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Biolog微生物自动分析系统


食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES

Biolog 微生物自动分析系统 —— — 细菌鉴定操作规程的研究
程        池 杨 梅 李金霞       姚 粟 胡海蓉
( 中国食品发酵工业研究院中国工业微生物菌种保藏管理中心 ,北京 ,100027)

摘    要 Bi

olog 微生物自动分析系统是美国 Biolog 公司研制开发的新型自动化快速微生物鉴定系统 ,以细菌对微平 板上 95 种碳源的利用情况为基础从而进行微生物鉴定 。目前我国已经累计引进 100 余台 ,但使用率较低 。文中在 总结实践经验的基础上 ,参阅最新 Biolog 系统操作手册 412 版和国家微生物资源平台技术规程的统一格式 ,研究制 定了细菌鉴定的操作规程 ,以规范系统使用 ,获得准确鉴定结果 ,尽快提高我国 Biolo g 系统的应用水平 。 关键词   Biolog 微生物自动分析系统 ,细菌鉴定 ,操作规程

   随着仪器分析技术的进步和计算机的广泛应用 , 微生物菌种鉴定逐渐由传统的形态学观察和人工生 理生化实验鉴定发展进入了基于仪器自动化分析的 鉴定系统阶段 。近 20 年来 , 一系列商品化自动鉴定 系统相继推出并在应用中取得理想效果 , 如 V ITE K 系统 、 ID I 系 统 、 M Biolog 系 统 、 SENSITITRE 系 统 、 AU TOSCEP TOR 系统以及 M ICROSCAN 系统等[ 1 ] , 其中细胞脂肪酸分析的 M ID I 系统 、 碳源利用分析的 Biolog 系统与 DNA 序列分析的 16s rRNA 基因进化 发育系统已经成为目前国际上细菌多相分类鉴定常 用的技术手段 [ 2~4 ] 。 Biolog 微生物自动分析系统是美国 Biolog 公司 从 1989 年开始推出的一套微生物鉴定系统 , 最早进 入商品化应用的是革兰氏阴性好氧细菌鉴定数据库 ( GN ) ,其后陆续推出革兰氏阳性好氧细菌 ( GP) 、 酵 母菌 ( YT) 、 厌氧细菌 ( AN ) 和丝状真菌 ( FF) 鉴定数据 库。 Biolog 系统 6101 版数据库共包括 1 973 种微生 物 ,其中细菌 234 个属 ,1 226 个种 , 与其他鉴定系统 相比 ,其微生物种类的数据量较大 , 适合于环境 、 食 品、 、 工业 临床和动植物病原菌的鉴定分析 。该系统 于 1991 年获美国工业先进技术 R &D 奖 ,1994 年美 国已有 200 余台投入应用 [ 5 ] ,1992 年中科院微生物 研究所引进了国内第 1 台 Biolog 系统 [ 6 ] ,目前我国已 经累计引进 100 余台 ,使用单位包括专业菌种保藏中 心、 大专院校和科研院所 。近年来 , 一些大型制药或 食品企业也相继引进该系统用于生产过程的微生物 控制和产品微生物分析 ,如中美史克 、 华北制药 、 惠氏 公司 、 燕京啤酒 、 青岛啤酒 、 张裕集团 、 五粮液集团 、 茅 台集团 、 康师傅集团等 。
第一作者 : 学士 ,教授级高级工程师 。 收稿日期 :2006 - 04 - 12

与拥有的系统数量相比 ,我国 Biolog 系统的应用 范围和程度远远不够 , 应用研究成果也较少[ 5~9 ] , 许 多单位的设备长期闲置 ,造成资源的严重浪费 。分析 其原因可以发现 ,Biolog 系统虽然具有操作简便 , 自 动化程度高 ,鉴定快速 , 采用标准化程序和耗材等优 点 ,但是 ,如果不配备具有一定专业背景的操作人员 和科学适用的操作技术规程 ,准确使用该系统并得到 正确的鉴定结果仍然具有一定难度 。 中国工业微生物菌种保藏管理中心 ( CICC) 承担 了国家科技基础条件平台项目 《工业微生物菌种资源 标准化整理整合及共享试点》 负责对我国工业微生 , 物资源进行标准化整理整合 。CICC 于 2005 年 4 月 引进 Biolog 系统 ( Microstation 412 ) 以及全部 5 种鉴

定数据库软件 ,在采用该系统进行大量微生物菌种复 核和鉴定实验的基础上 , 根据 Biolog 系统操作手册 式 [ 11 ] ,研究制定了 Biolog 微生物自动分析系统 —— 《 — 细菌鉴定操作规程》 希望能够通过 Biolog 系统使用 , 单位的试用和完善 , 形成标准化的技术操作规程 , 规
412 版 [ 10 ] 和国家微生物资源平台技术规程的统一格

范该系统在细菌鉴定中的操作应用 , 尽快提高我国 Biolog 系统的应用水平 。 细菌鉴定操作规程的内容包括范围 、 术语和定 义、 、 原理 操作步骤以及附录 。

1    范 围

本规程规定了 Biolog 微生物自动分析系统细菌

鉴定的操作程序和方法 。适用于 Biolog 微生物自动 分析系统对革兰氏阴性细菌 、 革兰氏阳性细菌和厌氧 细菌的鉴定 。

2  术语和定义

下列术语和定义适用于本规程 :

  50

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生产与科研经验

由美国 Biolog 公司生产的用于微生物菌种鉴定 的自动分析系统 ,可鉴定包括需氧细菌 、 厌氧细菌 、 酵 母菌和丝状真菌在内的 2 000 余种微生物 , 几乎涵盖 了微生物学不同领域中比较重要的菌种 ,所涉及领域 包括制药 、 生物技术 、 化妆品 、 兽医和临床医学 、 农业 和环境科学 、 食品加工和安全 , 也可应用于微生物代 谢、 特性和群落等的分析研究 。 Biolog 微生物自动分析系统包括 : 读数仪 、 数据 库软件 、 浊度仪 、 菌落放大灯 、 八头电动加液器以及计 算机等配件 。 212   纯培养 仅包含 1 种微生物菌种的培养物 。 213   通用培养基
215   微平板反应

适用于绝大多数细菌生长的培养基 ,包括好氧菌 培养基 Biolog Universal Growt h (BU G) 、 厌氧菌培养 基 Biolog Universal Anaersal (BUA ) ,一般会在培养基 中添加 0125 %的麦芽糖 ( M) 或 5 %的羊血 (B) 。 214   微平板 Biolog 系 统 所 采 用 的 鉴 定 平 板 。微 平 板 有 96 孔 ,横排编号为 1~12 ,纵排编号为 A~ H 。96 孔中均 含有四唑类氧化还原染色剂和胶质 , 其中 A1 孔为空 白对照 ,其他 95 孔为 95 种不同的碳源物质 。 用于细菌鉴定的有革兰氏阴性菌鉴定微平板 ( GN 板) 、 革兰氏阳性菌鉴定微平板 ( GP 板 ) 和厌氧 菌鉴定微平板 ( AN 板) 。 细菌利用微平板中的碳源 ,发生氧化2还原反应 , 使四唑类氧化还原染色剂发生颜色变化 。鉴定细菌 时全部基于显色反应 , 结果分为阴性值 、 阳性值和边 缘值 。 216   革兰氏阴性肠道菌 革兰氏染色呈阴性 , 氧化酶实验呈阴性 , 三糖铁 斜面呈 ( A/ A) ( 酸性/ 酸性 ) 或 K/ A ( 碱性/ 酸性 ) 的细 菌称为革兰氏阴性肠道菌 。 217   革兰氏阴性非肠道菌 革兰氏染色呈阴性 , 氧化酶实验呈阳性 , 或氧化 酶实验呈阴性 , 但三糖铁斜面呈 ( K/ K) ( 碱性/ 碱性 ) 或 K/ Aw ( 碱性/ 弱酸性) 的细菌称为革兰氏阴性非肠 道菌 。 218   革兰氏阴性苛求菌 最初是从哺乳动物的呼吸道中分离出来的 ,难于 培养或生长条件要求苛刻的细菌 ,这类菌在 BU G + B

211  Biolog 微生物自动分析系统

醇、 、 、 酸 酯 胺和大分子聚合物等 95 种碳源的利用情 况进行鉴定 。细菌利用碳源进行呼吸时 ,会将四唑类 氧化还原染色剂 ( TV ) 从无色还原成紫色 , 从而在鉴 定微平板上形成该菌株特征性的反应模式或 “指纹图 谱”通过纤维光学读取设备 —— , — 读数仪来读取颜色 变化 ,由计算机通过概率最大模拟法将该反应模式或 “指纹图谱” 与数据库相比较 ,将目标菌株与数据库相 关菌株的特征数据进行比对 , 获得最大限度的匹配 , 可以在瞬间得到鉴定结果 ,确定所分析的菌株的属名 或种名 。

BUA + B 培养基 , 农业相关细菌可直接使用 BU G 培

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培养基上难于生长 ,但可在 35 ~ 37 ℃,615 % CO2 , 巧 克力琼脂培养基上生长 。 219     浊 度 透光率的值 ,用以表示接种细胞的浓度 。 2110   浊度标准品

对应不同浊度的标准品 。针对细菌的不同种类 , 浊 度 标 准 品 分 为 52 % T/ GN2N EN T 、 % T/ GN2 61 EN T 、 % T/ GP2COC & GP2ROD & GN2FAS 、 % 20 28 T/ GP2ROD SB 和 65 %T/ AN 。 2111   接种液 制备菌悬液使用的稀释液 。分为革兰氏阴性/ 阳 性接种液 ( GN/ GP2IF) 和厌氧菌接种液 ( AN2IF) 。配 制方法见附录 Ⅰ。 2112   阅读器模式

用于鉴定的细菌必须为纯培养物 ,可将菌种分离 纯化获得单菌落 ,通过菌落放大灯观察菌落形态判断 是否为纯培养物 。 41111   培养基 好氧细菌使用 BU G + B 培养基 , 厌氧细菌使用
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养基 。培养基制备见附录 Ⅱ 1 、 22 和 Ⅱ 3 。 2 Ⅱ 2 41112   培养温度 细菌的最适生长温度。大多数细菌在 35~37 ℃ 或 30 ℃ 下培养 ,某些革兰氏阳性厌氧菌在 26 ℃ 下培养。   51
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通过读数仪记录微平板反应结果的软件模式 。 2113   手动模式 通过人工观察记录微平板反应结果的软件模式 。

3    原 理

Biolog 自动微生物分析系统主要根据细菌对糖 、

4  操作步骤

411   细菌的纯培养

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培养时间不宜过长 ,大多数细菌最长培养时间为 24 h ,某些生长缓慢的细菌或苛求菌需要培养 48 h 。 412   革兰氏染色 对好氧细菌必须进行革兰氏染色反应 ,根据革兰 氏染色结果选择适当的培养基和微平板类型 。 413   富集培养 41311   培养基 革兰氏阴性非肠道菌 、 肠道菌和革兰氏阳性球 菌 、 ( 除芽孢杆菌) 使用 BU G + B 的培养基 ; 革兰 杆菌 氏阴性苛求菌使用巧克力培养基 ; 革兰氏阳性芽孢杆 菌使用 BU G + M + T 培养基 ; 厌氧菌使用 BUA + B 培养基 。 BU G + M + T 培养基的制备方法见附录 Ⅱ 4 。 2
41312   培养时间

应使用 Biolog 推荐的培养基和培养条件 ,培养时 间不宜过长 。大部分细菌培养时间为 16~24 h ,某些 生长缓慢的细菌培养时间为 48 h ,生长缓慢的厌氧菌 需要更长的时间 。 41313   革兰氏阳性芽孢杆菌的特殊培养 革兰氏阳性芽孢杆菌的培养要避免产生过多的 芽孢 ,影响鉴定结果 。采用 + ” “ 字交叉法画线 , 在平 板上形成 + ” “ 字形 ,挑取 + ” “ 字外部活力较高的菌体 进行后续实验 。有时为了获取更多量的菌体 ,亦可采 附着在内壁上 ,同时将菌体均匀打散 。   ( 4) 倾斜接种液管 , 用棉签将菌体分散于接种液 中 。如果有小的菌团 ,应使之沉到管底 。   ( 5) 调整浊度   52
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用 “米” 字形画线 。 414   菌悬液制备 不同类型的细菌必需按照相应的浊度标准品制 备适宜浓度的菌悬液 。 GN2N EN T 采用 52 %T/ GN2N EN T 的浊度标准 , GN2EN T 采 用 61 % T/ GN2EN T 的 浊 度 标 准 , GN2 FAS 和革兰氏阳性菌 ( 除芽孢杆菌 ) 采用 20 % T/ GP2 COC &GP2ROD &GN2FAS 、 孢 杆 菌 采 用 28 % T/ 芽 GP2ROD SB 的浊度标准 、 厌氧菌采用 65 % T/ AN 的 浊度标准 。 41411   操作步骤   ( 1) 取无菌棉签在接种液中蘸湿 。   ( 2) 将棉签在菌落表面滚动 ,粘取菌体 ,注意不要 带出培养基 。   ( 3) 在接种液管液面上沿内壁转动棉签 , 使菌体

41113   培养时间

( a) 关闭电源 ,调整指针至 0” “ 刻度 ; ( b) 用吸水纸擦干净空白接种液管外壁 , 置于浊

度计中 ,接通电源 ,调整指针至 100 % T ; (c) 使用浊度标准品检查浊度仪的准确性 , 并调 整至标准浊度值 ; ( d) 擦干菌悬液管外壁 ,插入浊度计 , 读取菌悬液 浊度值 ; (e) 通过添加菌体或空白接种液调整浊度值 , 使 其在相应标准浊度值的 ± %范围内 。 3 41412   注意事项 ( 1) 为防止菌体结团 ,确保菌悬液均一稳定 ,鉴定 革兰氏阴性肠道菌 、 革兰氏阴性苛求菌 、 革兰氏阳性 球菌和杆菌时 , 每管接种液中需添加 3 滴 ( 011 mL ) 7166 %的巯基乙酸钠溶液 。 ( 2) 鉴定革兰氏阴性非肠道菌时 ,如果 A1 孔呈阳 液 ,将试管于 37 ℃ 培养箱中放置 30 min , 使其变暖 , 菌团沉淀下来 ,然后将上清部分转移至 GN/ GP2IF 接 种液管中 ,混合均匀 ,调整至标准浊度值 。 415   微平板的接种与培养 41511   微平板的接种
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性 ,需在每管接种液中加 3 滴 7166 %的疏基乙酸钠溶 液。 ( 3) 鉴定革兰氏阳性菌球菌和杆菌时 ,如果 A1 孔 呈阳性 ,接种液中除加疏基乙酸钠溶液外 , 还需加入 100 mmol/ L 的水杨酸钠溶液 1 mL 。 ( 4) 厌氧菌要分批制备菌悬液 ,1 次不超过 6 个 。 制备第 1 个菌悬液到完成最后 1 个的时间间隔不宜 超过 5 min 。 41413   革兰氏阳性芽孢杆菌菌悬液的特殊制备 干燥 、 黏液状的菌体一旦打湿就很难被打散 , 所 以制备革兰氏阳性芽孢杆菌菌悬液时采用干管分散 方法 : ( 1) 用接种棒挑取菌体 , 并沿无菌干试管内壁旋 转几圈 ,将菌体转至试管内壁 , 然后用接种棒上下划 动 ,并转动试管 ,将菌体均匀分散 ; ( 2 ) 取 1 支无菌吸管 , 移取 3 ~ 5 mL GN/ GP2IF 接种液 ,加至试管中 ; ( 3) 用 1 支无菌棉签将试管内壁的菌体洗下 , 均 匀分散于 GN/ GP2IF 接种液中 ; ( 4) 将制备的菌悬液转移至 GN/ GP2IF 接种液管 中 ,混合均匀 ,调整至标准浊度值 。 ( 5) 对于黏度高的细菌 , 可用装有 5 mL GN/ GP2
IF 培养液的试管重复以上操作 , 制备高浊度细胞悬

生产与科研经验

将制备好的菌悬液倒入加样槽中 ,使用八道电动 移液器 ,将其接种于微平板的 96 孔中 。 革兰氏阴性菌使用 GN 鉴定微平板 , 接种量为 μ 150 L/ 孔 ; 革兰氏阳性菌使用 GP 鉴定微平板 , 接种 μ 量为 150 L/ 孔 ; 厌氧菌使用 AN 鉴定微平板 ,接种量 μ 为 100 L/ 孔 。 41512   微平板的培养 革兰氏阴性非肠道菌在 30 ℃, 空气中培养 ; 革兰 氏阴性肠道菌在 35 ~ 37 ℃,空气中培养 ; 革兰氏阴性 苛求菌在 35~37 ℃,615 %CO2 条件下培养 ; 革兰氏阳 性球 菌 和 杆 菌 在 35 ~ 37 ℃、 ℃或 26 ℃, 空 气 或 30 615 %CO2 条件下培养 ; 革兰氏阳性芽孢杆菌在 30 ℃ 或 55 ℃,空气中培养 ; 厌氧菌在 35 ℃、 ℃ 26 ℃,无 30 或 氢气的厌氧条件下培养 。 如果革兰氏阴性厌氧杆菌呈卡那霉素抗性 ,且过 夜培养后菌体量能达到制备菌悬液的要求 ,应在接种 微平板之前打开微平板包装 ,置于空气中 20 min 。其 他情况下 ,不宜过早取出厌氧菌微平板 。 每块 AN 微平板的操作时间不要超过 5 min , 接 完种的微平板 10 min 后再放入厌氧罐 。厌氧罐中不 能含有 H2 ,因为含强氢化酶的细菌在 H2 存在时会还 原四唑类显色物质 ,影响鉴定结果的准确性 。 416   微平板读数 41611   微平板读数时间
AN 微平板培养 20~24 h 后读取结果 ,其他类微

put date file name”找到需要读取的文件 ; , ( 4) 打印出结果 。 417   结果分析

Biolog 软件将读取的 96 孔微平板反应结果按照

与数据库的匹配程度列出 10 个结果 , 如果鉴定结果 与数据库匹配良好 ,将显示鉴定的结果在绿色状态栏 上 ; 如果鉴定结果不可靠 , 结果栏为黄色 , 显示 ” NO ID”但仍列出最可能的 10 个结果 。 , 每个 结 果 均 显 示 3 种 重 要 的 参 数 , 即 可 能 性 Probability ( PROB) , 相似性 Similarity ( SIM ) 和位距 Distance ( D IS) 。D IS 和 SIM 是最重要的 2 个值 ,D IS

值表示测试结果与数据库相应数据条的位距 , SIM 值表示测试结果与数据库相应数据条的相似程度 。
Biolog 系统规定 : 细菌培养 4~6 h ,其 SIM 值 ≥ 175 , 0

平板 4~6 h 、 ~24 h 各读数 1 次 。 16 41612   读取微平板 ( 1) 打开 MicroLog” 应用程序 ; “ (2) 点击 SET U P” 启动阅读程序 , 选择阅读器 “ , 模式 ( Reader Mode) ,点击 initialize reader”进行初始 “ , 在“St rain type” 下拉菜单中选择细菌类型 ; ( 4) 取下微平板盖 ,放入读数仪托架上 , 合上读数 仪盖子 ,准备读数 ; ( 5) 按“Read Next ”键开始读数 。
41613   保存及读取鉴定结果 (1 ) 在“ SET U P ” 面 点 击“output date file 界 name”输入保存文件名和地址 ; , ( 2) 返回 DA TE” “ 界面点击 SAV E”结果保存于 “ ,

化设置 , 等 到 界 面 上 红 色 的 NO ” 变 成 绿 色 的” “ 键 YES”时 ,进入 DA TE” “ 界面 ; 如采用人工读数 , 进入 手动模式 ( Manual Mode) ; ( 3) 选择培养时间和微平板类型 , 输入样品编号 ,

指定路径中 ;

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培养 16~24 h 时 ,SIM 值 ≥ 150 ,系统自动给出的鉴 0 定结果为种名 ,SIM 值越接近 1100 ,鉴定结果的可靠 性越高 ; 当 SIM 值小于 015 , 但鉴定结果中属名相同 的结果的 SIM 值之和大于 015 时 , 自动给出的鉴定 结果为属名 。

附录

Ⅰ接种液的配制 Ⅰ 1 GN/ GP2IF ( 革兰氏阴性/ 阳性菌接种液) 2 配方 : 0140 % NaCl ,0103 %聚醚 F268 ,0102 %结冷胶 。 制备过程 : 1. 加 012 g 结冷胶至 1 L 水中 ; 2. 煮沸并持续搅拌 ,直至吉冷胶完全溶解 ; 3. 停止加热 ,继续搅拌 ; 4. 加 4 g NaCl ,搅拌至完全溶解 ; 5. 加 013 g 聚醚 F268 ,搅拌至完全溶解 ; 6. 分装到 20 × 150 mm 的试管中 , 每管装 19 mL 左右 ; 7. 在 121 ℃ 下灭菌 30 min ,备用 。 Ⅱ 培养基的制备方法 Ⅱ 1   G + B 培养基的制备 : 2 BU 1. 按制备 1000 mL 培养基计 ,称取 57 g BU G 培
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养基 ,950 mL 纯净水 、 蒸馏水或去离子水置于容器 中; 2. 煮沸溶解 ; 3. 冷却至 25 ℃ 调整 p H 值至 713 ± 011 ; 4. 121 ℃ 灭菌 15 min ;   53
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( 3) 在 SET U P” “ 界面上选择 File ” “ 模式点击 in2 “

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5. 冷却至 45~50 ℃; 6. 加 50 mL 新鲜的脱纤羊血 ,摇匀 ; 7. 倒平板 。

7. 倒平板 。

ABSTRACT   Biolog Microbial Identification System , which is developed by Biolog Inc1 , is a new automated tech2 nology for rapid identification of microorganisms1 The system is based around t he assimilation of 95 carbon sources by bacteria on a microtiter t ray1 Up to 100 set s of Biolog system were int roduced into China , but most of t hem are not extensively used1 Based on t he practice experience as well as referred to Biolog User Guide 412 and Rules of Na2 tional Inf rast ruct ure of Cult ure Resources , t he operating regulation of bacteria identification was established , which is for operating t he Biolog system correctly to obtain accurate result s and to improve t he application level1 Key words   Biolog Microbial Identification System , bacteria identification , operating regulation

养基 ,950 mL 纯净水、 蒸馏水或去离子水置于容器中 ; 2. 用无氧的 N 2 吹洗下 ,轻微煮沸 ,搅拌以溶解琼 脂和其他组分 ; ) 3. 冷却后调整 p H 值至 712 ± 11 ( 25 ℃ ; 0 4. 121 ℃ 灭菌 15 min 。注意盖紧瓶盖 , 防止氧气 进入 ; 5. 在无氧的 N 2 保护下 ,冷却至 45~50 ℃; 6. 加 50 mL 新鲜的脱纤羊血 ,摇匀 ; 7. 在厌氧环境中倒平板 。 Ⅱ 3   G 培养基的制备 2 BU
4. 121 ℃ 灭菌 15 min ; 5. 冷却至 45~50 ℃; 6. 倒平板 。

1. 按制备 1 000 mL 培养基计 ,称取 57 g BU G 培 养基 ,1 000 mL 纯净水、 蒸馏水或去离子水置于容器 中; 2. 煮沸溶解 ; ) 3. 冷却后调整 p H 值至 713 ± 11 ( 25 ℃ ; 0

基 ,990 mL 纯净水、 蒸馏水或去离子水置于容器中 ; 2. 煮沸溶解 ; 3. 冷却至 25 ℃ 调整 p H 值至 713 ± 011 ; 4. 121 ℃ 灭菌 15 min ; 5. 冷却至 45~50 ℃; 6. 加 10 mL 已灭菌的麦芽糖 ( 浓度 25 %) ,混匀 ;   54
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Ⅱ2   2 BUA + B 培养基的制备 1. 按制备 1 000 mL 培养基计 ,称取 5117 g BUA 培 Ⅱ 4   G + M + T 培养基的制备 2 BU 1. 按制备 1000 mL 培养基计 ,称取 57 g BU G 培养

Biolog Microbial Identif ication System —— — Study on the Operating Regulation of Bacteria Identif ication Cheng Chi  Yang Mei   Jinxia  Yao Su  Hu Hairong Li

( China Center of Industrial Culture Collection ,China National Research Institute of Food & Fermentation Industries ,Beijing 100027 ,China)

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巯基乙酸钠 ( T) 应该在富集培养前加入到培养基 上 ,不宜过早加入 ,具体方法如下 : 取 8 滴巯基乙酸钠 ( 0124 mL ) 加入到 3 mL 无菌 水中 ,将棉签浸入到溶液中蘸湿 ,取出棉签 ,在平板直 径方向划 1 条线 , 在与线条垂直方向来回划线 , 均匀 涂布 ,将平板转动 90° , 均匀涂布 , 直到疏基乙酸钠 后 溶液均匀涂布于平板上 ,放置一段时间后等到液体被 培养基吸收后表面变干即可使用 。
参 考 文 献 http://www.cnki.net

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