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SDS-PAGE自制胶操作规程


SDS-PAGE自制胶操作规程 自制胶操作规程
一:试剂准备
SDS-PAGE 电泳所用溶液: 电泳所用溶液 30 %聚丙烯酰胺溶液 (100 mL) 聚丙烯酰胺溶液 丙稀酰胺(Arc)29.2g,N-N-甲叉双丙稀酰胺(Bis)0.8g,加入去离子水定容至 100mL, 过滤于棕色玻璃瓶中 4℃贮存。将商品用的 40 %聚丙烯酰胺溶液稀释到浓度为 30 %,

冰箱 4℃保存。 分离胶缓冲液 1.5mol/L Tris·HCl,pH8.8:23.23gTirs 碱,溶于 80mL 去离子水中, , : 加入盐酸调节 pH 值至 8.8,定容至 150mL。 浓缩胶缓冲液 0.5mol/L Tris·HCl,pH6.8: 6.0gTirs 碱,溶于 60mL 去离子水中, , : 加入盐酸调节 pH 值至 6.8,定容至 100mL。 10%SDS:2gSDS 溶于去离子水中,定容至 20mL,加热至 68℃助溶。 % : 10%过硫酸铵:0.1g 过硫酸铵,溶于 1mL 去离子水中;现配现用或分装冷冻备用。 %过硫酸铵: TEMED(N-N-N`-N`-四甲基乙二胺 原液 原液,室温保存。 -四甲基乙二胺)原液 1×Tris-甘氨酸缓冲液 (1 L) 甘氨酸缓冲液 Tris 碱 甘氨酸(电泳级) SDS 2×SDS 凝胶还原型加样缓冲液 凝胶还原型加样缓冲液(5mL) 还原型加样缓冲液 0.25 mol/L Tris-Cl (pH 6.8) SDS 甘油 β-巯基乙醇 (DTT(二硫苏糖醇) 溴酚兰 双蒸水 考马斯亮蓝染色液 考马斯亮蓝 R-250 甲醇 冰醋酸 ddH2O 考马斯亮蓝脱色液(甲醇脱色液效果好,但有毒性) 考马斯亮蓝脱色液(甲醇脱色液效果好,但有毒性) 450mL 乙醇(甲醇) 冰醋酸 ddH2O PH7.4PBS(0.01M)1L ( ) KH2PO4 Na2HPO4 NaCl
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3.03 14.4g 1g 1 mL 0.25g 0.189g 2.5ml 0.385g 0.001g 定容到 5ml 1.0g 450 mL 100 mL 450 mL 450mL 100mL 450mL 1 mL 0.25g 0.189g

KCl

2.5ml

二:凝胶配置

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1.将短玻璃板放在带有边条的长玻璃板上,做成玻璃板夹心。玻璃板应保持干燥洁 净。 2.将玻璃夹心放入灌胶架,短玻璃板冲前。两块玻璃板底部齐平。 3.锁紧夹子(绿色) ,夹紧玻璃板夹心,做成灌胶模块。 4.把灰色的橡胶垫放在灌胶架底部,将灌胶模块放在灰色的胶垫上,灌胶架上部一 透明夹子,用此夹子夹住长玻璃板。 5.配制凝胶,以下为常用的SDS-PAGE凝胶体系 分离胶: 12% 15% H2O 3.4 ml 2.4 ml 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 2.5ml 2.5 ml 10% (w/v) SDS 0.1 ml 0.1 ml 30 %聚丙烯酰胺溶液 4.0 ml 5.0 ml 10% (w/v) (APS) 0.05 ml 0.05 ml TEMED 0.005ml 0.005ml 浓缩胶 (5%): H2O 2.8 ml 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 1.25 ml 10% (w/v) SDS 0.050 ml 30 %聚丙烯酰胺溶液 0.9 ml 10% (w/v) (APS) 0.025ml TEMED 0.004 ml 先按顺序加入各项试剂配好分离胶后,倾斜模具,灌胶至距离梳齿下端0.5-1cm处, 从两端用去离子水缓慢压平,放置到37℃恒温箱半个小时凝胶后,倒掉去离子水, 残余的水用滤纸条吸干净;再按顺序加入各项试剂配制浓缩胶,灌满模具缓慢插入 梳子,注意不要产生气泡。

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6.凝胶凝固后,取出梳子,加入准备好的样品。把玻璃板夹心(凝胶)从灌胶架上 取下。 7.把玻璃板夹心放入电泳架,短玻璃板面冲里,做成电泳模块。 8.把电泳模块完全插入电泳架。 9.合上电泳架上的密封夹。如只跑一块胶,在另一侧放入随仪器配的挡板;在装配 的过程中,会觉得很紧,为正常现象。 10.将整个装配好的电泳架放入电泳槽。 11.样品处理以干扰素为例:
离心菌种: 离心菌种: 菌种

离心后的菌体,加入200ul的PH7.4的PBS溶解,超声清洗仪内超声20min后冻存于 -20℃冰箱,如此反复三次后取20?l加入2*还原型上样缓冲液20?l,混匀沸水水浴十 分钟,上样10ul每孔。
发酵离心菌体,发酵下罐离心菌体: 发酵离心菌体,发酵下罐离心菌体: 离心菌体 离心菌体

离心后的发酵液,加入原始体积7倍的PH7.4的PBS溶解,超声破碎仪内超声10min (超声一秒停顿五秒)后,取20?l加入2*还原型上样缓冲液20?l,混匀沸水水浴十 分钟,上样10ul每孔。
下罐离心菌体: 下罐离心菌体:

离心后的菌体,于电子天平内精密称量0.1±0.01g,加入3.5ml的PH7.4的PBS溶解,超 声破碎仪内超声10min(超声一秒停顿五秒)后,取20?l加入2*还原型上样缓冲液 20?l,混匀沸水水浴十分钟,上样10ul每孔。
包涵体,洗涤包涵体: 包涵体,洗涤包涵体:

于电子天平内精密称量0.02-0.03g包涵体,加入1ml的8M的尿素溶解,若不溶解可滴 加6M的NaOH促进溶解,溶解后的包涵体用8M的尿素稀释6倍后,取20?l加入2*还 原型上样缓冲液20?l,混匀沸水水浴十分钟,上样10ul每孔。 12.加入电泳液,内槽加入新配制电泳液,外槽为循环用电泳液,内槽没过短玻璃 板,外槽按照电泳槽的上的指示加至合适的刻度。 13.盖上电泳槽的盖子,将电泳电极和电泳仪相连接,正极对正极,负极对负极(红 对红,黑对黑)。 14.在电泳仪上设定电泳电压或电流,开始电泳。 一般进行SDS-PAGE一块胶电泳时可使用11mA 恒流浓缩、 22mA恒流分离的电流体 系,大约60min 能完成电泳;进行SDS-PAGE两块胶电泳时可使用20mA 恒流浓缩、 40mA恒流分离的电流体系,大约60min 能完成电泳,具体条件根据样品摸索。 15.电泳完成后,关闭电泳仪,拔出电极线。 16.打开盖子,取出电泳模块,打开密封夹,取出玻璃板(凝胶)。轻轻用撬胶板 (绿色)撬开玻璃板,让凝胶滑入染色液中。 17.清洗电泳槽,玻璃板。

注意:丙烯酰胺为神经毒剂,电泳操作全部过程应戴 手套操作 手套操作! 注意:丙烯酰胺为神经毒剂,电泳操作全部过程应戴PE手套操作!
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四:常见问题
Q:提高 SDS-PAGE 电泳分辨率的途径? : 电泳分辨率的途径? A:1、聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率。建议做法:待凝胶在室温凝 固后,可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或 4℃冰箱放置,前者易导致凝 固不充分,后者可导致 SDS 结晶。一般凝胶可在室温下保存 4 天,SDS 可水解聚丙 烯酰胺。 微笑”(两边翘起中间凹下)形带原因? Q:“微笑 (两边翘起中间凹下)形带原因 : 微笑 A:主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致,多出现于较厚的凝胶中。 处理办法:待其充分凝固再作后续实验。 Q:“皱眉 (两边向下中间鼓起)形带原因? 皱眉”(两边向下中间鼓起)形带原因? : 皱眉 A:主要出现在蛋白质垂直电泳槽中,一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 处理办法:可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡。 Q:为什么带出现拖尾现象? :为什么带出现拖尾现象? A:主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理办法:加样前离心;选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂;电泳缓冲液 时间过长,重新配制;降低凝胶浓度。 Q:为什么带出现纹理现象? :为什么带出现纹理现象? A:主要是样品不溶性颗粒引起的。 处理办法:加样前离心;加适量样品促溶剂。 Q:什么是 鬼带 ,如何处理? 鬼带”, :什么是“鬼带 如何处理? A:“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时,常会出现在泳道顶端(有时 在浓缩胶中)的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀,主要由于还原剂在加热 的过程中被氧化而失去活性,致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重 新缔合,聚合成大分子,其分子量要比目标条带大,有时不能进入分离胶。 处理办法:在加热煮沸后,再添加适量的 DTT 或 β-巯基乙醇,以补充不足的还原 剂;或可加适量 EDTA 来阻止还原剂的氧化。 Q:为什么溴酚蓝不能起到指示作用? :为什么溴酚蓝不能起到指示作用? A:我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象。主 要与缓冲液和分离胶的浓度有关。 处理办法:更换正确 pH 值的 Buffer;降低分离胶的浓度。 Q:为什么电泳的条带很粗? :为什么电泳的条带很粗? A:电泳中条带很粗是常见的事,主要是未浓缩好的原因。 处理办法:适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的 pH 正确(6.8);适当降低 电压; Q:为什么电泳电压很高而电流却很低呢? :为什么电泳电压很高而电流却很低呢? A:这种现象一般初学者易出现。比如电压 50v 以上,可电流却在 5mA 以下。主要 a.内外槽装反; b.外槽液过少; 是由于电泳槽没有正确装配, 电流未形成通路。 包括:
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处理办法:电泳槽正确装配即可。 Q:浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗? :浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗? A:前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致;后者是由于在解除制胶的夹子 后,板未压紧而致空气进入。一般对电泳不会有太大的影响。

五:灰度扫描及计算
打开桌面上的Gel-Pro Analyzer软件 File—open打开需要处理的凝胶图片

转换图片为灰色图片并放大Convert to—Gray Scale Zoom—Zoom 25%

点击上方工具栏里的Image enhancement调节凝胶图片的背景及条带至合适程度

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点击上方工具栏里的View 1D-Gel ToolBar—单击Lanes/Bands

单击Add Lanes—移动鼠标添加所要处理的泳道—添加完毕后单击OK

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鼠标移至泳道上端和下端,拉动上下边缘将泳道调节至合适长度;鼠标移至泳道左 端和右端,拉动左右边缘将泳道调节至合适宽度,将所有条带和每一条带的每一部 分都包括进去

单击Delete Bands –鼠标箭头移动至所要删除的条带后变为十字光标—单击删除条 带---完毕后点击Ok

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单击Add Bands –鼠标箭头移动至所要添加的条带后变为条带框, 单击选中条带—完 毕后点击Ok

点击左下角的Lane Profile –在对话框中Plot一栏选中所要编辑条带的泳道—单击 Baseline—Filtered Profile后—在弹出的对话框中输入基线参数,一般为0-50
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移动Lane Profile图片中黑色框两端,将对应的条带包括进去至合适程度(移动杂带 的两端使计算时尽量少的计算背景面积)
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调节条带完毕后,点击1DGel栏中的Mass/IOD--点击左下角的 Amounts/Mol.Weights—选中IOD—用目的蛋白的面积值除去该泳道中所有蛋白的峰 面积值即目的蛋白纯度

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