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免疫荧光方法


免疫荧光(Immunofluorescence, IF)实验方法 免疫荧光技术是在免疫学、 生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。 它是 根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团,再用这种荧光抗体(或 抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体) 。利用荧光显微镜可以看见荧光所 在的细胞或组织, 从而确定抗原或抗体的性质和定位, 以及利用定量技术

(比如流式细胞仪) 测定含量。 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵 育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步,细胞片 的质量对实验的成败至关重要,原因很简单,如果发生细胞掉片,一切都无从谈起。这一步 关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力,有人根据成功经验总结出 许多有益的细节或小窍门, 非常值得借鉴。 固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性 质选择适当的固定方法, 合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。 免 疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如 ELISA 或 Western Blot)中的相同步骤是类似 的,最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体,因此必须谨记避光操作,此外抗体 浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是,标记好荧光的细胞片应尽早观察,或者用封 片剂封片后在 4℃或-20℃避光保存,以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多,同时在分析结果时无法像 WB 那样可以根据分子量的大小区分非 特异性识别,所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果,除了需要高质量的抗体,以及对实 验条件进行反复优化外, 还必须设立严谨的实验对照。 总之, 免疫荧光实验从细胞样品处理、 固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照,每步都非常关键,需要严格控制实验流程 中每个步骤的质量,才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞,在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过的 盖玻片的培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片,PBS 洗两次;对悬浮生长细胞,取 对数生长细胞,用 PBS 离心洗涤(1000rpm,5min)2 次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直 接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳 的 PBS 中 4℃保存 3 个月。PBS 洗涤 3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞,一般需要在加入抗体孵育前, 对细胞进行通透处理, 以保证抗体能够到达抗原部位。 选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性 质。通透的时间一般在 5-15min.通透后用 PBS 洗涤 3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭,时间一般为 30min. (5) 一抗结合。室温孵育 1h 或者 4℃过夜。PBST 漂洗 3 次,每次冲洗 5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育 1h.PBST 漂洗 3 次,每次 冲洗 5min 后,再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴,封片,荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞, 也可以是经过离心后 涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。 贴壁良好的细胞一般在培养 时直接放入 coverslips 让细胞生长在其上即可,尽量避免使用贴壁性能不好的细胞进行免 疫荧光实验, 以免后续的漂洗操作引起细胞脱落。 少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞 进行免疫荧光观察,建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (二)固定和通透 除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外,一般均应固定。固定的目的有三:

①防止细胞从玻片上脱落; ②除去防碍抗原-抗体结合的类脂; ③使标本易于保存。 标本的固定原则是: ①不能损伤细胞内的抗原; ②不能凝集蛋白质; ③应保持细胞和亚细胞结构; ④固定后应保持通透性,以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。 常用的固定剂有多种,应根据所研究抗原的性质和所使用的抗体特性选择适当的固定 剂。通常固定方法可以分为两类:有机溶剂和交联剂。有机溶剂如甲醇和丙酮等可去除类脂 并使细胞脱水, 同时将细胞结构蛋白沉淀。 交联剂如多聚甲醛通常通过自由氨基酸基团形成 分子间桥连, 从而产生一种抗原相互连接的网络结构。 交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的 结构,但因为交联阻碍抗体结合,可能会降低一些细胞组分的抗原性,因此需要增加一个通 透步骤以使抗体能够进入标本。 两种固定方法都可能使蛋白抗原变性, 因此使用变性蛋白作 为抗原生产的抗体在免疫荧光中可能更为有效。 最常用的固定剂有多聚甲醛和甲醇,少数情况也使用乙醇,丙酮及戊二醛等进行固定。 通常,细胞结构抗原、病毒及一些酶类抗原使用丙酮、乙醇及高浓度的甲醛固定可获得较好 的结果, 而细胞膜相关组分抗原一般以多聚甲醛固定。 细胞器和细胞颗粒内的抗原一般也用 多聚甲醛固定,并需要进行通透以使抗体能达到抗原表位。 通透步骤只在检测细胞内抗原表位的时候才需要, 因为抗体需要进入细胞内部去检测蛋 白。但是,如果待检测的是跨膜蛋白,且其抗原表位处于胞质内区域,则同样需要对细胞进 行通透。相反,如果所检测的抗原表位位于膜蛋白的胞外段,则不需要进行通透。丙酮本身 具有通透作用,因此用丙酮作为固定剂时是不需要通透的。甲醇同样具有通透作用,但有些 场合并不适合用甲醇,因为一些表位对甲醇非常敏感。常用的通透剂是去垢剂,如 Triton ,NP-40,以及 Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm 等。Triton 和 NP-40 属于烈性去垢剂,可部分溶解细胞核膜,因此非常适合核抗原检测。但应该注意的是,如果 在高浓度下使用或者作用时间过长,它们将破坏蛋白,从而影响实验结果。Triton X-100 是最常用的通透剂,但是它将破坏细胞膜,因此不适用于细胞膜相关抗原。后面一组去垢剂 要温和得多, 它们可以在细胞质膜上形成足够大的孔隙以允许抗体通过, 但是不会溶解细胞 质膜。适于胞质抗原或者质膜上靠近胞质一面的抗原,也适于可溶性的核抗原。 一般的操作程序是先固定后通透, 但针对有些水不溶性的目的抗原的检测宜先通透再固 定, 这样做的原因主要是可以通过通透去除许多水溶性的蛋白, 从而大大减少了免疫荧光的 背景和非特异性信号。固定后以冷 PBS 液漂洗,最后以蒸馏水冲洗,防止自发性荧光。 (三)封闭 封闭的目的是为了减少抗体的非特异性结合,最常用的封闭剂为 1% BSA, PBS pH 7.5, 其他可选择的封闭剂还有 1% gelatin, 1%bovine 或与二抗种属相同的血清(3-10%)等。 (四)抗体孵育 直接免疫荧光法中的一抗和间接免疫荧光法中的二抗都是荧光抗体, 因此在这些抗体孵 育的时候必须注意避光。 此外, 为保证结合质量和防止干燥, 抗体孵育应尽量在湿盒中进行。 (五)封片及荧光观察 标记好荧光的细胞片原则上可以直接进行观察, 特别是有时候封片不当反而使得前功尽 弃。但在绝大多数情况下,为了保存结果,以便进一步观察、照像、统计分析等,需作封片 处理。常规的方法是采用甘油或中性树脂封片,为了增强封片的效果,往往需要在封片时添 加特殊的抗荧光淬灭剂。

(六)标本保存 由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的, 因此随着保存时间的延长, 在各种条 件影响下,标记蛋白可能变性解离,失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一 定的困难, 所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。 由于性能良好的抗荧光淬灭剂的出现, 荧光标记的标本可以在低温(4℃或-20℃)下保存相当长的时间。在某些情形下,考虑到实 验的成本及实验条件,也可以采取权宜的办法,比如固定标本片后低温保存,在需要时再进 行荧光标记,即随用随染。

直接免疫荧光法测抗原 基本原理 将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高, 非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。 此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。 试剂与仪器 磷酸盐缓冲盐水(PBS):0.01mol/L,pH7.4 荧光标记的抗体溶液:以 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 进行稀释 缓冲甘油:分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制 搪瓷桶三只(内有 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 1500ml) 有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫) 荧光显微镜 玻片架 滤纸 H 37℃温箱等。 实验步骤 1、滴加 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 于待检标本片上,10min 后弃去,使标本保持一定湿 度。 2、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液,使其完全覆盖标本,置于有盖搪瓷盒内,保 温一定时间(参考:30min)。 3、 取出玻片, 置玻片架上, 先用 0.01mol/L, pH7.4 的 PBS 冲洗后, 再按顺序过 0.01mol/L, pH7.4 的 PBS 三缸浸泡,每缸 3-5 min,不时振荡。 4、取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆 盖。 5、立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度,一般可用“+”表示: (-)无荧光;(±)极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱,但清楚可见;(++)荧光明亮; (+++ --++++)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上,而各种对照显示为 (±)或(-),即可判定为阳性。 注意事项 1、对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有一定的浓度,一般稀释度不应超过 1:20,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观察。 2、染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化,染色时间可以从 10 min 到数小时,一般 30 min 已足够。染色温度多采用室温(25℃左右),高于 37℃可加强染色 效果,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用 0-2℃的低温,延长染色时间。 低温染色过夜较 37℃30 min 效果好的多。

3、为了保证荧光染色的正确性,首次试验时需设置下述对照,以排除某些非特异性荧 光染色的干扰。 (1) 标本自发荧光对照:标本加 1-2 滴 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS。 (2) 特异性对照(抑制试验):标本加未标记的特异性抗体,再加荧光标记的特异性 抗体。 (3) 阳性对照:已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧 光,则为特异性阳性染色。 4、一般标本在高压汞灯下照射超过 3min,就有荧光减弱现象,经荧光染色的标本最好 在当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。

免疫荧光染色(间接法) 1、切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上,置于染色盒中保持 一定的湿度,37℃作用 30min。然后用 0.01mol/l pH7.2PBS 洗两次,10min,用吸水吸去或 吹干余留的液体。 2、再滴加间接荧光抗体(如兔抗人 -球蛋白荧光抗体等),同上步骤,染色 30min, 37℃,缓冲盐水洗两次 10min,搅拌,缓冲甘油封固,镜检。 对照染色:①抗体对照:用正常兔血清或人血清代替免疫血清,再用上法进行染色,结 果应为阴性。②抗原对照:即类属抗原染色,亦应为阴性。③阳性对照。 间接法中上述方法称双层法(Double Layer Method)。另一种称夹心法,即用未标记 的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合,再用该抗原之荧光抗体重叠结合其 上,而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在,方法步骤如下: ①切片或涂片固定后,置于染色湿盒内。 ②滴加未标记的特异性抗原作用切片于 37℃,30min。 ③缓冲盐水洗 2 次,每次 5min,吹干。 ④滴加特异性荧光抗体再用切片于 37℃,30min。 ⑤如③水洗。 ⑥缓冲甘油封固,镜检。

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细胞内抗原的检测细胞内抗原的检测-间接免疫荧光法

细胞内抗原的检测过程与细胞表面抗原检测过程基本一致,只是在与一抗孵育前, 需要预先对细胞用非离子去污剂进行透化处理。 【操作方法】 (1)取已固定好的细胞爬片或甩片或经过预处理的组织切片(石蜡或冰冻切片); (2)用含 0.2%TritonX-100 或 NP-40 的 PBS 溶液透化固定后的细胞 2min(室温),有 些标本可能需要长达 15min,时间视抗原而定; (3)余下步骤接上述“细胞表面抗原的检测-间接免疫荧光法”步骤(2); 【注意事项】 (1)在使用前,一抗二抗均应测试其合适的稀释度。

(2)多聚甲醛的固定是不稳定的,标本经多聚甲醛固定后,应再用去污剂处理,如果 标本在水溶液中浸泡的时间过长,则会使交联结构解体。因此,应避免固定后的标本在水溶 液中浸泡的时间过长。 (3)信号微弱的解决方法: ①提高一抗和二抗的浓度以增强敏感性 ,这必须测试各种浓度抗体的滴度; ②延长一抗和二抗的孵育时间。 由于细胞染色时抗原吸附在固相载体上, 抗原抗体结合 时间较在溶液中长。 孵育时间可因实验设计作适当调整, 但少于 20min 抗体和抗原几乎不能 有效结合。在以上两点中,应摸索出一个最佳条件以产生有效信号且保持良好的背景。这就 需要反复试验,因为每组抗体和抗原的情况会有所不同; ③改变检测方法,用共聚焦显微镜观察,可提高敏感性。 (4)背景不好的解决方法 细胞样本进行荧光染色时, 背景问题主要来自两个方面, 即非特异性染色和特异性 交叉反应。 ①非特异性吸附: 非特异性吸附背景问题的产生与抗原抗体的特异性结合无关。 即 一抗或二抗与样品相互作用而发生吸附,而不是与抗原发生特异性结合。 *将所有抗体溶液或含蛋白的检测试剂用 100, 000?g 离心 30min 以去除蛋白聚合物。 *滴定一抗和所用的检测试剂,以确定能够产生合适信号的最低浓度。 *固定后,用饱和量并不被检测试剂结合的非特异性抗体封闭样品,有效的封闭液 包括 5%的与标记二抗来源相同的同种血清、3%的 BSA 和 3%的脱脂奶粉。 *用上述封闭液稀释抗体和检测试剂。 *固定后,在所有的缓冲液及洗涤液中加入 2%吐温-20。 *缩短一抗或标记试剂的孵育时间。 *充分洗涤(延长洗涤时间,重复次数)。 *改变检测方法。 ②特异性背景:造成特异性背景问题的原因有三种因素,即污染抗体所致假阳性、 交叉反应和样品中含有能与 Ig 结合的蛋白质。 *如用多克隆抗体,应滴定抗体(假阳性)。 *如用多克隆抗体,亲和纯化特异性抗体(假阳性)。 *如用多克隆抗体,用适当的丙酮肝脏粉吸收以阻抑假阳性。 *换用其他抗体(交叉反应及假阳性)。

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