提取24对肝癌及癌旁组织蛋白,Western blot检测,62%(15/24)的肝癌组织 存在AKR1B10的异常高表达。免疫组织化学法对9对肝癌组织切片染色,高、中、低分化程度的肝癌组织均存在AKR1B10蛋白的异常高表达。 综上所述,本实验获得了高特异性抗AKR1B10的单克隆和多克隆抗体,初步应用于肝癌组织和细胞的Western blot和免疫组织化学染色检测,提示肝 癌组织存在AKR1B10异常高表达,为进一步扩大临床样本,研究AKR1B10蛋白在肝癌组织中异常表达与肝癌分级、临床分期、大体分型的相关性,以明确 其是否可以作为肝癌分子标志物及用于早期诊断、治疗靶点的意义;研究AKR1B10表达上调对肝癌细胞系生物学性状的影响及意义等提供了可靠的工具。

8.学位论文 马春芳 尼克酰胺N-甲基化酶表达载体的构建、表达产物的分离纯化、及多克隆抗体的制备 2006
尼克酰胺N-甲基化酶(NNMT,EC2.1.1.1)是S-腺苷-L蛋氨酸(SAM)依赖的胞质酶,它以SAM为甲基供体,催化尼克酰胺和其他吡啶类物质形成吡啶盐类 物质。据文献报道,NMMT酶蛋白含量和mRNA水平在多种疾病中的明显增高,例如肾癌、帕金森病、甲状腺癌等。在肾透明细胞癌中,NNMT基因表达是正 常肾组织和其他亚型肾癌表达的三倍以上。在甲状腺癌中,几乎所有的乳头状甲状腺癌的NNMT蛋白及其mRNA水平都明显增高,但在滤泡状、未分化、髓 样甲状腺癌中却不明显。在帕金森病人的脑脊液中,NNMT蛋白含量明显高于正常对照组。目前检测NNMT的方法主要有放射性同位素酶化学法,免疫印迹 ,PROTEOMEX分析,高密度寡核苷酸微阵法等。这些方法存在易污染或费用昂贵或同位素废物处理等缺点不适应用于临床诊断。本实验的目的在于构建 NNMT的表达载体,表达正确的人NNMT蛋白,并制备其多克隆抗体,为下一步制备单克隆抗体及建立检测NNMT的ELISA法奠定基础。 目的利用pGEX-4T-2系统构建重组尼克酰胺N-甲基化酶(NNMT)表达载体,诱导表达并对表达产物进行分离纯化,制备多克隆抗体及纯化抗体。 方法根据NCBI核苷酸数据库编码为gi:12652950人NNMTcDNA序列,设计合成编码NNMT的DNA引物,并分别在5’端和3’端设计BamHI和XhoI位点。从 人肝脏组织中提取总RNA,进行RT-PCR获得NNMT基因。经T-A克隆至PGEM-T-Easy载体,经过BamHI/XhoI双酶切与同样经过双酶切的pGEX-4T-2连接。重组 质粒pGEX-4T-2/NNMT转化至大肠杆菌BL-21-STAR(DE3),重组菌经异丙基-β-D-硫代乳糖苷(IPTG)诱导表达,用GlutathioneSepharose4B亲和层析制备融 合蛋白GST-NNMT。通过DNA测序来证实质粒pGEX-4T-2/NNMT的正确性,SDS-PAGE电泳以及Western-blot判断GST-NNMT蛋白的准确性。纯化后的融合蛋白作 为抗原按常规方法免疫家兔,十周后收集兔血清,SAS沉淀法纯化IgG,用双向琼脂扩散和ELISA法测定多抗效价。 结果限制性内切酶和DNA测序结果表明,编码NNMT蛋白的DNA序列准确插入到pGEX-4T-2多克隆位点,成功构建表达质粒pGEX-4T-2/NNMT。菌液超声破 碎后,融合蛋白主要存在于裂解上清液中,表达量约占菌体总蛋白表达量的20%,每升菌液可表达融合蛋白约4.5mg。Western-blot证实制备的蛋白为

GST-NNMT。免疫兔血清用双向琼脂扩散检测抗血清的效价达到1∶16,用饱和硫酸铵(SAS)沉淀法纯化IgG后,用ELISA法测抗GST-NNMT多克隆抗体效价约为 103。结果表明,成功地利用基因重组技术制备了NNMT,制备分离纯化其多克隆抗体,为制备NNMT单克隆抗体和ELISA试剂盒打下基础。 结论1.成功构建表达质粒pGEX-4T-2/NNMT2.表达质粒能体外表达融合蛋白GST-NNMT,且表达产物主要存在于可溶性上清液中。 3.制备出抗GST-NNMT的多克隆抗体。

9.期刊论文 王彩霞.王国平.洪霓.姜波.刘辉.吴康为.WANG Cai-Xia.WANG Guo-Ping.HONG Ni.JIANG Bo.LIU Hui. WU Kang-Wei 柑橘衰退病毒多克隆和单克隆抗体的制备及检测效果分析 -生物工程学报2006,22(4)
通过改进提纯方法获得了柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)的提纯液,其产量为1mg/100g植物组织.用CTV免疫大耳白兔,获得多克隆抗体 ,间接ELISA效价为1:25 600.用CTV免疫小鼠,经细胞融合、ELISA筛选和克隆化培养,获得18株能稳定分泌抗CTV单克隆抗体的杂交瘤单细胞株.对其中4株 单克隆腹水抗体进行分析的结果表明,这些抗体的ELISA效价为1:51 200~1:204 800,其中2G和3H的抗体类型及亚类为IgG2a,1E和4H为IgG2b.用所制备抗 体对不同来源柑橘样品的CTV检测结果显示,单克隆和多克隆抗体结合使用,采用三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)可以获得理想的检测效果,其特异性强、灵 敏度高.同时发现所分析4株单克隆抗体对不同的CTV分离物鉴别能力存在差异,但有关这些CTV分离物的特性及其血清学关系还需进一步研究.

10.学位论文 周伟 新型肝癌标志物Glypican-3 ELISA检测方法的建立及临床应用 2007
目的:制备抗GPC3单克隆抗体和多克隆抗体,并建立GPC3 ELISA检测方法,探讨其在原发性肝癌血清学诊断中的应用价值。 方法:分别构建Glypican-3基因1333-1548 bp片段及73-1074bp片段的原核表达质粒pET22b-GPC3(1333-1548bp)和pProEX Hta-GPC3(73-1074bp),异 丙基硫代-β-d-半乳糖苷( IPTG) 诱导蛋白表达,并用Ni-NTA 树脂亲和层析柱纯化蛋白。利用纯化的GPC3蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的 脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经过HAT、HT选择培养及有限稀释法进行克隆化,制备抗GPC3的单克隆抗体,用ELISA、Western blot进行特性鉴定。化 学合成多肽GPC3-Ag1(73-86aa)CCSRKMEEKYQLTh和多肽GPC3-Ag3(382-396aa)ETLSSRRRELIQKLK,并分别与KLH偶联。利用偶联好的多肽GPC3-Ag1、 GPC3-Ag3及纯化的GPC3蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,制备抗GPC3的多克隆抗体。从上述多克隆抗体和单克隆抗体中通过不同的抗体组合检测阳性血 清和阴性血清筛选最佳配伍抗体;通过棋盘滴定法确定包被抗体的最佳包被浓度和检测抗体的最佳稀释度,根据上述实验选择最优条件建立双抗体夹心 ELISA方法。利用上述建立的ELISA方法,检测HCC、肝炎、肝硬化、其他恶性肿瘤肝转移患者及正常人血清,通过ROC曲线选择最佳诊断界值,探讨血清 GPC3在HCC诊断中的应用价值。最后我们检测了151例HCC患者血清AFP和GPC3水平,探讨联合检测GPC3+AFP在HCC诊断中的应用价值。 结果:获得11株抗GPC3(25-358aa)单克隆抗体,其中7株为IgG1亚型、4株为IgG2a亚型,轻链均为κ链。7株抗GPC3(444-516aa)单克隆抗体 ,均为IgG1亚型,轻链均为κ链。获得抗GPC3-Ag1,GPC3-Ag3,GPC3(444aa-516aa)三种多克隆抗体。经Western Blot证实获得单克隆抗体和多克隆抗 体均可以特异识别GPC3抗原。成功地建立了双抗体夹心ELISA定量方法,最低检测量为1.6ng/ml,并将其应用于肝癌病人血清GPC3抗原的检测。根据 ROC曲线结果,以30ng/ml为诊断界值,364例HCC患者中143例血清GPC3阳性,阳性率为39%;96例肝炎/肝硬化患者中6例血清GPC3阳性,阳性率为 6.3%;106例正常人中3例血清GPC3阳性,阳性率为2.8%, 统计学分析表明HCC患者血清和后两组血清GPC3含量有显著差异(P=0.000)。我们同时检测 了151例HCC血清的AFP和GPC3,结果发现单独以AFP为诊断指标时,HCC检出率为49%,单独以GPC3为诊断指标时,HCC检出率为40%,而AFP+GPC3联合诊 断时,HCC的检出率提高到72%。 结论:通过自行制备的抗GPC3单克隆抗体和多克隆抗体建立了双抗体夹心ELISA方法,该方法可以应用于肝癌病人血清GPC3抗原的检测。GPC3作为一 种新的肝癌标志物可以应用于HCC的血清学诊断,特别是联合检测AFP能够显著地提高HCC诊断率。

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