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植物染色体 Giemsa分带技术


安徽大学《细胞生物学》精品课程

实验十
一、实验目的

植物染色体 Giemsa 分带技术

1. 掌握植物染色体 Giemsa 的 C 带、G 带分带技术和方法。 2. 学习染色体带型分析方法。

二、实验原理
植物染色体显带是借助于特殊的处理程序后,进行 Giemsa 染色,

使染色体某 些结构成分发生特异反应而出现深浅不同的带纹,从而使核型分析中更准确地识别 染色体的每个成员以及其结构变异。通过改变 Giemsa 分带处理程序可产生不同带 型,因此有 C 带、G 带、N 带、Q 带、T 带等不同技术。 C 带(组成异染色质带):C 带技术是应用最广泛的技术,它主要显示着丝粒、 端粒、核仁组成区域或染色体臂上某些部位的组成异染色质而产生相应的着丝粒 带、端粒带、核仁组成区带、中间带等,这些带可以在一条染色体上同时出现,也 可以只有其中的一条或几条带。 G 带(Giemsa 带):显示染色粒,G 带分布于染色体的全部长度上。以深浅相间 的横纹形式出现。G 带能清楚地反映染色体的纵向分化,能提供较多的鉴别标志。 因此,G 带是分带技术中最有价值的一种。 R 带(反带):与 G 带相反的染色带.由于处理程序不同,染色体在同一部位染 色效果相反。 N 带:专一地显示出核仁组织区。 T 带:专一地显示出端粒区域。 以上几种带型在植物上应用最多的为 C 带和 G 带,本次实验主要介绍这两种 分带技术。

三、实验材料
(一)材料 大麦(Hordeum spp. 2n=14)的种子、 蚕豆(Vicia faba 2n=12)的种子、 洋葱(Allium cepa 2n=16)的鳞茎。以上材料可任选一种。

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(二)器材 培养箱、恒温水浴锅、分析天平、小台秤(200g) 、量简(50ml、100ml、1000ml、 10m1) 、烧杯(200m1) 、容量瓶(1000m1) 、棕色试剂瓶(200m1)、滴瓶、染色缸、 载玻片、盖玻片、显微镜、显微照相及冲洗放大设备、剪刀、镊子、刀片、滤纸、 玻璃板、牙签、切片盒。 (三) 试剂 Giemsa 母液、磷酸缓冲液、氯化钠、柠檬酸钠、甲醇、乙醇、冰醋酸、氢氧 化钡、秋水仙素或对二氯苯、α-溴萘、纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶、醋酸洋红、 45% 醋酸等。

四、实验操作
(一)C 带技术 1. 染色体标本制备 法,这里仅介绍压片法。 (1)取材和预处理 取材和预处理的操作方法与常规压片技术相似,但要比 染色体制备方法可采用常规压片技术, 也可采用去壁低渗

常规制片严格。预处理药物对 C 带无影响,可选用任一种药品,但要注意染色体的 缩短程度要适宜,太短,会使一些邻近的带纹融合,染色体缩短不够,则会造成染 色体不易分散,带纹难以辨认。总之,要求材料生长状况良好,中期分裂相多,预 处理适宜。预处理时间和浓度因材料不同有所变化,下表 1 提供参考数据: 表1 材料 普通小麦 洋葱 蚕豆 大麦 表 3-5 以上处理时的温度是 25oC 左右,对于禾本科植物利用 O~4oC 低温处理 24h, 效果也佳。 (2)固定 利用新配制的乙醇-冰醋酸(乙醇:冰醋酸=3:1)固定液固定 2~24h,使 预处理时间和浓度因材料不同的参考数据 饱和对二氯苯 4h 4h 4h 4h 秋水仙素 0.1%,3h O.2%, 4h 0.2%, 4h 0.05%, 3h

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染色体充分凝固和硬化以避免以后的盐、酸解离对染色体造成破坏。若用去壁低渗 法,在 3~10 oC 下用甲醇-冰醋酸固定 30~60min。分带的材料要求新鲜。因此, 固定后的材料最好及时制片、 分带, 若需要保存, 可及时转入 95%乙醇中低温保存, 但保存时间仍不宜太长,否则对分带不利。 (3)解离 在分带技术中,解离条件不同,对以后染色体的显带有直接影响。

材料不同解离条件也不同,注意如选用酶解法,需要将固定材料用蒸馏水洗 30min 后解离。下表 2 解离条件可供选择。 表2 试验材料 不同材料的解离条件 解离方法

洋葱、蚕豆 0.1mol/L HCl 60℃解离 8~10min 蚕豆 先用 20~25℃的 45%冰醋酸浸泡 2~3h,然后在 55℃的 45%冰醋酸 中保温 15min 大麦、小麦 1mol/L HCl 60℃解离 13~15min,或 25℃2.5%纤维素酶果胶酶解离 3.5h。 2. 制片 基本操作方法与常规压片相同,但要求所用的载片、盖片十分洁净,

以防止在以后的高温、流水冲洗等一系列处理中脱落。 将材料的分生组织部分放在载片上,加 1 滴 1%醋酸洋红(或 45%醋酸),用镊 子将材料压成小碎片,加盖玻片,再用牙签轻轻敲打盖片,使细胞分散均匀,然后 用铅笔的橡皮头重敲压紧,尽可能使染色体从细胞壁中散出以利于显带,同时,重 敲压紧还可以使染色体与玻片的粘着力增强,减少分带处理过程中材料的脱落。用 45%醋酸压片镜检时,需要把聚光器下降或缩小光圈,使视野稍暗以加大染色体反 差,便于识别染色体。通过镜检选出分裂相多而染色体又分散完整的制片用冷冻机 或在冰箱的冷冻室冷冻后,将盖片揭开。为除去细胞质对显带的影响,揭开盖片后 可将盖片和载片置于 60~80oC 的电热板上,使有细胞的一面朝上,迅即加几滴新 配制的甲醇一冰醋酸固定液重新固定 1~2min。经染色的制片可在分带处理的前一 天进行脱色处理,方法是将制片放入固定液中 8~10min 就可将染料褪净。 3. 脱水脱酸、空气干燥 由于 Giemsa 染料是一种复合染料,遇酸,红色染料

会发生部分沉淀,使材料染成蓝绿色而不能显带,因此必须把酸脱净。具体步骤:

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把染色体标本放入 95%、 %、 95 100%、 100%乙醇中逐级脱水脱酸, 每级 10~15min, 然后将制片放入切片盒中盖严,置室温下空气干燥。通常脱水后的片子不能很好地 显带,需要放置一段时间后才能显带,这一过程称为“成熟”。干燥时间长短常因植 物种类不同略有差异,一般干燥 24~48h,即可正常显带。而洋葱对干燥时间要求 较严,干燥 24h 后可显示端带,干燥 15d 可同时显示端带、中间带、着丝粒带、干 燥半年后则整个染色体模糊。不同的材料,用不同的显带方法所需空气干燥的时间 也不同。下表 3 空气干燥条件可供选择。 表3 材料 小麦 大麦 洋葱 蚕豆 4. 分带处理 (1) BSG 法(Ba(OH)2-2×SSC-Giemsa 法) BSG 法是目前植物染色体 C 带的主 要方法。具体操作如下所述:将干燥后的染色体标本片子放入新配的 5~8%或饱和 的 Ba(0H)2 水溶液的染色缸中于室温下处理 5~10min(蚕豆 5 min, 大麦 60-80 min), 然后将染色缸连同制片移至水龙头下放水将染色缸内 Ba(OH)2 溶液全部冲洗干净, 1~2 min 后换入蒸馏水中静置,每隔 4-5min 换水 1 次,共 5~6 次约 30 分钟,以 保证制片不受污染。冲洗干净之后,最好再把制片放在 37oC 恒温箱中干燥 30 min。 干燥后的制片放入 60oC 的 2×SSC(pH7.O)中处理 1~2h,然后用 60oC 蒸馏水换入 洗 10~30 min,室温下干燥 1h 后用新配制的 1~2%Giemsa 溶液染色。为防止染 色液的沉淀物污染制片,染色时可在一块洁净的玻璃上根据制片的大小放置两根牙 签,将制片有材料的一面反扣在牙签上,使制片与玻璃板之间有空隙,然后用滴管 吸取染色液从旁边滴满空隙进行染色,染色时间 1~2h。若用 5-10%Giemsa 染色, 需 10 min 左右。 染色完的片子经蒸馏水冲洗、 空气干燥后用中性树胶封片。 Giemsa 染色的片子可以长期保持不褪色,观察十分方便。 (2) HSG 法(HCl-2×SSC-Giemsa 法) 这种方法是用 HCl 代替 Ba(OH)2 的处理 不同材料的空气干燥条件 BSG 法 24~15d 4~7d 3d 以上 1d~1.5m HSG 法 12h~7d 48h~7d 5d~2m 7h~72h

流程,操作与 BSG 相似。将干燥后的制片室温下放入 O.2mol/L HCl 中处理 30~

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60min(蚕豆 60~80 min,大麦 60min),蒸馏水冲洗。其它步骤同 BSG 法。 (3)胰酶-Giemsa 法 将干燥制片放入 pH7.2 的磷酸缓冲液中浸泡 30 min,转

入用以上缓冲液配制的 O.025%胰酶溶液中室温下处理 15~30 min,然后用蒸馏水 冲洗几次制片,再用 10%Giemsa(pH7.2)染色 10~15 min。水冲洗,空气干燥, 中性树胶封片。 (二) G 带技术 G 带显示的是染色体自身固有结构,能否显示出来,与染色体的处理技术密 切相关,因此,G 带技术要求比 C 带严格。目前 G 带已在许多植物上成功显示,但 其中稳定性、重复性高的是玉米 G 带技术。下面介绍 ASG 分带技术(醋酸 -2×SSC-Giemsa)。其流程如下: 1. 发根 将玉米材料在室温下(25-27oC)发根,待根长到 O.5~1.5cm 时,转入 切取根尖分生组织 O.2mm 用新配制的饱和 α-溴萘 28oC 下预处理 6~8oC 左右低温下处理 20-40h。 2. 预处理 3.5 小时。 3. 低渗 4. 固定 5. 水洗 6. 酶解 7. 固定 8. 制片 用 0.075mol/L KCl 室温下处理 30 min。 用新配制的甲醇-冰醋酸(3:1)固定液在室温下固定 30 min。 固定后的根尖用蒸馏水洗 30 min。 用 2%的纤维素酶和 2%果胶酶混合溶液(1:1)室温下处理 3.5h。 倒去酶液,再加入固定液置冰箱(0~4oC)中过夜。 取再固定后的根尖置于洁净的载片上,加上固定液用镊子捣碎涂布,

并轻轻吹气,促使细胞迅速分散,然后在酒精灯的火苗上迅速掠过 2~3 次,烤片, 以利染色体分散,最后将制好的片子在 90oC 的烘箱中烘烤 50 min。 9. G 带处理 水 将干燥的片子放入 60oC 2×SSC(pH7.35)盐溶液中处理 40min,

洗后随即用 0.066mol/L 的磷酸缓冲液稀释到 40-50:1 的 Gimesa 染液(pH6.8)染色 40 min。染完色的片子用蒸馏水淋洗掉染液,于室温下干燥。 10. 带型分析 植物染色体带型目前尚无统一的国际化标准,实验者可根据自

己的需要对记录分析的结果进行比较分析不同材料间带型的区别,在染色体水平上 分析染色体类型和生物的遗传结构,从而比较不同材料之间在遗传上的异同。一般 可参照以下步骤进行:

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(1) 核型分析 选择染色体数目完整,长度合适,分带清晰的材料制片进行

显微摄影,冲洗放大、核型分析。 (2) 描述带型 对各条染色体的带纹位置、宽窄、深浅、形状等进行描述。

(3) 绘制模式图 在各条染色体模式图上标出各条带纹的位置、宽窄、深浅、 形状等线条。

五、作业
1. 制备一张质量较高的 C 带或 G 带制片。C 带、G 带显带正常的表现:染色 体带纹呈深红或紫红色,非带区为淡红色,呈透明或半透明状,细胞质不染色,间 期核中的染色中心清晰可见,甚至有时可以准确计数。C 带、G 带之间的差异表现 在 G 带比 C 带的带纹数目明显增多,G 带带纹分布于整个染色体上。 2. 对实验材料进行带型分析。


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