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液相色谱-质谱联用


CONTAIN
Liquid Chromatography
Structure Progress Application

history

液相色谱-质谱联用 Liquid Chromatography -Mass Spectrometry
朱娜 nzhu@sjtu.edu.cn

1906年俄国植物学家Tsweet创立色谱法 30年代茨维特分离绿叶色素 40年代TLC,纸色谱 50年代GC出现使色谱具备分离和在线分析功能 60年代末HPLC出现,使色谱分析范围进一步扩 大

Mass Spectrometry
Quadrupole Iron trap Time-of-flight Application

HPLC Analysis Parameters

Auto Sampler

Separations
Injector

Mixer Solvent Reservoirs

Mobile Phases Flow Rate Composition
Autosampler Pumps

Separation in based upon differential migration between the stationary and mobile phases. Stationary Phase - the phase which remains fixed in the column, e.g. C18, Silica

Degasser Pump

Column

Column Compartment

Injection Volume Column Oven Temperature Wavelength Time Constant

Detector

Detector

Mobile Phase - carries the Waste Solvents sample through the stationary phase High Performance Liquid Chromatographas it moves through the column.

1

Optimal Flow Rates for LC Columns UV-VIS

Common HPLC Detectors

紫外检测器
应用最广,对大部分有机化合物有响应。 特点: 灵敏度高; 线形范围高; 流通池可做的很小(1mm × 10mm ,容积 8μL); 对流动相的流速和温度变化不敏感; 波长可选,易于操作; 可用于梯度洗脱。

可变单波长检测器VWD
MS FLD MS:质谱检测器 8% Electro RI: refractive index detector示差折光检测器 10% FLD: fluorescence detector荧光检测器 UV-VIS RI 10% 65% ELSD

二极管阵列检测器DAD

ELSD:evaporative light-scattering detector 蒸发光散射检测器 电化学检测器

DAD

UV detector

RI
通用型检测器(每种物质具有不同的折光指数) 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。 差值与浓度呈正比; 灵敏度低、 对压力和温度敏感、不能用于梯度洗脱; 流动相流速影响检测信号(流通池的几何形状、大小及材 料、检测器的光路系统)

2

RI
可分为:偏转式、反射式和干涉型三种;

ELSD
是90年代开始在全国普及,作为新一代通用检测器的逐 步替代示差检测器。 优点: 通用型质量检测器 灵敏度高于RI 可以进行梯度洗脱 可作为SEC和SFC色谱/细内径LC检测器 可测定磷脂、皂甙、糖类、聚合物、树脂 限制: 受样品组分和流动相的挥发性的影响,不能完全替代示 差检测器 高灵敏度、高选择性;

FLD

线性范围宽,外界条件及 流动相的影响小 应用范围窄 背景荧光、淬灭荧光等干 扰 对多环芳烃,维生素B、 黄曲霉素、卟啉类化合物、 农药、药物、氨基酸、甾 类化合物等有响应;

电化学检测器 测量溶液整体性质(通用性强) 电导检测器和电容检测器
离子色谱法最主要检测器 测定多种阴阳离子的灵敏检测器 检测信号是离子电导与流动相电导之差、负值. 温度对信号的影响比较大 抑制柱降低本底电导.可分为抑制电导和非抑制电导二 种类型

检测器的发展

The Chromatogram

荧光 电化学
示差折光 紫外
保留 时间

增加灵敏度 增加 选择性
PDA

to - elution time of unretained peak tR- retention time - determines sample identity tR

增强结构 确认能力
FT




mAU

tR
Area is proportional to the quantity of analyte.

保留
IR

时间

测量溶质组分性质(灵敏度和选择性好) 安培、极谱、库仑、电位检测器

to Injection time

3

Parameter resolution :R Theoretical plate : n separation selectivity :a capacity factor :K’
R=

resolution R Sig

resolution R

time Sig

t r2 t r1 2(t r2 t r1 ) = 1 W1 + W2 (W + W2 ) 2 1
time Sig

time

resolution R

色谱参数
容量因子:K’=(TR-T0)/T0
初始

色谱参数
分离选择性:a a=K’B/K’A 对分离度影响较大 改变流动相组成 改变流动相PH值 改变柱温 改变容量因子

S
R= k α 1 ( )( 2 ) 4 1 + k2 α N2

溶质在色谱柱中分离后的容量因子K’, 1<K’<10 可以通过改变溶剂的洗脱强度来改变K’ 洗脱强度加大,降低洗脱物的容量因子

增大k

增大N k 改变α k/(1+k)

0.5

1.0

3.0

5.0 0.83

8.0 0.89

10 0.91

30 0.97

50 0.98

α (α-1)/ α

1.0 0

1.001 0.001

1.01 0.01

1.1 0.091

1.5 0.33

2.0 0.50

t

0.33 0.50 0.75

4

影响分离的因素

1. 影响分离的因素——流速

2. 固定相及分离柱

在高效液相色谱中, 速率方程中的分子扩散项B/U较小, 可以忽略不计,而只有两项,即: H=A+Cu 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同,如图所示:

流速大于0.5 cm/s时, H~u曲线是一段斜率不大的直 线。降低流速,柱效提高不是 很大。但在实际操作中,流量 仍是一个调整分离度和出峰时 间的重要可选择参数。

气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱,其 选用原则与气相色谱一样。 选择合适的固定相,降低填料粒度可显著提高柱效, 但在高效液相色谱中,分离柱的制备是一项技术要求非常 高的工作,一般很少自行制备。 选择短柱、细内径提高分析速度; 研制高效柱填料是一活跃领域。

影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。

3. 流动相及流动相的极性

流动相组成

选择流动相时应注意的几个问题:

(1)可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱 中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为:淋洗液,洗脱 剂。 (2)亲水性固定液常采用疏水性流动相,即流动相的极 性小于固定相的极性,称为正相液液色谱法,极性柱也称正 相柱。 (3)若流动相的极性大于固定液的极性,则称为反相液 液色谱,非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上 的出峰顺序相反。

流动相按组成不同可分为单组分和多组分; 按极性可分为极性、弱极性、非极性; 按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相 的极性或增加选择性,以改进分离或调整出峰时间。

(1)尽量使用高纯度试剂作流动相,防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 (2)避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。如使固定液溶解流失;酸性溶剂破坏氧化铝固定 相等。 (3)试样在流动相中应有适宜的溶解度,防止产生沉 淀并在柱中沉积。 (4)流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外 检测器时,流动相不应有紫外吸收。

5

Mass Spectrometry 质谱分析法(MS)是将分析样品离子化,使带 正电的离子加速并在电磁场的作用下,按不同的 质荷比(m/z)分开,形成相应的质谱图。根据质谱 峰出现的位置,可进行定性分析,根据质谱峰的 强度可进行定量分析

Mass Spectrometry
70年代末出现最早的质谱检测器,80年代后期电喷雾技 术的发展LC-MS技术开始成熟。 1992年, ESI(大气压电喷雾) 1993年, APCI技术的出现(大气压化学电离)为小及中 等分子量有机物,药物及代谢物分析提供了帮助。 目前质谱检测器应用越来越多。 LC-MS:结合HPLC对复杂基体化合物的高分离能力与 MS的独特选择性、灵敏度、分子量及结构信息与一体 困难在于LC-MS压力匹配问题、流量匹配问题、难挥发 溶剂的排除问题

Mass Spectrometry “Simplified”

离子源 离子源的作用是将欲分析样品电离,得到带有 样品信息的离子。质谱仪的离子源种类很多:
1、电子电离源(Electron Ionization ,EI) 2、化学电离源(Chemical Ionization , CI )。 3、快原子轰击源(Fast Atomic bombardment, FAB) 4.电喷雾源(Electron spray Ionization,ESI) 5.大气压化学电离源(Atmospheric pressure chemical Ionization, APCI)

ESI

现将主要介绍电喷雾源(Electron spray Ionization,ESI)

6

Mass Spectrometry Quadrupole Iron trap Time-of-flight Fourier transform ion cyclotron resonance

Quadrupole

Iron trap

7

Time-of-flight

Quadrupole

Four ages of ion trap technology 是目前最成熟的 用于HPLC的质谱 分析器
质谱图可靠 所需的真空度相 对较低

Ltq Mass

8

“3D” vs “2D” or Linear Ion Trap

Linear Ion Trap Stability

飞行时间质谱计
工作原理简单。质量分析器既不需要磁场,又不需要场,只需要直 线漂移空间,因此,仪器的机械结构较简单,增长漂移路程L就可以
Molecular Weight

液质联用技术的应用范围

Protein Identification Strategy

100,000

Electrospray

生物大分子

提高分辨本领。 快速。在约20ms时间内,就可以记录质量为0—200a.m.u.的离子。 要在短时间内快速记录微弱的离子流,只能采用高灵敏、低噪音的 宽频带电子倍增管,因此仪器的电子部分要求高。 质量分析系统需处于脉冲工作状态,否则就无法确定离子的起始和 到达时间,无法区分到达接受器的不同质量。

Dynamic FAB Particl e Beam GC

APcI
药物
Ionic

0 Covalent

Polarity

农药,杀虫剂 农药,杀虫剂

9

Protein digestion

Single Stage MS

Tandem MS

cleaves C-teminal side of arginine (R) and lysine (K) tryptic peptides:

MS/MS Data Acquisition

Steps to Ion Trap Scan Functions

LC/MS/MS

Trapping-all scans Isolation-SIM and MSn Excitation-MSn Ejection-all scans

10

Average vs. Monoisotopic Mass

Peptide Fragmentation Nomenclature

Fragmenting a Peptide A-P-N-D-F-N-L-K (MH+ 918.5)

Sequence vs. Tandem Mass Spectrum

A-P-N-D-F-N-L-K (MH+ 918.5)

11

Fragmentations of de novo Sequencing (C-term)
…‘C-terminal Sequencing’ involves b-ions
H+
O H2N N H CH3 O CH2 H H N N H O O CH2CH2CH2CH2NH3+ OH

AGFK (M+H)+ = 423.2 m/z Doubly-Charged at 211.6 m/z

O H2N N H CH3

H N C H2

AGF

O

OH+

H

N OH+ H2N O

AG

CH3

b3 = 423.2 – Lys – H2O = 423.2 – 128.1 – 18 = 276.1 m/z b2 = 276.1 – Phe = 276.1 – 147 = 129.1 m/z

Fragmentations of de novo Sequencing (N-term)
…‘N-terminal Sequencing’ involves y-ions
100

Sequence Verification
428.5 428.2
100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
100

Assigning the Peaks in the Spectrum
633.2

O HN 2

H H N N H

O

CH2C 2CH CH NH3+ H 2 2
95

O H N H

(M+H)+

Relative Abundance

= 423.2 m/z Doubly-Charged at 211.6 m/z y3 = 423.2 – Ala = 423.2 – 71 = 351.2 m/z

AGFK
CH 3

90 85

O

C2 H

O

80 75 70 65

Charge State = 3 MWCalc = (3 × 428.2) – 3 = 1281.6 Da.
428.5

95 90 85

b
D R 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 116.0 272.1 371.2 * 534.3 647.4 784.4 881.5 1028. 5 1165. 6 1278. 7 V

y
1296.7 1181.7 1025.6 926.5 763.4 650.3 * 513.3 * 416.2 * 269.2 * 132.1 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

513.2

80 75 576.4 70

Y I H

GFK
H2N O

Relative Abundance

Relative Abundance

H H N

O

CH2CH2CH2CH2NH3+ OH N H

60 55 50 45 40 35

428.8 429.2

CH2

O

Sequence: DRVYIHPFHL MWTheo = 1295.6 MW wrong !
430

65 60 55 50 45 40 577.1 35 30 508.0 562.4 371.8 390.1

P F H L

429.5
428 429

O

CH2CH2CH2CH2NH3+ OH N H

30 25

y2 = 351.2 – Gly = 351.2 – 57 = 294.2 m/z y1 = 294.2 – Phe = 294.2 – 147.1 = 147.1 m/z

FK K

514.2 585.4 634.2 770.3

H2N

20

m/z 321.7 642.0

25 20 495.1 493.9 534.2

CH2

O
CH2CH2CH2CH2NH3+ OH H2N O

15 10 5

426.0 15 10 5 131.8 145.2 269.1 325.9 314.2 363.5

The mass is off by 14 Da. Could it be a IV switch ?
1014.3 840.4 871.5 882.5 916.2 982.8 900 1000 1064.2 1102.8 1170.3 1195.4 1100 1200 1259.2

605.2 635.2 436.8 400 500 600 684.1 700 m/z 743.2

771.3 772.3 800

0 300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

500

520

540 m/z

560

580

600

620

640

660

680

700

720

740

760

780

251.1 217.1 200

0 300

12

Fixing the Error in the Sequence
100 95 90 85 80 75 576.4 70 65 60 Relative Abundance 55 50 45 40 577.1 35 30 25 20 426.0 15 10 5 0 200 300 400 500 600 700 m/z 800 900 1000 131.8 145.2 269.1 325.9 314.2 605.2 635.2 436.8 684.1 743.2 1014.3 771.3 772.3 840.4 871.5 882.5 916.2 982.8 1064.2 1102.8 1170.3 1195.4 1100 1200 1259.2 363.5 495.1 493.9 534.2 508.0 562.4 371.8 390.1 633.2

Correcting the Sequence
y

Interpreting a Doubly-Charged Spectra
Zoom Scan – 2+

b
D 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 116.0 272.1 371.2 * 534.3 * 633.3 * 770.4 867.4 * 1014.5 1151.6 1264.7 1282.7 1167.6 1011.5 912.5 749.4 650.3 * 513.3 * 416.2 * 269.2 * 132.1 R V Y V H P F H L

10
620.3

513.2

9 8 7 6 5 4 3 2 1

y5 y4 y3 y2

mono = 620.3 Avg = 620.8
620.8

514.2 585.4 634.2 770.3

b4 b5 b6 b8

DRVYVHPFHL
621.3

Tryptic Peptide MWMono = 1238.6 Da.

251.1 217.1

619.8 620.0 620.2 620.4 620.6 620.8 621.0 621.2 621.4 621.6 621.8 622.0 622.2 622.4 622.6 622.8 623.0 623.2 623.4 m/z

Finding the a2 / b2 Combo
rat_hexokinase #1001-1012 RT: 19.42-19.59 AV: 4 NL: 6.50E6 T: + c d Full ms2 620.61@35.00 [ 160.00-1255.00] 989.5

Is there a (M+H)-R-H2O or a (M+H)-K-H2O ?
rat_hexokinase #1001-1012 RT: 19.42-19.59 AV: 4 NL: 5.96E5 T: + c d Full ms2 620.61@35.00 [ 160.00-1255.00] 1102.5 1103.6

Is there a Supporting Y1 ?
rat_hexokinase #1001-1012 RT: 19.42-19.59 AV: 4 NL: 1.43E6 T: + c d Full ms2 620.61@35.00 [ 160.00-1255.00] 223.1

100 95 90 85 80 75 70 65 60 Relative Abundance

100

Is there an abundant pair of low mass ions 28 Th. apart ?

95 90 85 80 1008.3 75 70 65 60 Relative Abundance

(M+H)-R-18 = 1239.6 - 156.1 - 18 = 1065.5 {bn-1} (M+H)-K-18 = 1239.6 - 128.1 - 18 = 1093.5 {bn-1}
Relative Abundance

100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 178.2

y1 = 175.1 Not Present

55 50 45 40 35 30 25 20 15 232.1 10 5

1009.4

40

990.4

35 30

-R
bn-1
1065.5 1066.6 1112.6 1113.5

662.3

a 2 b2
533.3 348.2 361.2 223.1 251.1 578.3 479.2

761.4

874.4

25 20

232.1

28 Th. Combo

Four Possibilities Exist: CF FC (I/L)H H(I/L)
707.3

55 50 45

251.1 195 200 205 205.8 210 215 m/z 220 224.1 225 230 235 240 245 250 250.5 252.1 255

20 15 10 5 0 160

880.3 879.3

15

611.6

1102.5 1103.6

579.3

10 5 0

0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 m/z 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250

1000

1020

1040

1060

1080

1100

1120 m/z

1140

1160

1180

1200

1220

1240

165

170

175

180

185

190

260

265

13

Can we Identify a b-ion Series ?
rat_hexokinase #1001-1012 RT: 19.42-19.59 AV: 4 NL: 6.50E6 T: + c d Full ms2 620.61@35.00 [ 160.00-1255.00] x3 989.5 x3

Can we Identify a y-ion Series ?
rat_hexokinase #1001-1012 RT: 19.42-19.59 AV: 4 NL: 6.50E6 T: + c d Full ms2 620.61@35.00 [ 160.00-1255.00] x3

Building the Sequence from the Information
x3

-113 -(I/L)
989.5

100 95 90 662.3 85 80 75 70 65 60 Relative Abundance 55 50 45 40 35 30 25 20 252.1 343.3 451.3 476.3 480.3 178.2 250.5 15 10 5 232.1

100 95 90 85 80

348.2 361.2

348.2 361.2

223.1

1102.5 1103.6

579.3

-115 -D (764.4)
762.3 750 800 850

366.1

611.6

880.3

1008.3

534.3

663.3

663.3

708.2

20 343.3 252.1 178.2 250.5 15

708.2

762.3

1008.3

534.3

25

366.1

611.6

880.3

30

232.1

1102.5 1103.6

579.3

-99 V -113 (I/L)
479.2

251.1

Relative Abundance

-57 -G
1009.4

479.2

-129 -E
879.3 990.4

578.3

60 55 50 45 40 35

578.3

65

251.1

-115 D

874.4

-129 E

533.3

75 70

707.3

707.3

-57 -G

-129 -115 -E -D
223.1

-129 -E
533.3

-99 -113 -V -(I/L) 1239.6 – C = 1136.6 -115 1239.6 – F = 1092.5 -D 1239.6 – I = 1126.5 1239.6 – H = 1102.5
662.3 761.4 879.3 874.4

C F F C From a2 / b2 combo H (I/L) (I/L) H D (I/L) V E G D E G R From b-ions From y-ions H (I/L) D (I/L) V E G D E Overlap H (I/L) D (I/L) V E G D E G R

761.4

-57 -G
451.3 476.3 480.3

990.4

-H

602.6

644.4

-R
1050 1100 1150 1200 1250

10 5 0

MWTheo = 1238.6 (Matches)
1050 1100 1150 1200 1250

0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 m/z 900 950 1000

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700 m/z

750

800

850

900

950

1000

bioworks

result

Peptides which match by MW

Sp

b, y, and Xcorr Immonium Ions’ Mass Match

Best Match by Mass and Shape

1009.4

602.6

644.4

14

Advantage vs. Disadvantage Advantage
Tandem (easily) sensitivity

Protein analysis
Peptide, no protein Enzyme purity contamination

Thanks!
Disadvantage
Accuracy (mass and amplitude) Stability

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