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免疫组织化学技术(immunohistochemistry) 由于免疫


免疫组织化学技术(immunohistochemistry)
由于免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高及能将形态研究与功能、代谢研究有机地 结合在一起的显著特点,所以,这门新技术从一诞生起就显示出了强大的生命力和广阔的应用 前景。此方法经不断改进和发展已日趋成熟,应用范围逐渐扩大。目前已有近十种技术方法及 几百种标记抗体,技术方法逐步规范化,标记抗体逐步商品化,现今它

已被广泛地应用于生物 学和医学研究的许多领域,取得了令人瞩目的成就。

一、 免疫组织化学技术的原理和应用范围

(一) 免疫组织化学技术的基本原理 免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组 织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。即先将组织或细胞中 的某些化学物质提取出来,以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物,制备特异性抗体, 再用这种抗体(第一抗体)作为抗原去免疫动物制备第二抗体,并用某种酶(常用辣根过氧化 物酶)或生物素等处理后再与前述抗原成分结合,将抗原放大,由于抗体与抗原结合后形成的 免疫复合物是无色的,因此,还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来(常用 显色剂 DAB 显示为棕黄色颗粒)。通过抗原抗体反应及呈色反应,显示细胞或组织中的化学 成分,在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物,从而能够在细胞或组织原位确 定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质,如蛋白质、多 肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检 测。 免疫学的基本原理决定了免疫组织化学技术具有高度特异性,因此,免疫组织化学技术从 理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示,如角蛋白(keratin)显示上皮成分,LCA 显示淋 巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。ABC 法或 SP 法的出现, 使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合,所以免疫组织化学技术 又具有敏感性高的特点。免疫组织化学技术通过抗原抗体反应及呈色反应,对组织和细胞中抗 原的准确定位,使其可以同时对不同抗原在同一组织或细胞中定位观察,并进行形态与功能相 结合的研究。 (二)免疫组织化学技术的应用范围

近年来,随着抗原的提纯和抗体标记技术的改进,特别是自 70 年代中期杂交瘤技术与单 克隆抗体技术的引入,使制备的抗体具有高度的特异性。简便而敏感的免疫酶标技术能够用于 普通培养细胞(株)、常规福尔马林固定石蜡包埋的组织切片、若干年前的存档标本等,从而 使该技术在生物医学研究和临床病理学、微生物学诊断中,日益显示出巨大的实用价值。目前 主要应用在如下几个方面: 1 确定细胞类型 通过特定抗体标记出细胞内相应抗原成分,以确定细胞类型。如角蛋白是上皮性标记,前 列腺特异性抗原仅见于前列腺上皮,甲状腺球蛋白抗体是甲状腺滤泡型癌的敏感标记,而降钙 素抗体是甲状腺髓样癌的特有标记。有些细胞(如表皮内朗格汉斯细胞、黑色素细胞、淋巴结 内指突状和树突状网织细胞)光镜下不易辨认,但免疫组化标记(S-100 蛋白等)能清楚显示 其形态。 2 辨认细胞产物 利用某些细胞产物为抗原制备的抗体,可作为相应产物的特殊标记,如内分泌细胞产生的 各种激素,大多数可用免疫组化技术标记出来,据此可对内分泌肿瘤作功能分类,检测分泌异 位激素的肿瘤等。 3 了解分化程度 大多数标记物都有其特定的分布部位,如上皮细胞膜抗原(EMA)着色部位在细胞膜上, 但差分化乳癌胞浆内也可出现阳性颗粒;角蛋白的含量也与分化程度有关,低分化或未分化癌 含量较低、染色较弱。 4 鉴定病变性质 通过标记 Ig 轻链(κ、λ)可区分部分 B 细胞性淋巴瘤与 B 细胞反应性增生,前者常表达 单一的 Ig 轻链(κ+/λ+),后者常为多克隆 Ig 轻链(κ+、λ+)。而标记 bcl-2 蛋白在区别滤泡 型淋巴瘤和反应性滤泡增生上有相当的意义。在滤泡型淋巴瘤,90%以上肿瘤性滤泡细胞有 bcl-2 的高表达;而在滤泡反应性增生时,滤泡反应中心的细胞不表达 bcl-2 蛋白,而套细胞则 表达。 5 发现微小转移灶 某些癌的早期转移有时与淋巴结内窦性组织细胞增生不易区别。用常规病理组织学方法要 在一个组织中认出单个转移性肿瘤细胞或几个细胞是不可能的,而采用免疫组化方法(如用上 皮性标志)则十分有助于微小(癌)转移灶的发现。对转移性肿瘤也可借助免疫组化标志寻找 原发瘤,如骨组织内有前列腺特异性抗原阳性细胞,提示前列腺癌转移。 6 探讨肿瘤起源或分化表型

一些来源不明的肿瘤长期争论不休,最后通过免疫组化标记取得共识。如颗粒性肌母细胞 瘤,曾被认为是肌源性的,但该肿瘤肌源性标记阴性,而神经性标记阳性,证明为神经来源 (可能来自神经鞘细胞)。分化很差的肿瘤病理上常按细胞形态分为梭形细胞肿瘤、小圆细胞 肿瘤等,通过多种标记的联合应用,也可能确定其来源。 7 确定肿瘤分期 判断肿瘤是原位还是浸润及有无血管、淋巴管侵袭与肿瘤分期密切相关。用常规病理方法 判断有时是十分困难的,但用免疫组化法可获得明确结果。如采用层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的单 克隆抗体可清楚显示基底膜的主要成分,一旦证实上皮性癌突破了基底膜,就不是原位癌,而 是浸润癌了,其预后是不同的。用第八因子相关蛋白、荆豆凝集素等显示血管和淋巴管内皮细 胞的标记物则可清楚显示肿瘤对血管或淋巴管的浸润。对许多肿瘤的良恶性鉴别及有无血管或 淋巴管浸润,这是主要的鉴别依据,同时也有治疗及预后意义。 8 指导预后和治疗 免疫组化标记中与预后有关的标记大致可分为三类:①类固醇激素受体:如雌激素受体、 孕激素受体等,它们与乳腺癌的关系已获公认,性激素受体阳性者内分泌治疗效果较好,预后 也较好。相似的结果也见于子宫内膜癌和卵巢癌。②肿瘤基因标记:如癌基因 c-erB-2,cmyc,P53 蛋白等,在肿瘤中高度表达者,患者预后较差;而 nm23 蛋白高度表达者,肿瘤转 移率较低,预后较好。③细胞增殖性标记:如表皮生长因子受体(EGFR)、增殖细胞核抗原 (PCNA)、Ki-67 等,表达指数越高,表明其增殖越活跃,恶性度增高,预后不良,其中以 恶性淋巴瘤、乳腺癌较为明显。而且在乳腺癌的研究中发现 Ki-67、 PCNA 、EGFR 阳性者, 淋巴结转移率高,并与激素受体的表达呈负相关。 9 辅助疾病诊断和分类 人体的免疫性疾病,主要是自身免疫性疾病,如肾小球肾炎、皮肤自身免疫性疾病等,可 用免疫组化方法对组织细胞内的免疫球蛋白、补体、免疫复合物等进行检测以辅助诊断。某些 疾病的分类或分型也是在免疫组化基础上建立的。内分泌肿瘤如垂体前叶腺瘤,根据其分泌功 能可分为生长激素腺瘤、泌乳激素腺瘤等 10 型;胰岛细胞瘤的功能分类为胰岛素瘤、高血糖 素瘤等 6 种;恶性淋巴瘤根据瘤细胞表面标志不同可分为 T 细胞性、B 细胞性。肾小球肾炎的 免疫学分类亦需免疫组化或免疫荧光技术。 10 寻找感染病因 人体疾病的致病微生物中有的在常规病理检查中不易发现,尤其是病毒性致病微生物,由 于其分子水平的结构,在细胞水平上难以发现,通过免疫组化方法则可明确发现病原体抗原部

位以及定量,如巨细胞病毒(CMV)、人乳头状瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒(HSV)、 乙型肝炎病毒(HBV)等,已有商品化标志物帮助解决病因诊断问题。

二、 免疫组织化学技术细节处理总论

(一)标本的处理——细节注意 标本的处理是良好免疫细胞组织化学结果的前提,必须保证要检测的细胞或组织取材新 鲜,固定及时,形态保存良好,抗原物质的抗原不丢失,不扩散或被破坏。标本的处理过程中 应该注意以下两个方面:取材、固定。 1 取材 细胞标本取材可有印片法、穿刺吸取涂片法、体积沉淀涂片法、培养细胞标本取材及离心 涂片机法。 1.1 印片法 主要应用于活检组织标本和手术切除标本。新鲜标本以最大面积剖开,充分暴露病变区, 将载玻片轻轻压于病变区,脱落细胞便粘附于玻片上,立即浸入细胞固定液内 5~10 分钟,取 出后自然干燥,低温保存备用。 1.2 穿刺吸取涂片法 主要应用于实质器官的病变区,如肝、肾、肺、淋巴结、软组织等。用细胞针穿刺吸取病 变区内液体成分,可直接涂抹在玻片上,力求细胞分布均匀。如穿刺液较多,细胞丰富,可用 洗涤法,即将穿刺液滴入盛有 1~2ml Hank(或RPMI-1640)液的试管内,轻轻搅拌,以 500r/min低速离心 5~10min后,弃上清液,将沉淀制成细胞悬液(1×106细胞/ml),吸取 1 滴 于载玻片上,轻轻涂抹或用离心涂片机制成涂片,待涂片略干即可固定。 1.3 体积沉淀涂片法 主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多细胞少的标本。体液采取后,必须及时处 理,不宜加固定剂。根据标本内细胞数量多少选用不同的处理方法:①细胞数量极多者,可吸 取少量液体直接涂在玻片上;②细胞数量少者,可将液体沉淀,然后取沉淀液以 1500r/min 离 心 10min,弃上清,将细胞涂片或用离心涂片制成涂片,略干后固定备用。 1.4 培养细胞标本取材 根据培养细胞特性分别采用不同的方法。对某些贴壁生长的细胞,只需将载玻片插入培养 瓶内即可制备理想的细胞标本。而对于浮悬培养的细胞,可用离心涂片机制成涂片。 1.5 离心涂片机法

将待涂片的细胞样品成 2×105~6/ml的细胞悬液,吸取 50~100μl加入涂片机内,1000r/min 离心 2min后细胞就均匀地分布于玻片上。 制备细胞涂片应注意:①标本反复离心洗涤后,细胞黏附性降低,在免疫染色过程中易脱 落,因此,在制片前载玻片上应涂黏附剂;②为节省试剂和便于观察,应将细胞集中在 0.6~1cm2的圆圈内,细胞总数以 105个为宜;③黏液丰富的标本,如痰液、胃液,未经特殊处 理,一般不宜作免疫组织化学染色。 组织标本的取材常受各种因素的影响,应注意:①活检钳的刃口必须锋利,以免组织受挤 压;②取材部位主要是病变区,但必须取病灶与正常组织交界区;③必要时取远距病灶区的正 常组织作对照;④为充分保存组织的抗原性,标本离体后应立即处理或速冻进行冷冻切片,或 立即用固定液固定,进行脱水、浸蜡、包埋。如不用迅速制片,也可贮于液氮或-70℃保存。 2 固定 固定在整个免疫组织化学技术中是关键所在。首先,通过固定可使细胞内蛋白质凝固,防 止细胞内酶反应过程,防止细胞自溶,保持细胞固有形态和结构;其次,通过固定可以保存组 织细胞的抗原性。固定不足,抗原会丢失;固定过度,则抗原性质改变或抗原成分被遮蔽。 2.1 固定液的选择 固定液的选择是免疫组化技术成功与否的基础。用于免疫组织化学技术的固定液种类较 多,性能各不一样。不同抗原,其稳定性各不相同,对固定液的耐受性差异较大。所以,除要 了解不同固定剂的特性外,不同的抗原和标本需经过反复试验,必要时可作多种固定液对比, 从而选出理想的固定液。选择最佳固定液的标准是:①最好地保持细胞和组织的形态结构;② 最大限度地保存抗原的免疫活性。中性缓冲多聚甲醛(或福尔马林)液是适应性较为广泛的固 定液。值得注意的是免疫组织化学技术中禁用含重金属的固定液。 2.2 固定时间因固定液而异 组织固定时间最好在 l2h 内,一般固定时间不应超过 24 小时。随着固定时间的延长对组 织抗原的检出强度将逐渐降低。 2.3 固定方法的选择 常用的固定方法有两种:浸入法和灌注法。浸入法即将组织浸泡在固定液内(必要时在 4 ℃下),固定时间根据抗原的稳定性以及固定液的性质而定,一般在 2-12h 之间。灌注法主要 适用于动物研究,灌注固定不仅可以使固定液迅速到达全身组织充分固定,而且灌注能冲洗掉 红细胞,排除过氧化物酶的干扰。 2.4 固定时应注意

力求保持组织新鲜,勿使其干燥;组织块不宜过大过厚,以体积<2cm×1.5cm×0.3cm 为 宜,组织块厚度必须控制在 0.3cm 以内;固定液必须有足够的量,在体积上一般大于组织 20 倍以上,否则组织中固定不良而影响效果;组织固定后,应充分水洗,去除固定液,以减少固 定液造成的人为假象。 (二)切片方法-细节注意 1 切片方法的选择 光镜和免疫组化研究的切片一般为 5μm,而神经组织切片为 20-100μm,有利于追踪神经 纤维的走行。 1.1 冰冻切片 是免疫组织化学中最常用的一种切片方法,能够最大量的保存抗原、操作简便,主要适用 于不稳定的抗原(如检测细胞膜的某些抗原成分),但标本来源受限。冰冻切片时,组织中水 分易形成冰晶,影响抗原定位。冰晶小而多,对组织结构损害大。因此可采用以下措施减少冰 晶的形成:①速冻,缩短组织从-33~-43℃的时间。具体方法是:⑴干冰-丙酮(乙醇)法: 将 150-200ml 丙酮(乙醇)装入小保温杯内,逐渐加入干冰,直至饱和呈粘稠状,再加干冰不 冒气泡时,温度可达-70℃。用一小烧杯(50-100ml)内装异戊烷约 50ml,再将烧杯缓慢置入 干冰丙酮(乙醇)饱和液内,至异戊烷温度达-70℃时即可使用。将组织(约 1cm×0.8cm× 0.5cm)t 投入异戊烷内速冻 30-60s 后取出,置-80℃低温保存或置恒冷冰箱内以备切片;⑵ 液氮法:将组织块平放于软塑料瓶盖或特制小盒内(直径约 2cm),如组织块小可适量加 OCT 包埋剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内,当盒底部接触液氮时即开始 气化沸腾。此时小盒保持原位切勿浸入液氮中,大约 10-20s 组织即迅速冰结成块。取出组织 块后立即置入-80℃冰箱贮存或作恒冷切片。②将组织置于 20%-30%蔗糖溶液中 1-3 天,利用 高渗吸收组织中水分,减少组织含水量。 冰冻切片一般用恒冷切片机。切片后如不染色,必须将切片吹干,贮存于低温冰箱内, 进行短暂预固定干燥后贮存于低温。 1.2 石蜡切片 用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规略有不同:①脱水、透明等过程应在 4℃下进 行,以尽量减少组织抗原的损失;②组织块大小应<2cm×1.5cm×0.2cm,使组织充分脱水、 透明、浸蜡;浸蜡、包埋过程中,石蜡应保持在 60℃以下,以熔点低的软蜡较好。组织块脱 水、透明和浸蜡时间可参考下表:

表1

组织块处理时间

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

70%乙醇 80%乙醇 90%乙醇 95%乙醇Ⅰ 95%乙醇Ⅱ 100%乙醇Ⅰ 100%乙醇Ⅱ 二甲苯Ⅰ 二甲苯Ⅱ 石蜡Ⅰ 石蜡Ⅱ

4℃ 4℃ 4℃ 4℃ 4℃ 4℃ 4℃ 4℃ 4℃ 60℃ 60℃

3-4h 3-4h 2-3h 2-3h 1-2h 1.5h 1.5h 0.5-1h 0.5-1h 1h 2h

目前我校形态学部配备有全套自动脱水仪,一系列过程都可实现自动化,有意要做石蜡切 片的同学可与王亚琴老师联系。 除上述两种切片方法外,还有振动切片、塑料切片、超薄切片、碳蜡切片等方法。振动切 片主要适用于免疫电镜观察,塑料切片的优点是可以同时作光镜和电镜检测,超薄切片用于电 镜标本的制作,碳蜡切片操作简便省时、抗原性保存比石蜡切片好且组织结构清晰,但夏季切 片困难。由于后四种切片技术在免疫组织化学技术应用不是很多,所以对其切片的细节注意事 项这里不作详细论述。 2 组织切片玻片的处理

2.1 载玻片和盖玻片的清洁 新的玻片上有油污,要用清洁液浸泡 12-24 小时,自来水冲洗后再用蒸馏水清洗 5 遍以 上,浸泡在 95%-100%乙醇内 2 小时,用绸布擦干或用红外线烤箱烤干即可。 2.2 载玻片涂黏附剂 为防止因冲洗频繁,致切片脱落,清洗干净的玻片上应均匀地涂一层薄薄的黏附剂。所使 用的黏附剂应定期更换成或新鲜配制,以确保合乎要求的黏附度。常用的黏附剂有:树脂胶、 铬明矾明胶、多聚赖氨酸、甘油明胶、甲醛明胶、APES 等。下面具体介绍三种最常用黏附剂 的使用注意事项及其优缺点。

2.2.1 Poly-L-Lysine (多聚左旋赖氨酸)

一般采用分子量 30000 左右的 0.5%多聚赖氨酸最

好,也可用试剂公司出售的其浓溶液以 1:10 去离子水稀释。方法是将玻片浸泡其中,倾尽余 液,在 60℃温箱中烤干备用,此方法的优点是可以用于多种组织化学、免疫组化及分子学检 测中的应用,粘贴效果最好,但价格稍贵。 2.2.2 明胶硫酸铬钾法 将 2.5g 明胶加热溶于 500ml 蒸馏水中,完全溶解冷却后加入 0.25g 硫

酸铬钾搅匀充分溶解即可使用。方法是将玻片浸泡其中 2 min,取出控尽液体入温箱中烤干备 用。此法价格便宜、方法简单,任何实验都可以使用,特别适用于大批量的使用,但应注意, 如果液体变蓝或粘稠状停用。 2.2.3 APES (3-氨丙基-乙氧基甲硅烷) 此法必须现用现配。将洗净玻片入 1:50 丙酮稀释的

APES 中,浸泡 20s,取出稍停再入丙酮或蒸馏水中刷去末结合的 APES 晾干即可。用此方法 粘合的玻片应垂直烤片不能平拷,否则组织片中易出现气泡。

三、 免疫组织化学技术细节处理各论

(一)免疫荧光细胞组织化学技术-细节注意 1 荧光显微镜标本制作要求 必须光洁,厚度均匀(0.8-1.2mm),无明显自发荧光。 光洁,厚度在 0.17mm 左右。 必须无自发荧光,无色透明,常用甘油和 0.5mol/L PH9.0-9.5 碳酸盐缓冲液的

1.1 载玻片 1.2 盖玻片 1.3 封固剂

等量混合液作封固剂。 1.4 标本 组织切片或其他标本不能太厚,如太厚激发光大部消耗在标本下部,而物镜直

接观察到的上部未充分激发。另外,细胞、组织重叠或杂质掩盖影响判断。 1.5 镜油 一般暗视野荧光显微镜和油镜观察标本时,必须使用镜油,最好使用特制的无

荧光镜油,也可以用缓冲甘油代替。液体石蜡也可用,但折光率较低,对图象质量略有影响。 2 2.1 2.2 荧光染色注意事项 染色反应最好在湿盒内进行,以免标本上的试剂干燥,造成非特异性染色。 染色反应的酸碱度以接近体液环境为宜(PH7.4 左右),因此,切片冲洗液及抗体稀释

液均应注意酸碱度的调整。 2.3 组织细胞要求新鲜,因此冰冻切片是免疫荧光染色的首选方法,同时注意避免切片折叠

或杂质过多,以免影响荧光的观察。 2.4 切片经染色后,应及时观察并照相,不宜长期保存,以免褪色。切片在 4℃冰箱内过

夜,其荧光强度将减弱约 30%。 2.5 抗体稀释度以获得最佳染色效果,背景非特异性染色最小为标准,因此对每一批抗体必

须试验摸索,找出最佳稀释浓度。 2.6 2.7 3 为防止抗体效果下降,所购抗体应及早试验,并应尽量减少抗体溶液的冻溶次数。 若非特异性染色过强时,在染色反应前应先将荧光抗体离心,去除沉淀物后再使用。 使用荧光显微镜注意事项 检查时间以每次 1-2h 为宜,超过 90min,超高压汞灯发光强度逐渐下降,荧光减弱;标本 受紫外线照射 15min 后,荧光也明显减弱。所以最多不得超过 2-3h。 (二)免疫酶细胞组织化学技术 免疫酶细胞组织化学技术与免疫荧光技术相近,所不同的是利用酶标抗体与组织抗原结合 后,形成有色沉淀再观察。但与免疫荧光技术相比,该法终产物可在普通光镜下观察,切片能 够长久保存,反复观察,适合于镜下半定量分析,DAB 终产物具有嗜锇酸性,经锇酸处理后, 电子密度增强,可用于电镜观察。技术细节同上述总论中所介绍。 (三)亲合组织化学技术-细节注意 亲合组织化学技术引入免疫细胞化学后使其敏感性进一步提高,更利于微量抗原(抗体) 在细胞或亚细胞水平的检测。目前已经建立的方法有 ABC 法、LAB 法、BRAB 法、SPA-HRP 法、 凝集素法等。这些方法的共同特点是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的。这 里仅介绍最为常用及多见的 ABC 法。 ABC 法即抗生物素-生物素-过氧化物酶法。ABC 法是 Hsu 等于 1981 年在 BRAB 法和 LAB 法 的基础上改良的。其特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的第 2 抗体和生物素标记的酶。 其第 1 抗体不为标记物所标记,生物素标记的第 2 抗体与 ABC 复合物相连接。ABC 复合物是将 过氧化物酶结合在生物素上,再将生物素-过氧化物酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制 备的。ABC 法的优点是:敏感性强,特异性强,背景染色淡,方法简单,节约时间,并且由于 生物素与抗生物素具有和多种示踪物结合的能力,可用于双重或多重免疫染色。 ABC 法实验注意事项: 1 内源性生物素活性及其清除 某些组织和细胞内存在着内源性生物素,在应用该染色方法时会与抗生物素结合而产生非 特异性染色。因此,对抗生物素结合性较高的组织,如肝、肾、白细胞、脂肪组织、乳腺等, 在进行ABC染色前应预先以 0.01%的抗生素和 0.01%的生物素溶液分别作用 20min,以消除其内 源性抗生物素结合活性,每次作用后用PBC洗 5 分钟。必要时,也可用 0.3%H2O2-甲醇液孵育以 消除内源性过氧化物酶活性。

2

生物素制剂之间相互亲和性差异很大,因此在应用 ABC 试剂时,应注意厂家批号,对购买

试剂应进行事先预测,以保证实验结果的稳定性。 3 坏。 ABC 试剂保存以 4℃为佳,据报告保存可达两年之久;而在-20℃生物活性在短期内即被破

四、免疫组织化学技术试剂购买及其保存

(一) 免疫组织化学技术试剂正确选择、购买及使用 1 一抗的正确选择与使用 1.1 首选单克隆抗体:单克隆抗体具有高特异性、高亲和力、交叉反应少等特点,避免与细胞 或组织蛋白的非特异性结合,减少染色背景。 1.2 多克隆抗体:最好是经样本来源种属正常血清吸附过,尽可能的减少非特异性着色背景。 加一抗前,用封闭液(可以是 BSA 或二抗来源的正常动物血清)充分封闭,以阻断非特异性结 合位点。 1.3 正确使用:一般供应商都会提供稀释范围和使用方法。但由于供应商质检所用组织不

同,实验条件和操作人为误差,常常需要客户自己再重新选择比例。一般供应商提供稀释比例 从 1:10 稀释度始作倍比稀释。 2 二抗的正确选择与使用

2.1 种属来源要匹配:根据所用一抗选定二抗。一般来说,如果一抗是小鼠源性,二抗应选择 兔/山羊或其它种属抗小鼠的抗体。目前,美国 Vector 公司和 Zymed 公司都有开发的用小鼠抗 体检测小鼠组织的试剂盒,即一抗来源于小鼠,该试剂盒采用了通用非特异性封闭液和专利封 闭内源性小鼠 Ig 的封闭液,可以得到清晰的染色背景。 2.2 注意抗体同种型和亚型:确定一抗同种型和亚型后,可以选择抗一抗来源种属广谱 Ig 或 针对一抗亚型的二抗。如一抗是小鼠 IgG1,可以选用山羊抗小鼠的 Ig 或 IgG1 的二抗。 2.3 正确使用:也需要重新选择稀释比例。一般供应商提供稀释比例从 1:10 稀释度始,作

5 倍比稀释。 3 检测系统的正确选择 检测系统一般有酶法、荧光法和亲和放大系统:亲和素-生物素放大系统很常用,但由于 内源性亲和素和生物素广泛存在,经典的 SP、SRABC 和 LSAB 法等常出现背景着色,尤其是内 源性生物素丰富的肝、肾染色时很难避免。Zymed 公司研发的非生物素放大试剂盒 NAB 和 Picture Plus 试剂盒,采用多聚氨基酸支架偶联多个抗体和酶、荧光素等信号检测分子起到

良好的放大效果,具有高敏、背景清晰等优点。对于啮齿动物组织的免疫化学检测:由于啮齿 动物非特异性结合强,最好选用美国 Vector 公司和 Zymed 公司都有开发的用小鼠抗体检测小 鼠组织的试剂盒。 购买时要求试剂公司提供标准化的试剂,并附详细的试剂说明书,例如抗体的说明书应包 括抗体的来源、免疫球蛋白的亚类、单抗或多抗、使用稀释度、使用流程和注意事项、洗涤时 缓冲液的适宜离子强度和 PH 值等。经广泛的文献查阅及与使用者的多次交流,这里特别推荐 Sigma 公司,Santa Cruz 公司,北京中山生物技术有限公司,武汉博士德生物工程有限公司, 福州迈新生物技术有限公司。 (二)试剂保存 1 抗体试剂保存 抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成,常用的有聚丙烯,聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。 抗体浓度越高(浓度大于 10mg/ml),越稳定,易保存;浓度低时,应加 0.1%-1.5%的牛血清 白蛋白作保护剂;必要时需要加 0.01-0.15%NaN3防腐剂以延长保存时间。酶标记抗体在应用 防腐剂时要注意不能用NaN3,否则会抑制酶的活性。抗体浓缩液应在-20℃保存,可以长达两 年;用时取出,室温融解,如一次或短时间用不完,应进行小量分装,-20℃保存,避免反复 冻融;融解后抗体于 2-8℃可以保存一个月。稀释的抗体不能长时间保存,在 4℃下可存放 13 天,超过 7 天效价显著降低。用作抗体的稀释液,在夏天温度很高时,最好加入少许防腐剂 如叠氮钠、柳硫汞等,以免在切片上作用时间超过 10 小时而生霉菌。 2 试剂盒保存 完整试剂盒未打开前于 2-8℃可以保存一年,打开后,应根据说明书要求对具体试剂进 行适当存放。一般标准品应放置-20℃,用不完的抗体试剂应小量分装-20℃保存。

综上,由于免疫组织化学技术的高特异性、高敏感性,集形态、功能、代谢与一体,及其 操作简单、试剂来源稳定、价格适中等特点,都使得其广泛地应用于生物医学研究及临床病理 诊断中。我们也有理由相信,随着更多新技术的涌入及改善,这门新型的技术将发挥越来越巨 大的作用。


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免疫组织化 免疫组织化学免疫组织化学(Immunohistochemistry)又称免疫细胞化学。它 ...(3)按标记物的性质分成: ①免疫荧光技术(免疫荧光法); ②免疫技术(酶标...
免疫组化各步原理
一、免疫组化技术 免疫组织化学(Immunohistochemistry; IHC) 技术是用标 记的...(二) 胞核阳性 Slide 31: 二、常见问题及对策 Slide 32: 由于免疫组化染色...
病理学技术复习题
病理学技术复习题_医学_高等教育_教育专区。1.何谓超薄切片? 由于电镜电子束...这种技术称为免疫组织化学技术 (immunohistochemistry)免疫细胞化学技术(...
免疫组化实验
称为免疫组织化学技术(Immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(I mmuno...但是,由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜,荧光强度随时间的延长 而逐渐消退,结果不...
病理题库
0.2.10 由于肉眼检查病变 学的研究范畴? (...活检采取病变组织 技术因其灵敏度高、 诊断准确, ...免疫组织化学 基因诊断 (gene (immunohistochemistry) ...
细胞免疫技术
同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研 究,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)免疫细胞化学技术 (...
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