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orfX基因整合表达在阿维链霉菌工业育种中的应用


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农业生物技 术学报

Ju l f r utrl it h oo y 0 71 () 14 — 0 2 o ma o Agi l a Boe n l  2 0 ,5 6: 0 8 15     c u   c g
?

研究论文 ?  

>o/ 基 因整合表达在阿维链霉 菌工业育种 中的应用  r( T
范 与庆 闵 勇  熊 伟 陈 芬 梁运 祥  吕和平 , , , , , , , 昌, 邢仁 , 华 1  郑应 3 ,
( . 中农业大学农业微生物国家重点 实验室 , 1华 武汉 4 0 7 ;. 30 0 2 清华大学生物科学与技 术系 , 北京 10 8 ; 0 0 4  3北京 生物 医药研究所 , . 北京 10 9 ) 0 0 1 

摘要: 阿维链 霉菌( t p m cs vr t s基因组 中含有 oⅨ 基因 , Sr t y e  emil ) eo a i i r 通过增加 ot r X基因剂量可以提高阿维菌素 的产量 。   研究 以 p 6 0为出发 质粒 , U80 构建 了含红霉素抗性 基因启动子 (r p ) oⅨ 结构 基因 DN e mE * 和 r A片段的重组质粒 p I 8 7 B B 2 。通 

过接合 转移将 p I 2 导入 阿维菌素 的工业菌株 BB9 0 BB8 7 I 9 3中, 到稳定高产 的重组菌株 B B 8 7 得 I 0 2 。高效液相 ( P C) H L 分析结  果表明, 出发菌株 BB90 与 I 9 3相 比, I 0 2 B B 8 7发酵产物阿维菌素产量提高了 1 倍 , 到 3 5  g 。传代稳定性实验证 明, . 5 达   0i / 3  ̄ mL  
B B 8 7传代 l I0 2 0代后依然稳定 , 在工业生产上有较大的应用价 值。   关键词 :K 基因 ; O 接合转移 ; 整合表达 ; 阿维链霉菌 ; 阿维菌素  中图分类号 : 18 文献标识码 : 文章编号 :0610( 0)614—5 S8 A 10—342 70— 8   0 0 0

Ap ia in o   tg ai eEx r s in o  rX  n    h  n u tilBr e i go   pl to   fI e r tv   p e so   fo t Ge ei t eI d sra  e d n   f c n n

S rptmy e   v r i l   t o c sa em t i e is
F AN  Yu— i g , I Yo g , ONG  e  CHEN  n , ANG  n x a   LV  — i g , NG  q n   M N  n   XI W i , Fe   LI Yu — ing , He p n 3 XI

R nca ̄ Z E GYn —u  e— n . H N   i h a h g ,  
r.tt JS a eKe a o ao yo Ag iu t r l i r b o o y Hu z o gAg i u tr lU i es t, u a   3 0 0 Ch n ; . p rme t f yL b r t r f r l a M c o il g , a h n c u rc l a n v r i W h n4 0 7 , i a 2De a t n o   u y

B ooia SineadBoeh oo , s g u  nvr t B in 0 04 C ia ilgcl c c  e n it n lg T i h aU ie i , e g10 8 , hn ; c y n sy i f   3B in   s tto B o dc eB ln   0 9, hn) . e gI t e f ime in , e g1 0 1C ia  i f ni   u i i t 0

Ab t c:Th  e e  fa eme t   r d c d b   t ptmycsa emil  o l  e si ltd b  n raig ted sg   fO   sr t a elv lo  v r ci p o u e   y Sr o n e e v r ti c ud b  t is muae   y ice s  h   o a e o  K n
g n .Re o i a t p a mi   BI 2 wh c   o ti e  emE   a d sr cu a g n   f O / ee c mb n n   l s d p B8 7. ih c n n d r p a n   tu t r l e e o   K X,wa   e v d fo p J 6 0 s d r e   r m  l8 0 .T e i h 

rcmbnn t i  I 0 2  a b ie yit d c gp I 8 7it  eid s i t i B B 9 3tru hit gn r  ojg l eo ia t r nB B 8 7w so tn db  r ui  B B 2 not   uta s a   I 9 0 ho g   e eei c nu a sa a no n h n rl r n nr c  
t n fr r se .HP   s a s s o d t e lv l o   v r ci   r d c d b   B0 2   e c e     5   ̄ / a LC a s y   h we     e e  f a e me t p o u e   y BI 8 7 r a h d 3 3 0 igmL,15 f l  n r a i g wh n h n .- d ice s   e   o n c mp rd wi   B9 0 . e c a c e si  fh g — v lp o u i g s an BI 8 7 wa   t b e a tr tn r u d   f n n s lci e o ae   t BI 9 3 Th   h r t r t o   i h l e  r d cn   t i  B0 2   s s l  f  e   o n s o   o —e e t   h a i c e r a e v g o h wh c  a   ea p i d i  e id s i l r d c i no  v r c i . r wt , i h c n b   p l   t   u t a  o u t   f e me t   e nh n r p o a n

Km   ̄ O/ c nu at n f ; t rt e x rsi ; tp my e vr ti; vr c n w, K ojg l as ri e av  pes n Sr t cs e is aemet   X;   r e ng i e o eo a mil i

阿维 链 霉 菌 (tpo y e vr ti 产 生 的阿  Sr tm cs emil) e a is 维菌 素是 一组结 构 相似 的十 六元 大环 内酯 齐墩果 糖  双糖衍 生 物(uge .17 ) 阿维菌 素驱 虫活 性极  B r t1   9。 a ,9 强, 且抗 寄生虫 机 制独特 , 其它抗 寄生虫 药无 交叉  与 耐药性 ( 吕淑君 ,9 7, 19)在农 业 和畜 牧业 中得 到 广泛  的应用 。科学 家 已成功 克隆 了阿维菌 素生 物合 成基  后 又 对 阿 维 链 霉 菌 全 基 因 组 序 列 进 行 了 测 序  ( muaea. 0 1, 本 阐明 了 阿维 菌 素 的生 物 合  O r t12 0)基 ,

成途径 ( eae  .1 9 )  I d  t 1 9 7 。 k a, H n   a.2 0 ) 现含 有 ot 基 因 的 DN   wage 1 0 3 发 t ( r X A

片段 转 化变 铅青 链 霉菌 T 2 后 能 显著 提 高放 线 紫  K 1 红 素和 十一烷 基灵 菌红 素 的产量 。随后利 用 多拷 贝  质 粒构 建 包 含 ot 基 因 D r X NA 片段 的重 组 质粒 , 转  化 阿维链 霉 菌后显 著提 高 了阿维 菌 素 的产 量 。 由于 

因簇( e ae a.19 )确 定 了多数 基 因的功 能 , I d  t 1 9 9 , k , 随  其 利用 多拷 贝质 粒进行 游 离表 达 ,得到 的突 变株 不 

稳定 , 经过多次传代后质粒易丢失 , 失去高产特性 ,   不 利于 工业 生产 。夏 海洋 等 (0 6 20 )的研究 也证 明 

通讯作者 。A to fr o ep n ec . uh ro   ̄ so dn e研究员 , c 博士 , 主要从事微生物发酵工程研究。T l0 08 6 3 1; — i < hn y 9 @vpsn.o   e: 1—2 9 6 9 Ema : Z eg h 8 i. a m> l i c 收稿 日期 :0 70 —7 接受 日期 :0 70 —6 2 0 —32 2 0 —50  

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第 6期 

范与庆等: H 基 因整合表达在阿维链霉菌工业育种中的应用  O

14   09

o/ 因对阿维菌素 的生物合成具有正调控作用。 r X基   本 研究 通过 P R直接 克 隆 得 到完 整 的 o/ 结 构基  C r X

扩增 长度 约为 1 0 p的 o/ 基 因片段 。P R   0b 0 r X C  扩增 以 阿维 链 霉 菌 BB 9 3的 总 D I9 0 NA 为模 板 , 反 

因,然后在其前面加上在链霉菌中常用的强启动子  应 条 件 :5 4   ,8 4   ,2 7   ,0循 环 ; 9 ℃ 5S5 ℃ 5s7 ℃ 0 S3   红 霉 素抗 性 基 因启 动 子 (r p )利 用 整 合 型表 达  7 ℃延伸 5mi。待反 应完 成后 , emE *, 2   n 电泳检 测 。P R产  C 载体接合转移到阿维菌素工业菌株中,得到稳定高  物 经 凝 胶 回 收 , mH I和 E o   切 后 ,插 入  Ba   cR I酶 产 的重 组菌株 , 以直接 应用 于 工业 生产 。 可 该方 法也  p I7 2的 多克 隆位点 , 到重 组质粒 p I6 3  BB 1 得 BB 2 。 为基 因工程手 段对 其它 抗 生素工 业 菌株进 行遗 传改  142 重 组 质 粒 p I 2 .. BB87的 构 建  重 组 质 粒 
造 提供 了借鉴 。  
p I 6 3经 过 Xb   BB 2 aI和 B lI 酶 切 后 回 收 1 0   g  双 I   0 3 b 左右的 D A片段 ,包括红霉素抗性基因启动子  p N (r p ) o/ emE *和 r X结构 基 因 。将这 1 0 p的 D   0b 3 NA 

1 材料和方法 
11 菌 株和质 粒  .
a emil ) I 9 0 、 大 肠 杆 菌 ( sh r hacl 1 vr ti B B 9 3 is E c ei i oi  c  

片段 插 入 到质 粒 p 6 0的 多克 隆位 点 ,得 到 重组  U80
参 见 图 1  。

阿 维 菌 素 产 生 菌 阿 维 链 霉 菌 (tpo y e  质粒 p I8 7 r Sr tm cs e BB 2 。o/ X基 因重组质 粒 构建 的整 个过程   J 19和 E 157 } 80 M 0 T 2 6 ̄UZ 0 2均 由 本 实 验 室 保 存 。   pJ6 0为本 实验 室保存 。 BB7  由红霉 素抗 性  I 0 8 pI   1 2是 基 因启 动 子 插入 p 95的 Xb  U22 aI和 B mH I位 点  a   而形成 , 由本实 验室 保存 。   12 限制性 内切 酶 和试剂  . 本 研 究 中所 用 酶 类 均 购 于 T Ka a公 司 (E a R t  

本) ,其 中 P R选用 了高保真 的 L —aD A聚合  C A Tq N 酶 ;N D A分子量标准物购于 MB 公 司 ( 陶宛 ) I 立 ;   D A回收试剂盒购于赛百胜公司( N 中国)其它常规  , 试 剂 参 见 分 子 克 隆 (a bo k c 1 20 ) S m ro  ta ,0 0, .  
aemet vr cn标 准 品由本 室保藏 。 i   13 培 养基和 抗 生素  . 大 肠 杆 菌 培 养 基 为 L L 、O 和 S A、B S B OC;阿 

维链霉菌与大肠杆菌的接合转移培养基 、阿维链霉  菌 的种 子 培养 基 和 发 酵 培养 基 参 照 朱 浩 君 等 ,   ( 0 )阿维链 霉菌固体产孢培养基为 Y 2 3; 0 MS, 液体 
培养 基 为 Y ME( ee t1 20) B 中氨苄 青  E Kisr  . 00。L ca , 霉 素使 用 量 为 10 ̄/ ,安 普 霉 素 使用 量 为 5  0 gmL 0  ̄ /L, M S中安 普 霉 素 使 用 量 为 5  gm 接  gm Y 0 /E, 合 转 移 培 养 基 中 安 普 霉 素 使 用 量 为 每 平 板 l0 0  0 

g 。大肠杆菌 的培养 、 质粒提取和转化等基本操作  技 术参 照 Sm ro t 120 ) a bokca ( 0,链霉 菌 培养 、  . 0 总  D A 提 取 和 P R等 操 作 技 术 参 照 Kee c a  N C i r t1 s  .
(0 0 。 20 )   14 构 建 o X基 因重组 质粒  . f

图 1O 基因重组 质粒构建流程 图  .H
F g 1 F o h r  f o s u t n o r c mb n n   ls d o   i . . l wc a t c n t c i   f e o i a t a mi  f o r o p
o/ g n   rX e e

15 of 因整 合表 达及 验证  .   r X基

141 ot 基 因 的 克隆 .. r   X

根据 G n ak公 布 的 阿  eB n

ot 基 因 重 组 质 粒 ’ I 2 r X p B87转 化 大 肠 杆 菌  B E 15 7 U 80 T 26/ Z 02后 , 过属 间接 合转 移 至 阿维 链  p 通

维 链 霉 菌 基 因 组 中 预 测 的 o/ 基 因 序 列  rX ( P 8 82.) 计 P R引物 : N L 2 501设 C  
Pl5- :' CGGGATCCAGCGGTGGAGAAGCTGG  GTCTGATCG-’ 3;  

霉菌 B B 9 3 I90 ,得到若干接合子 ,通过抗性筛选和 
P R验证 ,得 到 阳性 重 组 菌 株 ,命 名 为 BI02 。 C B 8 7 

Ba    mH I
P2 5 - :' CGGAATTCCGCCCGAAGCCTTACCG 兀  CACCCC一 ’ 3o  

P R验证方法 :根据 p 80 中多克隆位点两侧的  C U 60 删 和t o序列 , X aI B l 位 点 两侧 设计 1 在 b  和 g I 1 对 
引物 :  

Eo I cR  

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l5  00
P3: ’ . CGTCAGAGAAGGGAGCG- ’ 5? KJ C( 3:  

农 业 生 物 技 术 学 报 

2 0 正  07

物 ,C P R验 证 ,结果 表 明 o' /X基 因仍 然稳 定整 合在   ̄ 染 色体 上 。将 这 1 菌株 进行 摇 瓶 发酵 , L 0代 HP C检  明重组 菌株 十分 稳定 。  

P4: ' 5- ACTCCCTGCAAGCCTCAGCG. ’ 3。  

反应 条件 :5 4 ,5 3 ,2 7 ,0循  测 阿维 菌 素产 量 , 9 ℃ 5S5 ℃ 0S7 ℃ 0S3 阿维 菌 素产量 相 差 不大 ( 1, 表 )证  环 ;2C 伸 5 n后 电泳 检测 。 7 *延   mi   将得 到的 阳性重 组 菌株在 无选 择压 力情 况下 连  续传 代 1 ,通过 摇瓶 发 酵 和 P R验 证检 测 重组  0次 C 菌株 BB 87的稳定性 。 BB 9 3和 阳性重 组菌  I0 2 将 I90 株进 行 发酵罐 发酵 , 取发 酵 液测量 菌体 生 物量 , 并对  发 酵产 物进行 HP C测 定 。 P C测 定方 法 : L HL 发酵 液  离 心 弃 上 清 ,菌 丝 体 用 甲醇 浸泡 抽 提 3  n后 离  0mi 心 , 上清 液 , 行 H L 取 进 P C测定 。 P C条件 : H L 流动 相 
为 甲醇 : ( 5 1 )流 速 为 1mLmi 检 测 波 长 为  水 8 :5 ,   / n, 2 6nn 柱 温为 2 "   4  r, 5C。
图 2 0 基 因 、 组 质 粒 p I 8 7和 重组 菌株 BB 8 7的  .  重 BB 2 I0 2
P R 验证   C
F g2 P i . . CR  e f a in o  矗X e e r c mb n n   ls d v ri t   f i c o 0 g n . e o ia t a mi  p p B8 7 a d r c mb n n  t i  B0 2   BI 2   n  e o ia t r n BI 8 7 sa

2 结果 
21 o )基 因 的克隆  .   f( 以 B B 9 3总 D I9 0 NA为 模 板 , 1和 P P 2为 引 物 ,   P R扩增 得 到 了 大小 约 为 1 0  p的 oD 基 因 片  C   0b 0 rf 段 ( 2 2泳 道 )P R产 物 纯 化后 经 B mH I和  图 , ,C a  

l6  D A/cR I H I mak r2 BB 9 3总 D A 为  、 , N E o   + 抽d I re; , I9 0   N

模 板 , lP P 、2为 引 物 的 扩 增 产 物 ; ,B B87为 模 板 ,3 P   3p I 2 P 、4 为 引物 的 扩 增 产 物 ;, I9 0 4 BB 9 3总 DN 为 模 板 ,3 P A P 、4为 引 

E o   酶切 插 入 p I7 2的多克 隆 位点 , 到重 组  cR I BB 1 得 双 向测 序 , 果 与 NC I 布 的序 列 高度一 致 , 结 B公 同源 
性 高达 9 .%。 98  

5BB 2 A P 、4为 质粒p I 6 3 以 P BB 2 。 1和 P 2为 引物 对 p I 6 3进 行  物 的 扩 增 产 物 ; , I 8 7总 DN 为 模 板 ,3 P 引 物 的  BB 2 扩增产物 。  
la d6  DNA/ o I+ n l mak r 2 P   n  , Ec R  Hidl  re ; , CR rd c  s g l po ut i   un
BI 9 3 a   e lt  n     2 a   r r ;3 CR p o u t B9 0   s tmp a e a d PI ,P   s p me s ,P   r d c  i u i g p B8 7 s t mp ae a d P ,P   s p me s ,P   sn   BI 2  a   e l t  n   3 4 a  r i r;4 CR p o u t s gBI 9 3g n m i DNA  s e l t n   3 P   s r d c  i   B9 0   e o c u n   a   mp ae a d P , 4 a   t p me s 5 P  p o u t sn  BI 2  g n mi . DNA  s i r r ; , CR r d c u i g B8 7 e o c a  tmp a ea d P , 4 a   rmes e lt  n   3 P   sp i r.  

22 o )基 因重 组质粒 的构 建  .   f( 将 p I6 3用 Xb  BB 2 aI和 B l 双酶 切 ,回 收酶  g1 I
切产 物 中的 1 0  p左 右 的片段 , 入质 粒 pJ 6 0   0 3 b 插 l8 0  

的多 克 隆 位 点 ,得 到带 红 霉 素 抗 性 基 因启 动 子 的 
ot rX基 因重 组质 粒 p I 8 7 以 P BB 2 。 3和 P 4为引 物 ,   重 组 质粒 p I 8 7为模 板进 行 P R验 证 ,结 果 显  BB 2 C 示 ( 2 3泳 道 ) 阳性 重 组 子 的 P R产 物 为 1 0  图 , , C   0 7

表 1BB 8 7稳定 性 验 证    I0 2
Ta l   rf ai n o   a i t  f B0 2   b e 1Ve i t   fs b l y o   i c o t i BI 8 7

b , 预想结 果一 致 。 p与   23 o )基 因的 整 合表 达 及 其对 阿维 菌 素 产 量 的  .  f(
影响 

231 阳 性 菌 株 的 筛 选 及 P R 的 验 证   将  ..   C p I87转 化 E 26 /U 80 ,然 后 通过 属 间接  BB 2 T15 7p Z 02 合转 移到 BB 93 通过 安普 霉 素筛 选 , I9 0 , 得到 阳性 重  组菌 株 BB 8 7 I02 。分别 以 BB 9 3和 BB 87的 总  I 90 I0 2 D NA为 模 板 , P 以 3和 P 4为引 物 , 行 P R验 证 , 进 C  
结 果 显示 ( 2 4 5泳 道 ) 以 B B 9 3总 D 图 , 、 , I9 0 NA 为  模 板扩 增 的没 有产 物 ,以 B B 8 7的 总 DN 为模  I 02 A 以 工 业 菌 株 B B 9 3为 对 照 , 对 重 组 菌 株  I9 0

板 扩增 的 P R产 物 大小 为 1 0 p 这 与预 计 的 结  C   0 , 7 b
果 完全 一致 。  

B B 87进 行 2  酵 罐发 酵 。2  酵罐 工艺 : I0 2 0L发 0L发   冻 干 管接 种 Y MS斜 面 ,8C培养 5 8 。 收 集孢 子  2 ̄ ~  d 接 一 级 种 子 培 养 基 ,8 0 mi 床 培 养 2 , 2 ℃2 0r n摇 / 4h  然 后 将 一 级 种 子 转 接 二 级 种 子 培 养 基 ,8C20 2  ̄ 0  r n摇床 培 养 2  接入 2  / mi 4h后 0L发酵 罐 , 8C培养  2 ̄

232 oD 基 因整 合 表 达 的 稳 定 性 及 对 阿 维 菌 素  ..  r f 产 量 的影 响 将 BB 8 7在 无 选 择 压 力 情 况 下 连  I02 续 传代 1 0次后 , 提取 总 D NA为 模板 ,3和 P P 4为引 

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第 6期 

范与庆 等:r o/ 因整合表达在 阿维链霉菌工业育种 中的应用  X基

1 l 0  5

8 , 1  通气量为 1 . 0  v 40 / i,2   of1 。 的片段构建游离表达载体 ,导人阿维    前 2h d :6 .vm,0 m n 1 h 0~ 8 r   f 和   4
如 后 通 气量 为 11  v 60r n 1  :.vm,0 mi。 2h开始 每 2    链 霉菌 表达 , 巧 菌 株阿维 菌 素产量 得 到提高 。 由 0 / 4h 阳性 加  加  0  但  

取 1 次样 , 定 生物量 ,2h后 开始 H L 测 7  P C测 定 阿维  于 是游 离表 达 , 质粒 容易 丢失 , 得到 的高 产菌 株性 状  菌 素 效价 。结果 如 图 3所 示 , 重组 菌 株 B B 8 7的  I 02

不稳定 , 经多次传代培养后易丧失高产特性 , 不利于  霉菌 中的作用 ,通过插入失活构建 了 。 中断菌    株, 发现阿维菌素产量降低。 将包含 o 4 与 。 的 f1   f   基 因片段再导人中断株后 , 阿维菌素产量恢复。 前后  结 果显 示 , 阿维 菌 素产 量 的提 高可 能是 o  单独 作  f 用 或 。 与 of1 同作用 的结果 。   f 共 4  
本研究 在 H n t1(03 的研究 基 础上 , wage .2 0) a 将  ot 结 构 基 因单 独克 隆 出来 后 , 其 前面 加 上在 链  r X 在 霉 菌 中通用 的红霉 素抗性 基 因启 动子 , 入 pJ60 插 l80  构建 成整 合 型表达 载体 , 导人 阿 维链霉 菌工 业 菌株 ,  

生 物 量 比 BB90 I 93有 所 提 高 , 阿 维 菌 素 产 量 是  工 业生 产 。 了进 一步 阐 明 。 基 因产 物在 阿维 链  为  

BB 9 3 2 倍 , I 90 的 . 5 达到 3 5  g L 效果显著 。  0 / , 3 m  

4 0  00 3 0  50

名 30 0  0



2 0  50 2 0     00 10  00 50 0  0  

发酵时间m  
Feme tt nt   r n ai i O me

得到的阳性重组菌株阿维菌素产量提高 了 1 倍 , .   5 结 果 表 明单 独 的 。 基 因产 物 也 能 提 高 阿 维 菌 素    产量。 重组菌株经过多次传代培养 ,C P R验证 , 导人  的 。 基因依然存在 ,   高产特性仍 未丧失 , 证明其  十 分稳定 , 用 于工业 生产 。 外所 得 的重组 菌株 的  可 此

弱  

螽  _ 薹

产 孢能 力较 出发 菌株 有 明显提 高 ,液体 培养 菌丝 碎  片化现 象严 重 , 明 。 基 因不 仅对 阿 维菌 素 的生  表   物 合成 有影 响 , 而且 还影 响阿 维链霉 菌 的分 化发育 ;   与 出发 菌株 相 比 , 酵液 的颜 色 明显变 浅 , 降低 了  发 这
发酵时间m  
Fe me t 矗 n咖 e r na O  

产 物 的后提 取难 度 , 有 利于 工业 生产 。 更  

阿维链霉菌中存在着许多影响阿维菌素合成的 
基 因 , 如 ae ( 芝 等 , 0 )ae Suz n  vD 陈 2 2 ,vC(tt 0 ma. E g le  . 03,kF 熊 伟 等 ,05 ,sA( nwa t1 2 0)bd ( l a. 2 0 )nd 余  贞 等 ,0 6等 。 20 ) 虽然 。 基 因的具体 作用 机制 现在    仍 未研究 清楚 , 综合 以前 的研 究 和本研 究结 果 , 但 可  初 步 推 断 。 基 因是 链 霉 菌 中一个 全 局 性 正 调 控   

图 3 BB9 0 . I 9 3和 BB 8 7的阿维 菌素产量和生物量 曲线图  I0 2
F g 3 Cu v s f v r c i  r d c i n a db o s  f i . . r e   a e me t p o u t  n   i ma so   o n o
BI 9 3 a d BI 8 7 B9 0     B0 2   n

3 _ i 寸沦 
Hw n t 1 20 ) 其 研 究 中 发 现 了 包 含  age  . 03 在 a( 中放 线紫 红素 与十 一烷 基灵 菌红 素的产 量 。通 过研 

因子 ,可能对于其它链霉菌的抗生素生物合成同样  也 具有 正调 控作 用 。 以尝 试着将 o  基 因导 人到  可 f
菌 、 贝链 霉 菌 、 斑 肉桂 地链 霉 菌 以及 金 色链 霉 菌 中 ,   以及 金 霉素产 生 菌 。  

0/ 基 因 的 80k NA 片段 能 提 高变 铅 青 链 霉 菌  其 他有 工业 生产 价值 的 抗生 素产生 菌 ,如 弗 氏链 霉  / '  ̄ . bD   黄 莫 究亚 克 隆 ,定 位 了与抗 生素 产量 提高 有关 的最 小 片  有 可 能得 到稳 定 高产 的泰 乐菌素 、 霉素 、 能菌 素 

段, 然后进行序列分析 , 确定最小片段包含 of1 f 和  4 。 两 个 基 因 。利 用 多 拷 贝 质 粒 pJ0   l72与 包 含 
参 考 文 献 
B r   W , i e  M , k r E E. mb u J u g R  M l rB  l Ba e    Bi a m  ,Cu re S A, ri      Ha t n   r ma Ko g Y  ,M o a h   L,Olo   n  L n g a R  n s n G,P r r I u e  ,  

Ag nsa dC e te a h ,1 7 ,1 : 6 - 6   et n h mo h rp y 9 9 5 3 1 3 7

C e  ( h nz 陈芝)We   文 莹)S n   宋 渊) dL  ( 季  , nY( , og Y( n a  i L 李 J
伦 ) f c  f gn dl o  o  vD Ol v r et s .E f t o  e e ee n f ae   l er cn  e i t  a n i
po u t n i  S e tm c s a emil   r d ci   n o t po y e  v r fi r is (. A t J   ca )  

T n c J B, a l k H, tp e     u a     W l c   S a ly E O,Oi   a d Omu a S  i wa R    n r  . Av rn c i s n w f mi  o   o e t n t emi t  a e t: er e t , e n a l y f p tn  a h l n i g n   c s

Mirboo i  ii ( 生 物学 报) 2 0 , 2 5: 3 ̄ 3  co il c Snc 微 ga a , 0 2 4 () 54 5 8
(  h ee t n lha sat i C i s  h gi   t c   n n wi E s br )
Hwa g Y  ,Ki E  ,Bi     d Ch i C Y.Cl n g a d n   S m  S r S a   o    o n oi   n n  

Po uig og i   d f mett n ( .Ani irb l rd c   ra s a  e nai n n m n r o J ) t co i  m a

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l5  02

农 业 生 物 技 术 学 报 
Pr s , 00. e s 20  

2 0 正  07

a ay i o   a DNA  fa me t si lt g a e me t   n ls   f   s rg n  t mu a i   v r ci n n

p o u t n i v r u   t po y e  vr ti s an J. rd ci   n a o s S e tm c s a e i s t i o   i r mi l   r s()  
Ap l d a d En i n n a   M ir b o o y 2 0 , 6 : pi   n   e vr me tl o c o i lg , 0 3 9 
l 3 2   26 -1 69

S u z n En wa l tt ma - g l  K,Co l n S e e h o R,Ka z r k F  n o   ,F d c k   c ma e   , Mc tu   Kr b e   Arh rH, e b r A,C e   h n Y,M i s u lJ a l r     n h l ,R i ad S A    l a d Gu t fs n C. n i e r g t ea e g n     n a c   e n   sa so   E gn e n     v C  e e t e h n et   i h o h rt   f d rme t   o i   ai o   o a c i t   t CHC-   n l g e p o u e   n o n s B2 a ao u   r d c d i 

Iea k d  H,No o ia , Us mi , Oh n m y  T a  M m T n  Omu a .  a d r S  Or a ia in o   e b o y t e i g n   l se  o   o y e ie g n z t   ft   i s n h t   e e cu tr f r p lk t   o h c d a t emi t   ma r l e a e me t   i  n l ni h c coi   v r ci d n n S e t my e   r tpo cs

Sr t c s vr t s ( . it h oo B o n ie r g  tpo e my e  e i a mi H J B oe n l ) c y g ie gn ei , n 2 0 , 2 3 :5 - 6   0 3 8 ( )3 9 3 9

a e fi ( .P o e d g   f t   t n lAc d my o   v r i s J r c e i s o   e Na o a  a e   f mil ) n h i
S in e   f t e US 1 9 , 6 1 5 9 9     ce c s     A。 9 9 9 : 9 0 -1 5 4 o h 1

Xi HY( a   夏海洋)Z a g (   , hn   张亮)C e  H 陈威华)HuM  L , h nW  ( ,   J   ( 胡敏杰)S e  J沈美娟 )Y n    杨 长举 )H agJ黄  , hnM  ( , ag J C ( , u n ( 隽)WagH B 王海彬) n  a  ( , n    ( adT nZJ覃重 军)T e f c  f . h   f to  ees
s v r l r g lt r   e e   n n ii t   r d c ii   f t e e e   e ao a u y g n s o  a t o i p o u t t o   h   b c vy

I e aH a dOmuaS Av r c nbo y tei ( . h mi l k d    n   r  . eme t   is h s J C e c   i n s ) a
Re i WS 99 97: 91 6l   V e ,l 7. 25 -2 O

Ki s r T e e  ,Bib M     n   ae   F r ci a  t ptmy e   b   J a d Ch t r K  .P a t l S r o c s c e

id s a s a so   t po c s a emil () C iee n u t l t i   fSr t i r  rn e my e  v r ti J. hn s  is

Ge ei ( ) Nowi   K: h   o n In sF u d t n n t s M . r c U T e J h  n e  o n a o . c h i  
20 . 00 

J unl f niit s中国抗 生素杂志)2 0 , 1 55 58 ora o A t oi ( b c , 0 6 3 : 2 ~ 2 
(  hn s  t n lh bt c  i C iee hE gi   s at n wi sa r )

L   ( vSJ吕淑 君 )Boy teio aemet J. r . is h s f vr ci ) Wol n s n( dNo s n t    eo

Y   ( 贞)Wa gQ 王茜)DegZx( uz 余 , n ( , n    邓子新 ) n   a  F adT oM  
(陶 美 风 ) .Ac vt n f set at it  ytei i  t ai  o i n  ni oi s hs   n i o l b c n s
S e o c s ̄ i a s b   i u t n o    e a i e r g lt r r t ptmy e vd n   y d s p i   f a n g t   e ao   r o v u

A t it s( ni oi 国外 医药 抗生素分册) 19 , 8()l4 18 b c , 9 7 1 2:  -    1 1
(  hn s) i C iee  n
M u p y K  Ga p o e n ih b t  eh l a ea d x si lt d r h   C. m r ti   i i t   ei s     - t n sh c n mu a e   r c mbn t n a t i e   fE c e i ha c l Re BCD n y   e o i a i  c i t so   s h rc i  o i c o v i   e z me

n d ,  e e o sr e     t p o c s J. hn s J u a  sA ag n   n e di Sr t c v n e my e ( C ie e o r l )   n

o Bit hoo y( 物 工程 学 报 )2 0 ,2 7  7 2 f oe n lg 生 c ,062:5-6  1

() o ra f a t il , 9 l 1 3 5 0 - 8 1 J_ un l B c r o l 9 , 7 : 8 5 5 2  J o eo g y
Omu a S k d   r   ,I e a H,Ih k wa J s i a   ,Ha a t  n mo o A,T k h s i C, a a a h    S i o e M , k h s i Ho i a   Na a a   Os n e h s   Ta a a h  n Y, rk waH, k z waH, o o   T, k c iH,S i a T a a iY  n    ̄ f M . n me Kiu h   h b   ,S k k   a d Ha o   i Ge o   s q e c  o  a   id s i l e u n e f n n u t a mi r o g n s r co ra i m  S rptmy e   t o cs e a e n t i :De u i g h e a i t   f p o u i g e o d r   vn il i s d cn  t   b l y o   r d c  s c n ay i n

Xin  熊伟)La g   梁运 祥)Z uH J朱 浩君)Mi Y o gw( , i   x( nY , h   ( , n     ( 勇 ) L     ( 和 平 )adZ e gY H ( 应 华 ) 闵 , vH P 吕 n  hn     郑 .  
Co s u t n o   t ptmy e   v r t i  k F  t n s sn   n t c i   fS r o c s a e mi l b d mu a t u i g r o e is  

P R me i e   e e r l e n  to   () o r a  f C ? dad g n   e a me t me d J t p c h .J u l o   n

A r ut a it h oo ( 业 生 物 技 术 学 报 )2 0 ,3 gi l rl oe n l c u B c y g 农 , 0 5 1 
()6 2 6 8i C i s  i  n lha sat 5: 7 - 7 (   hn e t E gi   t c) n e wh s br  

mea oi s () P o e dn s o   e Na o a Ac d my o   tb le J. rc e i   f t   t n l a e   f t g h i  
sce e     eU S , 001 98 221 -1 20 i nc sof t h A 2 , :1 5 22  

Z u H J ( 浩 君 ) hn     ( 应 华 ) td   n h    朱 ,Z e g Y H 郑 .S y o   u
C5 O- t yta se a e g n   c o ig s q e cn   a d 一 meh l n f r s   e e r lnn , e u n ig n 

S mb o k Ja d Ru s l D  . a r o    n   s el W Mo e u a   o i g A  a o ao     lc lrCln n : L b rtr y

rpa e n( . hn s ora o A t it s中国抗 生 素  el metJ C ieeJu l f i oi ( c ) n   n b c
杂 志 )2 0 , 8 15(   hns  i  n lha sat ,0 3 2 :- i C i e t E gi   t c) n e wh s br  

Ma u l ( ) na M .Ne Yok w  r :Cod S r g Hab rL b rtr  l  p n   r o  oao i a y


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