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蝴蝶兰未受精胚珠离体培养的研究


园        2006, 33 ( 4 ) : 891 ~894 艺 学 报 Acta Horticulturae Sinica

蝴蝶兰未受精胚珠离体培养的研究
伍成厚
( 1 漳州师范学院生物系 , 福建漳州 363000;

广东广州 510405 )

摘   : 以蝴蝶兰大孢子母细胞时期

的胚珠为外植体进行了离体培养的研究 。结果表明 , 在 VW + BA 要 囊 ; 在 VW +BA 012 mg?L - 1 +NAA 012 mg?L - 1 +蔗糖 210% +植物凝胶 013% +椰子汁 10%中大孢子母 细胞可以发育至四核胚囊或形成胚性细胞团 , 这些胚性细胞团有可能发育成单倍体植株 。 关键词 : 蝴蝶兰 ; 胚珠 ; 胚性细胞团 ; 组织培养 ? 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 中图分类号 : S 682131    文献标识码 : A    文章编号 : 0513 2 353X ( 2006 ) 04 2 0891 2 04
1, 2, 3 3

In V itro Culture of Unfertilized O vules in P ha laenopsis
W u Chenghou
1

未受精子房或胚珠离体培养 , 不仅是继花药培养之后单倍体育种的又一条可行途径 , 而且开 辟了植物组织培养与被子植物胚胎学研究的新领域 —— — 在离体条件下对大孢子 、雌配子体的发育及其 〔〕 1 胚胎发生进行研究与控制 。 兰科蝴蝶兰属 ( Pha laenopsis) 植物经过长期杂交育种培育出许多具有观赏价值的品种 , 其组织培 〔〕 3 〔 5〕 4, 〔 7〕 6, 养的研究主要是种子培养 和花梗的快速繁殖 , 未受精胚珠离体培养的研究尚未见报道 。作 者以蝴蝶兰杂交种 ( Pha laenopsis hybrid ) 为材料 , 进行了未受精胚珠离体培养的研究 , 描述了蝴蝶
〔〕 7

兰大孢子母细胞的离体发育过程 。本文报道培养基成分对试验结果的影响 , 为进一步建立蝴蝶兰 单倍体育种体系提供参考 。 试材为中国科学院华南植物园温室栽培的蝴蝶兰杂交种 ( Pha laenopsis hybrid ) 。在 2000 年 12 月 ~ 2003 年 3 月开花期间进行人工授粉 , 采集授粉 44 d发育正常的子房 (此时胚珠已经分化内 、外
收稿日期 : 2005 - 11 - 15; 修回日期 : 2006 - 04 - 27 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( 30170061) ; 广东省重大科技专项资助项目 ( 2003A2010401) ; 福建省青年科技人才创新 项目资金 ( 2004J052) 3 通讯作者 Author for corrspondence

ing meiosis to form bi2nucleate embryo sacs in vitro by ovule cultures on the medium of VW + BA 012 mg? - 1 - 1 - 1 L + NAA 012 m g?L + sucrose 210% + phytagel 013%. On the medium of VW + BA 012 mg?L + - 1 NAA 012 m g?L + sucrose 210% + phytagel 013% + coconut m ilk 10% , the megasporocytes would de2 velop into 4 2nucleate embryo sacs or embryogenic cell m asses These em bryogenic cell masses may develop in2 . to hap loid p lants . Key words: Pha laenopsis; Ovule; Embryogenic cell m asses; Tissue culture

( D epa rtm en t of B iology, Z hangzhou N or a l College, Zhangzhou, Fu jian 363000, Ch ina; S ou th Ch ina B otan ica l Ga rden, the m 3 Ch inese A cadem y of S ciences, Guangzhou, Guangdong 510650, Ch ina; Guangzhou Institu te of L andscape and Ga rden, Guang 2 zhou, Guangdong 510405, Ch ina )

Abstract: The effects of medium composition on the in vitro culture of unfertilized ovules of a Pha lae2 nopsis hybrid were studied. The results showed that the megasporocytes of the hybrid were capable of undergo2

1  目的 、材料与方法

012 mg?L

1, 2, 3 3

  潘一山   罗开梅   叶秀粦
2

1

1

中国科学院华南植物园 , 广东广州 510650;

-1

+NAA 012 mg?L

-1

, Pan Yishan , Luo Kaim ei , Ye Xiulin

1

+蔗糖 210% +植物凝胶 013%中蝴蝶兰的大孢子母细胞可以发育至二核胚
1 23

23

  梁承邺

2
3

广州市园林科学研究所 ,

, and L iang Chengye
2

2

〔 2〕 1,

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892

园          艺 学 报
〔〕 8

33 卷

珠被 , 胚囊处于大孢子母细胞时期 )
- 1

, 常规消毒后 , 在超净工作台内取中部带有少量子房壁的胚珠
- 1

作为外植体 。基本培养基为 M S、N6 、B5 、VW 培养基 。蔗糖浓度 2% ~6% , 植物凝胶 013% , 单独 或组合加入 0 ~210 mg ?L 的 NAA、BA , 椰子汁 0 ~10% , 水解酪蛋白 0 ~400 mg ?L , 蛋白胨 - 1 0 ~2 000 m g?L , pH 510 ~610。暗培养 , 温度 ( 26 ± 15 ) ℃。材料采用石蜡切片法制片 、观察 。 0

2  结果分析与讨论

体培养 4 d 即由乳白色转变为浅黄色至黄褐色 。珠被细胞的细胞质很快消失 , 细胞核中的染色质凝集 并随后溶解 , 只剩下细胞壁 。由于珠被细胞很快解体 , 大孢子母细胞不能继续发育 。在 B5 、VW 这两 种培养基上 , 体细胞组织增生较少 , 胚珠褐化速度较慢 , 较长时间呈乳白色 , 珠被细胞解体较迟 , 胚 囊能进一步发育 。在 B5培养基上 , 培养 4 d 胚珠的大孢子母细胞能发育至二分体 , 但随后也解体退 化 。在 VW 培养基上 , 胚珠的大孢子母细胞能经二分体 (图版 , 1、 2 ) 发育至二核胚囊 (图版 , 3 ) 。 212  BA、 NAA 对蝴蝶兰未受精胚珠发育的影响 植物生长调节剂对蝴蝶兰未受精胚珠离体发 表 1  离体培养 13 d植物生长调节剂对蝴蝶兰胚珠发育的影响 Table 1  Effect of com b ina tion s of plan t growth regula tors 育是非常必需的 (表 1 ) 。在培养基未添加植物生 长调 节 剂 时 , 蝴 蝶 兰 胚 珠 离 体 培 养 4 d, 约 9710%的胚珠解体 , 培养 13 d 胚珠全部解体 。培 - 1 养基单独添加 011 ~012 mg?L 的 NAA 或 BA 均 能降低珠被细胞解体的程度 。但 NAA 和 BA 浓度 动减数第 1 次分裂形成二分体 ; 只有同时添加 - 1 - 1 NAA 012 m g?L 和 BA 012 m g?L 时才能继续 进行减数第 2 次分裂 , 形成二核胚囊 。 213   蔗糖浓度和 pH 值对蝴蝶兰未受精胚珠发育 的影响 蔗糖浓度较低 ( 2% ) , 珠被细胞解体较迟 ,
214   有机添加物对蝴蝶兰未受精胚珠发育的影响
- 1

较高时不利于胚珠的发育 。当 NAA 浓度达到 110 - 1 mg?L 时 , 子房壁产生大量白色 、松散的愈伤 组织 , 胚珠解体退化 。 BA 的浓度增高到 110 m g - 1 ?L 时 , 胚珠也迅速褐化 , 胚囊很快解体 。 单独添加 NAA 或 BA , 大孢子母细胞只能启

胚囊能进一步发育 ; 蔗糖浓度为 4%和 6%时 , 珠 被细胞解体速度逐渐加快 。由于珠被细胞解体后 胚囊难以继续发育 , 因此在进行蝴蝶兰未受精胚 珠的离体培养中 , 蔗糖浓度以 2%为宜 。 培养基 pH 值为 513 或 516 时 , 珠被细胞解体 较慢 , 胚囊能发育至二核或四核胚囊 (图版 , 4、 5 ) ;

当 pH < 513 或 pH > 610 时 , 珠被细胞均加快解体 , 胚囊仅能发育至二分体随即退化 。
- 1

促进作用 , 胚囊发育至二分体时期即退化 。在添加 10%椰子汁后 , 约 30%的胚珠能发育至二核胚囊 (图版 , 3 ) 或四核胚囊 (图版 , 5 ) , 但与体内胚囊不同的是这些胚囊不能正常液泡化 , 在胚囊中部
? 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net

211  基本培养基对蝴蝶兰未受精胚珠发育的影响

在 M S和 N6培养基上 , 子房壁的细胞大量增生 、突起 , 不利于蝴蝶兰未受精胚珠的发育 。胚珠离

on d ifferen tia tion in v itro developm en t of Pha laenopsis ovules cultured for 13 days

BA

NAA

胚珠数量 Number of ovules

培养基中添加水解酪蛋白 400 mg?L 或蛋白胨 2 000 m g?L 对蝴蝶兰未受精胚珠的发育没有

(mg? (mg?观察总数 大孢子母细胞 二分体 二核胚囊 解体的胚珠 Total Megaspore B i2nucleate D isrup ted L - 1 ) L - 1 ) ovules mother cell Dyad embryo sac ovules 0 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 0 0 2 0 2 0 1 0 0 1 0 1 3 3 0 0 0 1 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 100 011 012 110 011 012 110 210 0 011 012 110 210 0 011 012 110 210 0 011 012 110 210 17 25 29 14 13 14 12 26 23 10 10 81 75 69 85 87 95 85 87 71 72 90 90 93 94 72 0 100 5 0 100 0 6 5 0 100 26 100

 4 期

伍成厚等 : 蝴蝶兰未受精胚珠离体培养的研究  

893

没有形成中央大液泡 , 而形成的子核游离于胚囊内 , 不是位于胚囊的两端 。 添加 10%椰子汁时 , 约有 5%的胚囊发育途径发生了改变 。在二分体后期珠孔端的 1 个二分体细 胞不退化 (图版 , 6 ) 而合点端的另一个细胞就进行第 2 次分裂 (图版 , 7 ) , 从而在 1 个胚囊内形成 3 个细胞 (图版 , 8 ) , 这些细胞多次分裂 , 最终在 1 个胚囊内形成了细胞团 (图版 , 9 ) , 这些细胞 具有较大的细胞核和很浓的细胞质 , 呈现胚性细胞的特征 。这些胚性细胞团有可能进一步诱导单倍体 植株 , 从而为兰科植物的育种开辟一条新的途径 。

图版说明 : 珠孔端向下 1. 二分体 , 子, × 550; 3. 二核胚囊 ,
( ↑, ∧) ,

× 550; 2. 二分体 , 珠孔端的 1 个细胞已经退化 ( ↑ ) , 合点端的细胞体积增大 , 成为功能大孢 × 550; 6. 两个细胞相等的二分体 , ×

× 550; 4. 二核胚囊正在进行分裂 ( ↑) , × 550; 5. 四核胚囊 , × 。 550

550; 7. 示二分体珠孔端的细胞不退化 ( ∧) , 合点端的另一个二分体细胞正在分裂 ( ↑) , × 550; 8. 示 1 个胚囊内形成的 3 个细胞

× 550; 9. 示胚囊内形成的胚性细胞团 ,

Explana tion of pla tes: The m icropylar ends downward 1. Dyad, and the chalazal one continues to enlarge, nucleate embryo sac,

× 550; 2. Dyad, showing the cell ( ↑) at m icropylar end has comp ressed × 550; 4. B inucleate embryo sac in dividing ( ↑) , × 550; 5. 4 2 × 550; 7. Dyad, showing the chalazal cell ( ↑) is dividing and × 550; 9. Embryogenic cell masses

× 550; 3. B inucleate embryo sac,

× 550; 6. Dyad, showing the two cells as the same size, × 550.

the m icropylar one ( ∧) does not degenerate, × 550; 8. Three cells ( ↑, ∧) formed in an embryo sac, for med in an embryo sac,

参考文献 :

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? 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.

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33 卷

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1

基质栽培仙客来矿质营养吸收规律的研究
汤少红   石伟勇
点实验室 , 浙江杭州 310029;
13

  余琼芳   张荣盛  
2

2

2

( 1 浙江大学环境与资源学院 , 环境修复与生态健康教育部重

浙江森禾种业股份有限公司 , 浙江杭州 310020)

S ciences, M in istry of Educa tion Key L ab of Environm en ta l R em ed ia tion and Ecosystem Hea lth, Zhejiang U n iversity, Hangzhou, 2 Z hejiang 310029, Ch ina; Zhejiang S enhe S eed Co , L td. , Hangzhou, Z hejiang 310020, Ch ina ) .

近几年 , 仙客来 ( Cyclam en persicum ) 设施栽培产业在我国迅速发展 , 但由于引进的国外品种在我国栽培条件下 缺乏相应的技术研究 , 导致仙客来生产优质品率低 、生产成本高 。因此 , 探讨设施栽培条件下仙客来的营养吸收规 律 , 对制定优质仙客来生产的施肥技术具有指导意义 。 本试验以日本的 NP系列 F1 代 NP3 品种为试材 。 2002 年 12 月下旬播种于 288 穴育苗盘 , 2003 年 3 月底移苗到 50 孔穴盘 , 2003 年 5 月上旬换盆定植于泥炭 : 珍珠岩 : 蛭石 = 5 ∶ ∶ ( pH 610, EC 018 mS/ cm , 速效 N 161188 mg/ kg, 1 1 速效 P 29173 mg / kg, 速效 K 110 mg/ kg) , 试验规模为 6 000 盆 , 田间管理按浙江森禾种业公司技术体系最优化措施进 行 。从 2003 年 6 月 25 日开始采样到 2003 年 12 月 5 日盛花期 , 每隔 30 d左右取 1 次 , 每次 20 株 。仙客来用蒸馏水冲 洗干净 , 将根 、球茎 、叶分开 , 称其鲜样质量 。在 105 ℃ 下杀青 30 m in, 60 ℃ 烘至恒重 , 称量 。干样磨碎过筛后用 H2 SO4 - H2 O2消煮 , 采用扩散法 、钒钼黄比色法 、火焰光度法 、原子吸收分光光度法分别测定氮 、磷 、钾 、钙 、镁含 量 。根据各生育期的干样质量和植株单位干样质量的矿质元素含量 , 计算出植株矿质元素的积累量和各生育期养分积 累率 。 结果表明 , 在浙江杭州 , 仙客来在 10 月份生长进入旺期 , 干物质积累量最大 ; 仙客来对矿质营养元素的吸收每 株平均 N 为 0199 g, P为 0117 g, K为 0197 g, Ca为 0126 g, M g为 0112 g。植株干物质量 ( x) 与矿质元素的积累量 ( y) 的回归方程为 y = 010419 + 010608x, r = 0199383 3 。仙客来在越夏前 ( 5 月上旬到 7 月上旬 ) 生长逐渐加快 , 养 分吸收增加 , 但越夏期间 (7 月中旬到 9 月下旬 ) 生长缓慢 , 对矿质营养元素的吸收较少 。越夏后 , 生长迅速 , 对矿 质营养元素的吸收积累出现高峰 , 其中 N、 P、 Ca、M g 的吸收高峰出现在 10 月份 , 养分积累率分别为 42185% 、 39138% 、 55117% 、 66197% ; K的吸收高峰出现在 11 月份 , 积累率为 44102% 。仙客来植株体内 N、 P、 K、 Ca、M g 积累量的比值 , 越夏前为 59 ∶ ∶ ∶ ∶ 越夏后为 88 ∶ ∶ ∶ ∶ 盛花期为 82 ∶ ∶ ∶ ∶ 。因此 , 可根据仙 22 60 20 10, 22 82 17 10; 14 81 21 10 客来植株的干物质积累量来确定其各生育期矿质元素的需求量 , 从而确定仙客来各生育期需要肥料的比例和用量 。
收稿日期 : 2005 - 10 - 19; 修回日期 : 2006 - 03 - 21 3 通讯作者 Author for correspondence ( E 2 mail: wyshi@ zju1 edu1 cn)

1 13 2 2 Tang Shaohong , ShiW eiyong , Yu Q iongfang , and Zhang Rongsheng ( 1 College of Environm en ta l and R esou rce

Stud ies on M acronure ien t Absorption in C yc lam en Cultiva ted in So illess M e2 d ium
关键词 : 仙客来 ; 干物质 ; 矿质营养 ; 吸收 中图分类号 : S 68212 + 62    文献标识码 : A    文章编号 : 0513 2 353X (2006) 04 2 0894 2 01 ? 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net


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