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农杆菌介导的玉米遗传转化及再生体系的建立


农杆菌介导的玉米遗传转化及再生体系的建立 农杆菌介导的玉米遗传转化及再生体系的建立 介导的玉米遗传

摘要: 本研究选用玉米自交系 178, 昌 摘要 为了建立玉米高频再生及高效遗传转化体系, 72,郑 58,H736760A,MQ704,2193 为材料,对影响玉米成熟胚愈伤组织诱导、继 代培养及分化的因素进行了研究。结果表明:高浓度的 2,4-二氯苯氧乙酸

(2,4-D) (4.0mg/L)是诱导愈伤组织必须的;在继代培养基中添加适量的 2,4-D(2.0mg/L) 、 6-苄基嘌呤(6-BA)(0.2mg/L)和硝酸银(AgNO3) (10mg/L)能显著增加胚性愈伤组 织的形成;在分化培养基中添加 0.5mg/L 6-BA 有利于提高愈伤组织的分化频率。这 个体系的建立,为以成熟胚为受体系统的遗传转化体系奠定了基础。 关键词: 关键词: 玉米;成熟胚;愈伤组织;转化;植株再生

Establishment of transformation system and regeneration system of maize mediated by Agrobacterium tumefaciens
Abstract: In order to establish the system of high-frequency regeneration and high-efficiency genetic transformation in maize, the inbred line 178, Chang72, Zheng58, H736760A, MQ704, 2193 have been chosen to study on initiation, maintenance and differentiation of calli in this paper. The results showed that inclusion higher concentration of 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D, 4.0 mg/L) into induction medium was a critical factor for producing primary calli. Supplement with optimal level of 2,4-D(2.0 mg/L), 6-Benzylaminopurine(6-BA, 0.2 mg/L)and silver nitrate(10 mg/L)in the subculture medium significantly promoted the formation of embryogenic calli. And the addition 0.5 mg/L of 6-BA into regeneration medium has significantly increased the frequency of plant regeneration. This efficient regeneration system provides a solid basis for genetic transformation of maize. Key words: Maize; Mature embryo; Calli; Transformation; Plant regeneration

农杆菌介导的玉米转化及再生体系的建立

摘要 ABSTRACT

目录
1 序言 .................................................................. 4 2 玉米再生及基因转化体系的研究 .......................................... 4 2.1 玉米再生体系的发展历程 ............................................ 4 2.2 玉米再生及基因转化体系的材料选择 .................................. 4 2.3 玉米再生体系的影响因素 ............................................ 4 2.4 玉米遗传转化的发展过程 ............................................ 5 2.5 玉米遗传转化方法 .................................................. 6 2.5.1 电激法 ......................................................... 6 2.5.2 花粉管通道法 ................................................... 7 2.5.3 PEG 法 .......................................................... 7 2.5.4 基因枪法 ....................................................... 7 2.5.5 农杆菌介导法 .................................................... 8 2.6 玉米再生及遗传转化的常用受体 ...................................... 9 2.6.1 愈伤组织再生系统 ................................................ 9 2.6.2 原生质体再生系统 ................................................ 9 2.6.3 种质系统 ........................................................ 9 2.6.4 直接分化再生系统 ................................................ 9 2.7 本实验研究内容 ................................................... 10 玉米成熟胚再生体系的建立................................ ............................................ 3 玉米成熟胚再生体系的建立............................................ 11 3.1 材料与方法 ....................................................... 11 3.1.1 材料 .......................................................... 11 3.1.2 实验方法 ....................................................... 11 3.1.2.1 外植体的选择与预培养 ........................................ 11 3.1.2.2 愈伤组织的诱导 ............................................... 11 3.1.2.2 胚性愈伤组织的形成及愈伤组织的继代 .......................... 12
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3.2 结果与分析 ....................................................... 12 3.2.1 玉米种子的预培养 ............................................... 12 3.2.2 愈伤组织的诱导 ................................................. 13 3.2.3 胚性愈伤组织的形成 ............................................ 15 3.2.4 AgNO3 对胚性愈伤组织形成的影响 ................................. 15 3.2.5 愈伤组织的分化 ................................................. 15 3.3 结论与讨论 ...................................................... 16 ..................................... 4 农杆菌介导的玉米转化体系的建立 ..................................... 18 4.1 材料与方法 ....................................................... 18 4.1.1 材料 .......................................................... 18 4.1.2 培养基配制 .................................................... 18 4.1.3 转化方法 ....................................................... 19 4.1.3.1 侵染液的准备 ................................................ 19 4.1.3.2 侵染 ........................................................ 19 4.1.3.3 抗性愈伤的筛选 .............................................. 19 4.2 结果与分析 ...................................................... 19 ........................................................... 5 参考文献 ........................................................... 22 ............................................................... 6 致谢 ............................................................... 24 ................................................................ ................................. 附录 ................................................................. 25

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1 序言
玉米是早熟禾科(Poaceae)玉蜀黍族(Maydeae)一年生谷类植物,学名 Zea mays, 起源于北、中、南美洲。植株高大,茎强壮,挺直。叶窄而大,边缘波状,于茎的两 侧互生。雄花花序穗状顶生。雌花花穗腋生,成熟后成谷穗,玉米具粗大中轴,小穗 成对纵列后发育成两排籽粒。谷穗外被多层变态叶,称作包皮。籽粒可食。 玉米作为重要的粮食作物之一,已成为转基因研究的主要对象。其遗传转化受体 系统的研究,亦已受到各国学者的广泛关注。利用基因工程开展玉米育种,首先应建 立受体植株的高频再生体系,因为玉米不同的基因型,甚至不同的外植体,其再生能 力都存在极大的差异。 高效的玉米组织培养和植株再生体系的建立为玉米遗传转化和 细胞工程研究创造了有利条件。因此,玉米优良品系再生体系的建立是玉米分子设计 育种的基础。

2 玉米再生及基因转化体系的研究 玉米再生及基因 基因转化体系的研究
2.1 玉米再生体系的发展历程 玉米再生体系的发展历程
玉米组织培养技术得到很大发展, 为玉米遗传转化提供了大量可供选择的受体系 统。在研究中发现,外植体的来源部位、生理状态和基因型等因素对胚性愈伤组织的 诱导和植株再生有较大影响。 1975 年 Green 和 Phillips 利用玉米幼胚作为外植体诱 自 导出了二倍体愈伤组织并成功获得再生植株以来,利用玉米花药、雌雄幼穗、胚叶等 多种外植体诱导出愈伤组织,其中幼胚是目前使用最多的外植体。

2.2 玉米再生及基因转化体系的材料选择 玉米再生及基因转化体系的材料选择
玉米幼胚作为外植体取材受到地理条件、 季节和发育阶段的严格限制。 相比之下, 成熟胚取材方便,不受时间和数量的限制,是一种较理想的培养材料。Green 等首次 报道利用成熟胚可以诱导愈伤组织,但没有再生植株;Wang 和 Huang 通过改进培养 基配方成功获得再生植株。玉米成熟胚诱导愈伤组织具有很强的基因型依赖性,再生 频率较低,因此开展更深入的研究,建立成熟胚再生体系将是十分有意义的。

2.3 玉米再生体系的影响因素 玉米再生体系的影响因素
玉米组织和细胞的培养主要采用 MS 和 N6 培养基,二者对于不同品种和品系玉
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米愈伤组织的植株再生影响不同。MS 与 N6 的主要区别在于氮源的形式不同。此外 激素的选择也影响愈伤组织的生成,2,4-D 是影响组织脱分化的关键因素,较高浓度 的 2,4-D(1 ~ 2mg/l)诱导外植体脱分化产生愈伤组织,降低或不加 2,4-D 愈伤组织 才能分化出完整的胚状体并在生出小植株。

2.4 玉米遗传转化的发展过程
1987 年, Grimsley 等首先用胭脂碱农杆菌 C58 将玉米条纹病毒(Maize Streak Virus) 的 cDNA 转化玉米幼苗分生组织或靠近生长点的部位, 98%的玉米叶片表现了病毒感 染性状,说明 T-DNA 已经转化到玉米细胞中,从而给农杆菌介导的玉米遗传转化带 来了一缕曙光。Schalappi 等[1]用同样的方法侵染 A188、W23 等玉米幼胚,经过扫描 镜观察也得到了类似的结果。Gould 用含有普通双元载体的农杆菌侵染玉米 Funk's G90 的茎尖获得了转基因玉米,并且外源基因已整合并遗传到 R1 代,但其稳定性效 果欠佳。 农杆菌侵染单子叶植物的第一个比较成功的例子来自于 Chan 和 Hiei 的研究, 他 们首次用农杆菌转化水稻的未成熟胚获得了外源基因能稳定遗传的转基因水稻。 农杆 菌介导的玉米遗传转化随后也取得了重大进展。1996 年,Ishida 等[2]用含有 A281(对 高等植物侵染力很强的菌株)VirB、 VirC、 VirG 基因的超双元载体 pSB131 和 pTOK233 转化 A188 及其杂交种的未成熟胚,转化频率高达 5% ~ 30%。同时外源基因能稳定 整合和表达, 并且 70%的转基因玉米可育。 这个实验有力地说明农杆菌对单子叶植物 和双子叶植物具有相同的转化机制,是玉米遗传转化过程中的一个里程碑。其后用超 双元载体分别转化 A188 和 Hi II 也得到类似的结果。此后玉米农杆菌转化的研究主 要以优化转化条件, 提高转化效率为主。 其中最值得关注的是 Frame 等用普通双元载 体 pTF102 转化 Hi II 的未成熟胚,在 L-半胱氨酸存在的条件下平均转化效率高达 5.5%,Southern blot 和分子鉴定 R0、R1、R2 代转基因玉米表明 GUS 和选择标记基 因 bar 已稳定整合到玉米基因组中并表达。虽然普通双元载体的转化效率(5.5%)远远 低于超双元载体的转化效率(33% ~ 51%),但普通双元载体的普遍应用使得用这种载 体进行农杆菌转化具有更大的潜力。 农杆菌与外植体共培养条件的优化、提高 Vir 基因表达条件的优化和使用毒性更 低的标记基因将会是提高玉米农杆菌普通双元载体转化效率的重点。 外植体取材的季
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节限制也一直是玉米遗传转化的限制因素,让人高兴的是这种局限性正在逐渐减少。 最近, Sidorov 等用农杆菌介导法对 7 ~ 10 d 玉米幼苗诱导的 I 型愈伤进行转化, 转化 频率为 2% ~ 10%。同时由于这些转基因后代拷贝数低并符合孟德尔遗传规律,因此 这种方法可以代替未成熟胚诱导愈伤组织进行转化。Wang 等用农杆菌转化受伤的玉 米籽粒也获得了较理想的转化频率,由于这种方法受体材料取材简单方便,因此也是 一种很有希望的方法。Vega 等尝试用低盐的 N6 培养基配合使用二硫苏糖醇和 L-半 胱氨酸转化 Hi II 玉米,发现能比较显著的提高普通双元表达载体的转化频率,平均 转化频率最高达到 18%。 国内对农杆菌介导的玉米遗传转化起步较晚, 黄璐和卫志明首次报道用农杆菌转 化法获得了杂交种苏玉 1 号的转基因玉米,张荣等用此方法获得自交系 P9 ~ 10 的转 基因玉米。权瑞党等报道将农杆菌侵染和真空渗入、部分酶解及超声波处理等方法相 结合,转化玉米愈伤组织得到了转基因植株。 近年来,Huang 等报道用菌株 EHA105 介导玉米优良自交系幼胚转化,得到了比 较理想的结果,转化效率平均达到 23.8%。Yan 等通过嘌呤、嘧啶抑制剂和表面活性 剂 Silwet L-77 处理提高了农杆菌对掖 515 和齐 319 的转化频率。

2.5 玉米遗传转化方法
2.5.1 电激法
电激法转化外源基因是用短时、 高脉冲电处理细胞, 使细胞膜出现可恢复性孔隙, 从而产生新的渗透点(3 ~ 4 nm) ,为外源 DNA 进入细胞提供了通路。该方法最早应 用于动物细胞。 Fromm 等用电激法转化玉米原生质体, 得到了转化愈伤组织。 Rhodes 等用电激法转化玉米原生质体,首次获得了完整的转基因植株。近年来,人们又将原 来用于原生质体转化用的电激法用于完整细胞的转化,分别以幼胚、愈伤组织和胚性 悬浮细胞系为受体,并且获得了转基因植株。D′HallumK 等以玉米幼胚和Ⅰ型愈伤组 织为受体, 用电激法导入 neo (neomycin phosphotransferase) 基因, 获得了可育的转基 因植株,而且 neo 基因能稳定地遗传给后代。Laursen 等通过电激法导入 bar 基因, 也获得了可育的转基因玉米。柯遐义[3]等利用自制的脉冲式放电电激仪,以具有再生 能力的玉米幼胚作受体,成功地将外源基因导入玉米的幼胚细胞并获得转基因植株。 电激法不受宿主限制,可以用于原生质体、愈伤组织、胚性悬浮细胞系、幼胚等,操
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作简单,但转化效率低,在玉米遗传转化技术研究初期应用较为广泛。

2.5.2 花粉管通道法
花粉管通道法是在植物整体水平进行目的基因 DNA 片段的导入, 直接获得转化 种子,通过后代的筛选获得带有目的基因的片段。由于其利用自身的生殖系统作为载 体,被众多研究者采用。1986 年 Ohta 在美国科学院院报(PNAS) 上报道,应用外源 DNA 与玉米花粉混合授粉,F0 代种子的转化率高达 10%。丁明忠利用花粉管通道法 和减压渗透法将大豆总 DNA 导入玉米自交系 4822 和 S37,在 743 份后代材料中筛 选出 8 份高蛋白含量变异材料。 关淑艳等利用花粉管通道技术将淀粉分支酶基因的反 义表达载体转入玉米自交系中,通过 PCR 检测得到转基因的种子,同时探讨了不同 导入时间、不同 DNA 浓度、不同导入量等对其转化率的影响。张慧英等提取糯质玉 米 DNA 利用花粉管通道法导入甜玉米自交系,其后代植株产生了变异,主要表现在 株高、穗位高、叶面积等性状上的差异;经观察,D3 代各变异性状趋向稳定,从而 为以后通过不同种之间的 DNA 导入创造玉米新的变异品系提供了可参考的理论依 据。花粉管通道法无基因型限制且易实现大规模基因转化,而且不需要昂贵的仪器设 备和组织培养技术, 但是产生变异后代的类型特别丰富, 因此对后代的检测比较繁琐。

2.5.3 PEG 法
1993 年,Golovkin 等用 PEG 法将 H89 的原生质体分别与含有 CaMV35S 启动 子和鼠二氢叶酸还原酶(DHFR) 突变基因(氨甲喋呤抗性) 的质粒 pMP 和 pDMP 共 培养,其中 pDMP 的 mdhfr 基因插入了玉米 Ds1 转座子,用氨甲喋呤筛选得到抗性 愈伤组织,在不含激素的培养基上再生出植株。Omirulleh 等用 PEG 法将外源基因导 入到由 HE89 的悬浮细胞系分离得到的原生质体,建立了植株再生的转化体系。PEG 法转化效率较高,但必须以裸露的原生质体为受体,而且还受到基因型的限制。

2.5.4 基因枪法
基 因 枪 法 又 称 微 粒 枪 法 、 微 粒 轰 击 法 (gene gun , particle gun , particle bombardment) ,是依赖高速度的金属微粒将外源基因引入活细胞的一种转化技术。 1987 年,美国康奈尔大学的 Sanford 等研制出火药引爆的基因枪,又和该校工程技 术专家 Wolf 及 Klein 合作研究基因转移的新方法。 因为它利用高速运动的金属粒子, 可以非特异地将外源基因导入植物的细胞、 组织和器官, 不再受到受体基因型的限制,
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又能避开原生质体再生的障碍,为玉米遗传转化掀开了新的一页。根据基因枪动力系 统的不同,可将它们分为 3 类:火药式基因枪;放电式基因枪;气动式基因枪。影 响基因枪转化玉米效率的因素包括:不同受体材料对玉米再生的影响;基因型对玉米 体细胞再生能力的影响;培养条件对玉米体细胞再生能力的影响;质粒 DNA 的包被 等。

2.5.5 农杆菌介导法
农杆菌作为一种天然的植物基因转化系统,具有转化的外源 DNA 结构完整、转 化机理清楚、整合位点较稳定、拷贝数低、整合后的外源基因结构变异较小等优点, 因而倍受重视。单子叶植物曾被认为不在农杆菌的宿主范围之内,由此而发展了原生 质体吸收及基因枪轰击等直接的基因转化方法, 但是在实践中发现这些方法还存在着 受基因型及再生体系的限制、拷贝数多、易出现基因表达沉默等不足。因此,国际上 近年来又将注意力转向农杆菌介导的单子叶植物基因转化方法的研究, 并取得了明显 的进展。 Grimsly 等首次以玉米为材料, 用农杆菌将玉米条纹病毒(MSV) 的 cDNA 导 入玉米植株中,使植株表现了系统感染症状,这个报道有力地证明了农杆菌能侵染玉 米。 Gould 等(1991)用 gus 报告基因和 Npt 基因通过农杆菌介导法转化玉米 Funk G90 的芽尖,得到的再生植株及其子一代基因组中带有标记基因,从而为建立玉米高效遗 传转化体系奠定了基础。Ishida 等(1996)建立了一套农杆菌介导的高效转化体系,通 过对菌株、菌液浓度、幼胚等各种因素的优化,使玉米的转化效率达到了 30 %,成 为玉米遗传转化进程中的一个里程碑。随后,Lupotto 等和黄璐等也相继成功地实现 了农杆菌介导的玉米遗传转化。Huang 等成功通过调控农杆菌转化载体的左右两个 边界转化再生出不含标记基因的玉米,解决了转基因玉米在食品安全方面的顾虑。关 淑艳等利用农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶基因的反义表达载体导入玉米自交系中, 并对农杆菌转化系统的条件进行了研究。 农杆菌介导遗传转化的过程主要包括:农杆菌在植物敏感细胞上吸附;农杆菌 Ti 质粒上的 Vir 区被激活;T2DNA 切割和 T2DNA 复合物的形成;T2DNA 复合物 由农杆菌进入植物细胞;T2DNA 整合到植物染色体上并进行表达。从以上步骤看, 植物被成功转化的关键在于:农杆菌能否吸附到植物细胞壁上;植物能否释放诱导 Vir 区基因表达的信号分子;植物感受态细胞是否存在影响玉米农杆菌转化效率的因 素有:细菌菌株和构建的载体质粒的类型;受体基因型;受体的类型及发育状态,不
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同来源的受体,其对农杆菌的敏感性也不同。

2.6 玉米再生及遗传转化的常用受体 玉米再生及遗传转化的常用受体 再生及遗传转化的
2.6.1 愈伤组织再生系统
外植体经过脱分化培养诱导出愈伤组织,再经过分化培养获得再生植株。外植体 诱导的愈伤组织分两种类型:大多数玉米自交系易形成致密的Ⅰ型愈伤组织,这种愈 伤组织胚性差,继代后较难再生出植株;Ⅱ型愈伤组织生长迅速,可以长期继代保持 胚性,便于产生胚性悬浮细胞系,继而制备原生质体。外植体不同,愈伤组织的诱导 和再生能力不同。愈伤组织再生系统还受基因型限制,获得的再生株无性变异大,嵌 合体多。

2.6.2 原生质体再生系统
原生质体是最早用于玉米转基因的受体,20 世纪 80 年代就开始大量用于玉米 的遗传转化。Fromm 等、Golovkin 等和 Omirulleh 等分别以玉米的原生质体为转化 受体,对玉米进行了遗传转化,并取得了成功。原生质体作为受体系统可直接进行转 化,而且转化率较高,嵌合体少。但是玉米的原生质体分离较困难,培养周期长,再 生频率低。所以,目前已很少采用原生质体作受体系统。

2.6.3 种质系统
种质受体指转基因利用的受体是植物自身的生殖系统,如花粉粒、卵细胞,也称 生殖细胞受体系统。目前主要从两个途径利用种质受体进行基因转化:一是利用组织 培养技术进行花粉和卵细胞的单倍体培养,诱导出胚性细胞或愈伤组织,进一步分化 发育成单倍体植株,建立单倍体转基因受体系统;二是直接利用花粉和卵细胞受精过 程实现转基因,主要是花粉管导入法和子房注射法。丁群星等和王国英等分别用子房 注射法成功地获得了转基因玉米。以子房、花粉为转化受体,无需组织培养等一系列 复杂的过程,实验简单,便于操作,并且育种周期短。但是只能在授粉期进行遗传转 化,受季节性影响很大,同时后代得到的群体很大,筛选转化体比较困难。

2.6.4 直接分化再生系统
直接分化指叶片、 幼茎等外植体细胞越过脱分化产生愈伤组织而直接分化出不定 芽获得再生植株。玉米茎尖是比较好的直接分化再生系统。李学红等用玉米茎尖离体
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培养直接产生了雌雄花序。Zhong 等用茎尖培养产生了丛生不定芽,基因枪轰击得到 了转化株。Gould 等用玉米茎尖与农杆菌共培养获得了转化株和后代。Lowe 等把 DNA 转移到早期合子胚的分生组织中,获得了转基因玉米茎。直接分化再生系统省 去了愈伤诱导培养过程,体细胞无性变异小,获得再生株的周期短,但玉米茎尖的培 养困难。

2.7 本实验研究内容
综上所述, 本实验采用诱导培养出愈伤组织, 然后用农杆菌介导法侵染愈伤组织, 经过筛选,恢复等步骤,最终分化培养成再生植株。

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3 玉米成熟胚再生体系的建立 玉米成熟胚再生体系的建立
3.1 材料与方法
3.1.1 材料
本实验中所用的实验材料均是由植物科学技术学院玉米育种研究课题组提供, 郑 58、MQ704、昌 72、H736760A、178、2193 共 6 种自交系。

3.1.2 实验方法
3.1.2.1 外植体的选择与预培养 取上述基因型种子各 5 个, 在自来水下冲洗干净, 然后在超净工作台上 75%酒精 浸泡 2min,然后用 1%NaCLO 浸泡 15min,灭过菌的种子用无菌蒸馏水冲洗,然后放 入含 4mg/l 2,4-D 的无菌蒸馏水中浸泡 2d ~ 3d(因基因型不同,故种子出芽速度有差 异) 。 3.1.2.2 愈伤组织的诱导 将浸软的种子放置在超净工作台上,剥离出成熟胚,去除胚根(如图 1 所示) , 所得胚芽纵向切为两半后,再横切段,切口紧贴诱导培养基上在 26℃黑暗中培养 3 周,得到初级愈伤组织,计算愈伤组织诱导频率。

图 1 玉米种子的外形的结构
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3.1.2.3 胚性愈伤组织的形成及愈伤组织的继代 将初级愈伤组织转移至继代培养基上, 26℃黑暗中继续培养,每 2 周继代一次, 诱导胚性愈伤组织形成。 3.1.2.4 胚性愈伤组织的分化 将胚性愈伤组织转移到分化培养基上,在 26℃、16 h 的光周期条件下进行分化 培养。 3.1.2.5 培养基配制(详见附录)

表 1 培养基成分 培养基 诱导培养基 成分 N6 盐+B5 有机+2mg/L 甘氨酸+690 mg/L L-pro +1 g/L CH +0 ~ 5mg/L 2,4-D+30 g/L 蔗糖+8 g/L 琼脂, pH 5.8 继代培养基 N6 盐+B5 有机+2 mg/L 甘氨酸+690mg/L L-pro +1 g/LCH +1 ~ 3mg /L 2, 4-D+0 ~ 0.4 mg/L 6-BA+0 ~ 20 mg/LAgNO3(过滤灭菌)+ 30 g/L 蔗糖+8 g/L 琼脂, pH 5.8 分化培养基 N6 盐+B5 有机+2 mg/L 甘氨酸+1 g/L CH +0 ~ 1.0 mg/L 6-BA+30 g/L 蔗 糖+8 g/L 琼脂, pH 5.8 生根培养基 1 /2 MS 盐+B5 有机+2 mg/L 甘氨酸+1.0 mg/L IBA+20 g/L 蔗糖+7 g/L 琼脂, pH 5.8

3.2 结果与分析 结果与
3.2.1 玉米种子的预培养
用含有 4mg/L2,4-D 的无菌蒸馏水浸泡玉米种子,为避免种子因无氧呼吸而死, 故无菌蒸馏水不能没过种子,最好为种子的 2/3 处为宜。然后为避免染菌,要在培养 皿盖与底的中间部分封一层保鲜膜,从而大大减少了预培养的染菌率。 (如图 2)

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图 2 用含有 4mg/l 2,4-D 的无菌蒸馏水浸泡玉米种子

3.2.2 愈伤组织的诱导
将胚芽切为四段接种于诱导培养基中,将切面紧贴培养基,3d ~ 6d 后盾片开始 膨大,10d 后出现 1mm ~ 2mm 大小的愈伤组织。诱导培养 3 周后,形成颜色淡黄、 结构粘软的初级愈伤组织。 (如图所示)

图 3 诱导愈伤 6d 后

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图 4 诱导愈伤 10d 后

图 5 诱导愈伤组织 3 周后

2,4-D 是影响愈伤组织产生的关键因素。在没有添加 2,4-D 的诱导培养基上,成 熟胚在开始培养后的 2d ~ 3d 内容易萌发胚芽和胚根,不能诱导愈伤组织的产生。从 实验中可以知道,在添加有低浓度的 2,4-D 诱导培养基上,愈伤组织诱导频率较低;
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在一定浓度范围内, 随着 2,4-D 浓度的增加, 愈伤组织诱导频率相应增加。 供试的 2193 在含有 4.0mg/L 2,4-D 的诱导培养基上产生了最高的愈伤组织诱导频率(30 ~ 40%); 5.0mg/L 2,4-D 有再显著提高愈伤组织的诱导频率,也没有改善愈伤组织的质量。考 虑到高浓度的 2,4-D 容易导致体细胞无性系变异,因而 4.0mg/L 2,4-D 被认为是合适 浓度。

3.2.3 胚性愈伤组织的形成
将初级愈伤组织转移到含有不同浓度的 2,4-D 和 6-BA 的继代培养基上,经过 2 次继代培养后,愈伤组织可以分为两类:一类是粘软的、水渍状的、褐色的非胚性愈 伤组织;另一类是致密的、松脆的、形状不规则的、淡黄色或乳白色的胚性愈伤组织。 在继代培养基中添加 2,4-D 能刺激胚性愈伤组织的形成。从试验中可以得出,在含有 2,4-D 的继代培养基能促进胚性愈伤组织的增加。 在所用的 2,4-D 和 6-BA 的不同组合 中,2.0 mg/L 2,4-D 和 0.2 mg/L 6-BA 最为有效。

3.2.4 AgNO3 对胚性愈伤组织形成的影响
玉米组织培养中褐变是一种常见的现象, 褐变会导致愈伤组织生长受到严重的影 响。有人认为离体培养的植物组织会产生和散发乙烯,而乙烯在培养容器中的积累会 影响培养物的生长和分化,AgNO3 中的 Ag+通过竞争性的结合于细胞膜上的乙烯受 体蛋白,从而可起到抑制乙烯活性的作用。有研究表明,AgNO3 能提高玉米幼胚的 胚性愈伤组织形成频率。研究中比较了 AgNO3 对愈伤组织形成的影响。在诱导培养 基中添加适量的 AgNO3 对初级愈伤组织的诱导形成没有明显效果。在继代培养基中 添加适量的 AgNO3,能显著地增加胚性愈伤组织的形成。就供试的 2193 而言,10 mg/LAgNO3 是适宜的用量,而较高浓度的 Ag+对愈伤组织有毒害作用。因此,在随 后的实验中,10 mg/L 的 AgNO3 被添加到继代培养基中。

3.2.5 愈伤组织的分化
将愈伤组织转移到分化培养基中,一周后如图 6,图 7 所示。

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图 6 正在分化中的愈伤组织

图 7 正在分化中的愈伤组织

3.3 结论与讨论
本试验选用了由植物科学技术学院玉米育种研究课题组提供的 6 个玉米优良自 交系,利用成熟胚作为外植体研究其再生特点。结果表明,不同玉米基因型间的再生 能力具有较大的差异, 其中 2193 胚性愈伤组织诱导和再生能力最强, MQ704 诱导 而 率极低,说明玉米基因型仍然是限制玉米组织培养中一个关键的因素,筛选适宜培养 的基因型仍然是玉米组培工作中的重点。研究了影响成熟胚再生的各种因素,建立了
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成熟胚植株再生体系。这个体系主要有以下几个步骤组成:成熟胚在 4mg/L 2,4-D 的 无菌蒸馏水中浸泡 2d ~ 3d;在种子松软但未发芽的状态下再剥离出胚芽切段在 4 mg/L 2,4-D 的诱导培养基上培养 3 周,诱导初级愈伤组织;初级愈伤组织在含有 2.0mg/L 2,4-D,0.2 mg/L 6-BA,10 mg/LAgNO3 的继代培养基上培养 4 周,形成胚性 愈伤组织;胚性愈伤组织在含有 0.5 mg/L 6-BA 的分化培养基上分化出再生小植株。 这个再生体系的建立,为用成熟胚作为受体系统进行玉米遗传转化研究奠定了基础。 禾谷类作物组织培养和体细胞胚诱导过程中,添加 2,4-D 是诱导愈伤组织形成的 关键因子。Ray 等利用 2 mg/L 2,4-D 从玉米幼叶获得的松散、白色的愈伤组织,继代 在 8 mg/L 2,4-D 的培养基中才能诱导出黄色的胚性愈伤组织。本文研究结果也表明, 2,4-D 对玉米成熟胚愈伤组织的诱导必不可少。细胞分裂素与生长素的组合使用有利 于诱导胚性愈伤组织的形成,Cho 等发现在继代培养基中 0.1mg/L 6-BA 对大麦胚性 愈伤组织的胚性维持是必需的。 实验结果也证明了 2,4-D 与低浓度的 6-BA 配合使用, 能显著提高玉米成熟胚的胚性愈伤组织形成。AgNO3 可提高胚性愈伤组织的诱导频 率, Songstad 等[4]报道 AgNO3 可提高自交系 B73 及其衍生系的幼胚愈伤组织的诱导; Carvalho 等[5]报道在诱导培养基中添加 AgNO3 显著增加了热带玉米基因型幼胚的胚 性愈伤组织的产生和植株再生频率。实验中也发现 AgNO3 在胚性愈伤组织的诱导和 改善愈伤组织的质量方面有显著作用, mg/LAgNO3 显著增加了玉米成熟胚胚性愈 10 伤组织的诱导形成频率。关于 AgNO3 的作用机制,一种认为植物细胞在体外培养过 程中会产生乙烯,乙烯积累到一个较高的水平影响植物的生长发育。而 Ag+是一种较 好的乙烯活性抑制剂,它可通过竞争性结合于细胞膜上的乙烯受体蛋白,从而起到阻 止或降低乙烯的作用。另一种认为,Ag+的作用与乙烯和多胺之间有着密切的联系, 乙烯抑制芽和体细胞胚胎的发生,而多胺则能促进它们发生。关于 AgNO3 促进植物 再生机制还有待于进一步研究。

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4 农杆菌介导的玉米转化体系的建立 4.1 材料与方法
4.1.1 材料
上述 6 种玉米自交系基因型的愈伤组织。 质粒为 i-Tre-pGSA1285。 农杆菌菌株为 LBA4404。

4.1.2 培养基配制 培养基配制
表 2 转化继代培养基(详见附录) 成分 N6 大量元素 B5 微量 N6 微量 N6 有机 铁盐 2,4-D 肌醇 酸水解干酪素 L-脯氨酸 脯氨酸 蔗糖 琼脂 PH 值 甘露醇 母液浓度 10x 1000x 1000x 1000x 200x 0.5mg/mL 称量 称量 称量 称量 称量 称量 用量 100mL 1mL 1mL 1mL 5mL 4mL 120mg 100mg 690mg 30g 6g ~ 7g 6.0 200mg/L

玉米胚性愈伤侵染液: 玉米胚性愈伤侵染液: 液体转化继代培养基(PH 值 5.2)+乙酰丁香酮(200?M)+Tween20(0.1%); 愈伤共培养培养基: 愈伤共培养培养基: 固体转化继代培养基(pH 值 5.8)+乙酰丁香酮(200?M)+AgNO3(0.85mg/L); 恢复培养基: 恢复培养基: 固体转化继代培养基(pH 值 5.8)+AgNO3(0.85mg/L)+羧苄青霉素(200mg/L)+头孢
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霉素(400mg/L); 筛选培养基: 筛选培养基: 固体继代培养基(pH 值 5.8)+羧苄青霉素(200mg/L)+头孢霉素(400 ~ 500mg/L)+潮 霉素。

4.1.3 转化方法
4.1.3.1 侵染液的准备 (1)挑取 LBA4404 菌株,于 5ml 液体 YEP 培养基中,28℃200r/min 摇菌 12h。 (2)直到测得菌液浓度 OD600 为 1.0 ~ 1.2 后,在室温下 5000r/min 离心 5min,收集 菌体,用 4 ~ 5ml 愈伤侵染液重悬菌体 2 次。 (3)在低温 4℃下(高温易导致农杆菌失活,死亡) ,加入侵染液轻轻敲动,直至完 全混匀后,倒入原侵染液中。 4.1.3.2 侵染 超净工作台中挑选供转化的玉米胚性愈伤,根据基因型的不同,分批次将同种基 因型的玉米胚性愈伤放进上述配制好的侵染液中,不时摇动浸泡 20min。随后挑起玉 米愈伤组织,用已灭菌的吸水纸吸干愈伤表面菌液,将愈伤接种于供培养基上,22℃ 暗培养 5d。 4.1.3.3 抗性愈伤的筛选 共培养过的愈伤用无菌水洗涤直到变清为止,再用含有头孢霉素(400mg/L)的无 菌水洗一次,无菌吸水纸吸干愈伤表面的液体后用作抗性筛选。 抗性筛选的愈伤接种于恢复培养基上 27℃暗培养 3d,再依次转到潮霉素浓度分 别为 3mg/L、5mg/L 和 10mg/L 的筛选培养基上 27℃连续筛选 3 轮,每轮 3 周。

4.2 结果与分析
(1)根癌农杆菌侵染(图 8)时间为 20min 时效果最佳。侵染时间太短则效果不好, 因农杆菌是避光生长,太长则会因农杆菌过度死亡致使侵染率下降。

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图 8 侵染液侵染愈伤组织

(2)因所查相关资料农杆菌培养基均用 YEP 培养基,但也有实验人员普遍用 YEB 培 养基,故本试验以 YEB 培养基作为对照,试分析 YEP 培养基和 YEB 培养基的区别 (如表 3)
表 3 YEB 和 YEP 培养基对照组 成分 蛋白胨 酵母浸膏 牛肉浸膏 MgSO4·7H2O pH 摇菌时间 抗生素 OD600 吸光值 YEB 5g 1g 5g 0.493g 7.0 12h 100?l 氯霉素+200?l 利福平 1.2 7.0 12h 100?l 氯霉素+200?l 利福平 0.37 YEP 10g 10g 5g

如表 3 所示, 在相同摇菌时间的状况下, YEB 培养基的 OD600 吸光值为 1.2, YEP 培养基 OD600 吸光值为 0.37。因为酵母浸膏和 Mg 离子的用量差别很大,所以导致
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YEB 培养基和 YEP 培养基的活性有显著差异。故在摇菌过程中,农杆菌培养基的选 取以 YEB 培养基最为适宜。 (3)共培养培养基要避光培养,如图 9 所示

图 9 共培养 3d 后被农杆菌所包裹的愈伤组织

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5 参考文献
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Maize Inbred B73 and Its

农杆菌介导的玉米转化及再生体系的建立

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6 致谢
大学四年学习时光已经接近尾声,在此我想对我的母校,我的父母、亲人们,我 的老师和同学们表达我由衷的谢意。感谢我的家人对我大学四年学习的默默支持;感 谢我的母校北京农学院给了我在大学四年深造的机会,让我能继续学习和提高;感谢 ******的老师和同学们四年来的关心和鼓励。 老师们课堂上的激情洋溢,课堂下的谆谆教诲;同学们在学习中的认真热情,生 活上的热心主动,所有这些都让我的四年充满了感动。 这次毕业论文设计我得到了很多老师和同学的帮助,尤其是得到我的导师***老 师的悉心指导。***多次询问研究进程,并为我指点迷津,帮助我开拓研究思路,精 心点拨、热忱鼓励。***一丝不苟的作风,严谨求实的态度,踏踏实实的精神,不仅 授我以文,而且教我做人,虽历时一年,却给以终生受益无穷之道。对郭老师的感激 之情是无法用言语表达的,在此谨向郭老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。 同时, 本篇毕业论文的实验过程也得到了组培实验室主任*******等的热情帮助。 感谢在整个毕业设计期间和我密切合作的同学, 和曾经在各个方面给予过我帮助的伙 伴们,在此,我要向诸位老师和同学深深地鞠上一躬。

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附录 母液1:N6 大量元素
培养基成分 KNO3 (NH4)2SO4 MgSO4·7H2O KH2PO4 MnSO4·H2O 浓度 10× 10× 10× 10× 10× 配制体积 400ml 所需溶质 11.2g 1.852g 0.74 g 1.6 g 0.0176 g

母液2:二水合氯化钙
培养基成分 CaCl2?2H2O 浓度 10× 配制体积 400ml 所需溶质 0.664 g

母液3:铁盐
培养基成分 FeSO4·7H2O Na2-EDTA 浓度 10× 10× 配制体积 400ml 所需溶质 0.1112 g 0.149 g

母液4:N6 微量
培养基成分 ZnSO4·7H2O H3BO3 KI 浓度 1000× 1000× 1000× 配制体积 200ml 所需溶质 0.3g 0.32g 0.16g

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母液 5: B5 有机
培养基成分 肌醇 叶酸 VB6 VB1 浓度 100× 100× 100× 100× 配制体积 200ml 所需溶质 2g 0.01g 0.02g 0.2g

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