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木聚糖酶基因克隆表达与木聚糖酶活力的测定


木聚糖酶基因克隆表达与木聚糖酶活力的测定
2000 级生物技术专业,翁杰、张弢 木聚糖酶(endo-1,4-beta-xylanase E.C.3.2.1.8)是一类以内切方式专一性水解 木聚糖分子中β-1,4-糖苷键的酶,其水解产物主要是木二糖和木寡糖。很多细菌和 真菌都可以产生木聚糖酶,有些木聚糖酶已被分离纯化并对其进行了性质研究,木 聚糖酶基因也已被克隆和表达。

自七十年代末,八十年代初开展木聚糖酶基因的研 究工作以来,已有上百种来自真菌和细菌的木聚糖酶基因被克隆并在大肠杆菌中表 达。一般都是以传统的方法:提取染色体法制备感受态细胞或电转化法转化受体细 胞大肠杆菌,从转化子中筛选出阳性克隆。 以下是木聚糖酶和木聚糖酶基因 xynA 的序列 endo-1,4-beta-xylanase Length:213aa,molecular weight:23345Da,CRC64 check sum:20CBA35238CC0564
MFKFKKNFLV GLSAALMSIS LFSATASAAS TDYWQNWTDG GGIVNAVNGS GGNYSVNWSN TGNFVVGKGW TTGSPFRTIN YNAGVWAPNG NGYLTLYGWT RSPLIEYYVV DSWGTYRPTG TYKGTVKSDG GTYDIYTTTR YNAPSIDGDR TTFTQYWSVR QSKRPTGSNA TITFSNHVNA WKSHGMNLGS NWAYQVMATE GYQSSGSSNV TVW 213

Bacillus subtilis endo-1,4-beta-xylanase gene,complete cds 702bp DNA BASE COUNT 207a 123c 182g 190t ORIGIN 1 tacctcaaag tcggaaaaaa tattatagga ggtaacatat gtttaagttt aaaaagaatt 61 tcttagttgg attatcggca gctttaatga gtattagctt gttttcggca accgcctctg 121 cagctagcac agactactgg caaaattgga ctgatggggg cggtatagta aacgctgtca 181 atgggtctgg cgggaattac agtgttaatt ggtctaatac cggaaatttc gttgttggta 241 aaggttggac tacaggttcg ccatttagga cgataaacta taatgccgga gtttgggcgc 301 cgaatggcaa tgggtatttg actttgtatg gctggacgag atcgcccctc atagaatatt 361 atgtggtgga ttcatggggt acttataggc ctaccggaac gtataaaggt actgtaaaga 421 gtgatggggg tacatatgac atatatacaa ctacacgtta taacgcacct tccattgatg 481 gcgatcgcac tacttttacg cagtactgta gtgttcgcca gacgaagaga ccaactggaa 541 gcaacgctac aatcactttc agcaatcag tggacgcatg gaagagccat ggaatgaatc 601 tgggcagtaa ttgggcttac caagtcatgg cgacagaagg atatcaaagt agtggaagtt 661 ctaacgtaac agtgtggtaa cagatcatcc ttaatcaggg gt 实验步骤 一, 培养 Bacillus subtilis 培养基 NUA 二, 细菌基因组 DNA 的提取 材料:TE 缓冲液,10%SDS,20mg/ml 蛋白酶 K,5mol/L NaCl,CTAB/NaCl 溶液, 24:1 氯仿/异戊醇,25:24:1 酚/氯仿/异戊醇,异戊醇,70%乙醇

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步骤: 1,培养 5ml 细菌培养物至饱和,取 1.5ml 培养物离心 2min 2,沉淀物加 567μl 的 TE 缓冲液重悬。加 30μl 10%SDS 和 3μl 20mg/ml 的蛋白 酶 K,混匀,37℃温浴 1h 3,加 100μl5mol/L NaCl,充分混匀,再加 80μlCTAB/NaCl 溶液,混匀,65℃温浴 10min 4,加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,离心 4-5min,留上清 5,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇,混匀,离心 5min,留上清 6,加入 0.6 体积异戊醇,轻轻混合到 DNA 沉淀下来,取沉淀(沉淀可稍加离心) , 用 1ml70%乙醇洗涤 7,离心 5min,弃上清,稍干燥 DNA,重新溶于 100μl TE 缓冲液中 三, 酶切 目的基因序列前有酶切位点: Sap Ι:AAT/ATT MboΙ,Sau3A I,DpnⅡ:/GATC 目的基因序列后有酶切位点 MseΙ:T/TAA 四, 电泳并回收目的基因 凝胶缓冲液、电泳缓冲液 1 X TAE。玻璃奶回收目的基因。 五, PCR 基因扩增 六, 质粒 DNA 的制备 方法同《分子生物实验指导》实验二 七, 目的基因重组进质粒 八, 制备涂菌的琼脂板 LB 培养基含氨苄青霉素 100μg/ml,琼脂 15g/L,倒入培养皿 九, 制备感受态细胞 方法同《分子生物实验指导》实验一 十, 重组质粒转入 E.coli 1.200μl 感受态细胞中,加入 5μl 连接物,混匀,冰上放置 30min,同时作两个对 照管。 受体菌对照:200μl 感受态细胞+2μl 无菌水 质粒对照:200μll0mol/LcaCl2+2μlpUC19 质粒 DNA 溶液 2.将管放到 42℃水浴,1-2min 3.冰上放置 1-2min 4.每管加 800μL LB 液体培养基(轻轻混匀) ,37℃温浴 1h,慢摇 十一,筛选阳性克隆 筛选方法 1 粗筛: 1. 在预制的 LB 琼脂平板上,加 40μl20mg/mlXgal 和 40μl20mg/mlIPTG 溶 液,并均匀涂布 2. 将适当体积(200μl)已转化的感受态细胞均匀涂在上面的培养皿上,

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放置 37℃温箱至液体被吸收 3. 倒置平皿 37℃培养 12-16h,出现菌落,其中白色菌落为重组 DNA 质粒 4. 按照前面方法提取质粒 细筛: 5. 重新酶切 6. 1.5%琼脂糖凝胶电泳,观察条带 筛选方法 2 原理:阳性克隆子可分解深蓝 RBB-木聚糖从而使菌落周围形成透明圈 1.制作选择平板:在预制的 LB 琼脂板上,加深蓝 RBB-木聚糖,并涂布均匀 2.将适当体积(200μl)已转化的感受态细胞均匀涂在含上面的培养皿上,放置 37 度温箱至液体被吸收 3.倒置平皿,37 度培养过夜,出现菌落,阳性克隆子菌落周围形成的透明圈的是 阳性克隆子 筛选方法 3 原理:基于刚果红能与有β-1,4-糖苷键连接的纤维性底物紧密结合染成红色,糖 苷键水解后这种红色又可被 NaCl 溶液脱去 1.制作选择平板:在预制的 LB 琼脂平板上,加木聚糖,并涂布均匀 2.适当体积(200μl)已转化的感受态细胞均匀涂在含上面的培养皿上,放置 37 度温箱至液体被吸收,倒置平皿,37 度培养过夜 3.用 0.1%刚果红染色 30min 4.用 1mol/lNaCl 溶液脱色 20min 左右,观察阳性克隆子周围形成透明圈 5.若再用 1mol/lHCL 处理,可使背景变成深蓝,且可保存较长时间 十二,阳性重组菌的培养 十三,目的蛋白(木聚糖酶)的提取 超声波破碎: 1. 收集诱导表达的细菌(1000ml) ,4℃,离心 500g,15min。 2. 弃上清,每克菌加 3ml TE Buffer。 3. 根据厂家提供的超声波仪的数据进行破菌。 4. 离心 10000g,15min,分别收集上清和沉淀加入等体积的 2×Loading buffer,进 行 SDS-PAGE 电泳。 包涵体的分离: 1.离心细胞裂解液(12000g,15min,4℃) 。 2.弃上清, 每克菌加入 1ml H2O 使悬浮,分别取 100ul 分装 4 个管,其余备用。 3.离心同 1 步。 4.弃上清,用 100ul 1mol/L Tris-HCL(pH8.5),并含不同浓度尿素(0.5,1,2, 5mol/L)重新悬浮沉淀。 5.离心。 6.分别吸出并保留上清,用 100ul H2O 重新悬浮沉淀。 7.分别取 10ul 上清液和重新悬浮的沉淀,加 10ul 2×Loading buffer,进行 SDS-PAGE 电泳。 包涵体的溶解和复性

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1.用 100ul 裂解液缓冲液(含 0.1mmol/L PMSF,10mmol/L DTT)溶解包涵体。 2.室温放置 1 小时。 3.加 9 倍体积的 50mmol/L KH2PO4(pH10.7) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 50mmol/L NaCL 2mmol/L 还原型谷胱甘肽 1mmol/L 氧化型谷胱甘肽 室温放置 30min,用 KOH 保持 pH 到 10.7 4.用 HCL 调至 pH 8.0,至少在室温放置 30min。 5.离心 10000g,15min,室温。 6.吸出上清液并保留,用 100ul 2×Loading buffer,取 20ul 重新溶解的沉淀,进行 SDS-PAGE 电泳。

教师点评 该实验选择木糖酶作为目的基因进行试验设计,能够较好地利用木糖酶本身所 具有的特性,对木糖酶的表达进行鉴定。鉴定的方法多样,展示设计者对木糖酶进 行了较为深入的调研。但在整个实验设计上,也存在一些问题。如: 1. 应该说明微生物所属的种属类型和基因组大小, 进而指出在后续进行的对基因组 酶切获得目的基因的过程中,基因组大小以及基因组结构对酶切效率是否会有影 响,以及如何有效避免基因组碎片对后续基于核酸分子大小进行电泳分离目的基因 实验的影响。 2. PCR 扩增应该紧接着在完成基因组的提取后进行。 3. pUC19 往往不作为高效表达载体使用,并且是融合表达目的基因,所以对于木糖 酶基因的表达很可能影响它的功能。

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