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猪圆环病毒病及免疫防控对策


猪圆环病毒病与免疫防控对策

报告内容
一、病原概况 二、流行趋势与毒株变异 三、诊断技术研究进展 四、疫苗研制与应用 五、免疫防控对策

一、病原概况
? ? ? ? ? ? 病毒粒子17nm,无囊膜,二十面体 环状单股DNA,滚环复制模型 基因组:PCV1=1758nt;PCV2=1766-1768nt ’) 1

个结构蛋白(30 kDa),1个复制酶(Rep & Rep Rep’ 抗性强:65℃ 1h,70 ℃ 10min PCV1无致病性,PCV2引起临床疾病

一、病原概况--引起的相关疾病

多系统衰竭综合征(PMWS)

猪皮炎肾病综合征(PDNS)

呼吸道综合症(PRDC)

母猪繁殖障碍(RF)

一、病原概况--

解剖病理变化

全身性淋巴结肿大

增生性肠炎

间质性肺炎

肾炎

二、流行趋势与毒株变异
北爱尔 2000 瑞典 2002 丹麦 2006 德国 1999 匈牙利 2000 希腊 2001 瑞士 2001 比利时 2000 法国 1997 西班牙 1997

加拿大(1997) 美国(1996) 墨西哥(2001) 古巴(2010)

中国(2000) 韩国(1999) 日本(1999) 泰国(2002) 菲律宾(2004) 印度尼西亚(2006) 澳大利亚(2006) 新西兰1991

巴西(2000) 阿根廷(2002) 南非(2003)

几乎所有养猪国家均有PCV2流行

PCV2与其他病原混合感染情况
120 100 80 感染比例% 60 40 20 0

98%

52% 36% 15% 14% 7.6%
体 毒 菌 菌

5.4%
染 单 独 感

1.9%





































(来源于美国依诺华州立大学研究报告)











我国PCV2流行毒株遗传变异分析
黑龙江 内蒙古 吉林 辽宁

山东 河南 湖北 湖南 江苏 上海 安徽
福建

广东

广西

EU283329,AY916791,AY484413,AF201897,DQ220738,AF201311,EF458306,AF538325,AY177626,EF619037,DQ910866, DQ220739, DQ629115-119,EU340257,AJ293869,DQ017036,AY291316,EU136717,AY849938,DQ201639,DQ478947,FJ644919,AY732494,AY18 8355,AY217743,AY536755-756,EU257516,EU257511,AY181945,AY682990,FJ644559,AY291318,AY651850,AY604430,EF524516-5 22,AY322000,FJ644563,AY641542,EF524528, AS,SY,SH,JMS,HN,YJ,QTH,HL,BY,JS
8 2

EF524529,AY691679,AY536756,AM086384
A Y 3 9 1 7 2 9 A Y 9 6 9 0 0 4 F J6 0 8 5 4 1

8 4

A F 0 5 5 3 9 4 E F 5 2 4 5 1 5
8 8

PCV2b

E F 5 2 4 5 3 6

5 8

EU450592,DQ218421,EF210106,EF524524/25/27/30/34/35,EU921256,FJ623185,EF675244,FJ644557,AY847748,FJ60853 9/40/42/43/44/45/46/47/48/49,FJ041151,FJ644932,FJ644556,DQ195679,EF493837,AY691169,DQ997817,FJ440338,EF42 MZL,JF,CF,WF 1971,EU095020, 1971,EU095020,MZL,JF,CF,WF
E F 5 2 4 5 2 3
7 9 1 0 0

8 2

E U 1 4 8 5 0 3 E U 1 4 8 5 0 4 E U 1 4 8 5 0 5

PCV2c

E F 5 2 4 5 1 7
5 9 1 0 0 1 0 0 8 0

D Q 1 5 1 6 4 3 D Q 3 2 2 7 0 1

D Q 3 6 3 8 6 0 A Y 1 8 1 9 4 6
6 8 5 8 8 4 9 4

A Y 1 8 1 9 4 7 F J1 5 8 6 0 7 A Y 5 1 0 3 7 5
6 2

F J5 9 4 4 7 1 E F 5 2 4 5 3 9 E F 6 7 5 2 4 1

PCV2d

6 2

9 9

9 6 1 0 0 5 8

B D H A H M D J

E F 5 2 4 5 1 8
9 0 1 0 0

AB072302,AY754017,AF117753,AF109398,AY874169 AY556474,EF675229,EF524526/31/32/33/37/41
A Y 1 4 6 9 9 3 A B 4 2 6 9 0 5 C L
9 9

1 0 0

L G A F 3 6 4 0 9 4 A Y 1 4 6 9 9 2

6 5

6 8 1 0 0

A F 2 0 1 3 0 7 E U 1 3 6 7 1 1 A F 2 0 1 3 0 8
1 0 0

A F 2 0 1 3 1 0

8 9

AF109399,AF201305,DQ870484,AF381176,AY424401
D Q 1 0 4 4 2 3 A F 4 6 5 2 1 1 A F 1 1 2 8 6 2
5 2 9 3 5 5

PCV2a

9 5

D Q 6 2 9 1 1 3 D Q 6 2 9 1 1 4 A F 4 5 4 5 4 6 A F 2 6 4 0 3 8

7 1

D Q 3 9 7 5 2 1 A F 5 2 0 7 8 3 A F 0 5 5 3 9 2

EF524538/40/42,AB072303,AF381175/7,AJ223185,AF055391,AY181948,AF027217
0 .0 3 5

19株毒株 Cap蛋白编码基因 ORF2 3 ′末端特殊性分析 3′
680 690 700 CTTAAAGACCCCCCACTTAACCCT TAAXXXXXX Majority ----+---------+---------+-------1039位 ...................... .... TGAATAA YJ-08-China(1766) ........................ A.GTGA AH-08-China(1766) ........................ A.GTGA MDJ-07-China(1766) ........................ A.GTGA BDH-08-China(1767) ........................... AS-05-China(1767) ........................... BY-05-China(1767) ........................... CF-05-China(1767) ........................... HL-04-China(1767) ........................... HN-06-China(1767) ........................... JF-08-China(1767) ........................... JMS-07-China(1767) ........................... JS-05-China(1767) ........................... MZL-08-China(1767) ........................... QTH-07-China(1767) .......C....A.............. SH-06-China(1767) ........................... SY-08-China(1767) ........................... WF-07-China(1767) ....................A..C... CL-08-China(1768) ....................A..C... LG-08-Japan(1768)

676 676 676 676 676 676 676 676 676 676 676 676 676 676 676 676 676 676 676

19个流行毒株基因组PCR-RFLP结果

a PCV2 PCV2a

WF AH

MZ L HO

MD J QT H JM S BD H

HL CL

BY YJ

HN JF

SY LG

SH

AS

CF

JS

M
2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp

1760bp 1160bp

600bp

FbaⅠ

2

19个流行毒株基因组PCR-RFLP结果

b PCV2 PCV2b

PCV2d

SH MZ L MD J QT H

JM S BD H

HO

WF HN

LG

BY AH

SY CL

HL

YJ AS

CF

JF

JS

M
2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp

1530bp 1250bp 1020bp

510bp

240bp

AccⅠ

2

小结
我国 PCV2 流行毒株主要有 3个基因亚型: 1768 、 1767 、1766 PCV2a(10.5% )、 PCV2b(73.7%) 、 PCV2d(15.8%) 出现了 1766nt变异毒株; ORF2框架改变, Cap蛋白有 1 ~2个氨基酸延伸
(Harding JC, et al. Vet Microbiol 2010, 145:209-19.)

三、诊断技术研究进展
1、血清抗体检测方法  (1) 免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA) (2) 重组蛋白间接ELISA (3) 单抗阻断ELISA 2、 病毒抗原检测方法 (1)直接免疫荧光试验(IFA) (2)免疫组化试验 (3)单抗夹心ELISA 3、病毒核酸检测方法 (1) 常规PCR (2)荧光定量PCR

免疫过氧化物酶单层细胞试验 IPMA

血清抗体阳性反应

对照组

IPMA法对不同地区猪场发病猪群血清抗体的检测
送检地区 Areas 吉林白山 吉林松源 吉林延吉 哈尔滨阿城 哈尔滨呼兰 哈尔滨香坊 云南昆明 上海浦东 上海松江 上海金山 河北定州 江西五丰 内蒙赤峰 合计Total 血清样本数 Serum samples 21 7 12 7 6 191 14 30 20 16 30 10 60 424 阳性头数 Positive number 9 1 9 5 3 187 8 26 18 11 26 3 60 336 阴性头数 Negative number 12 6 3 2 3 4 6 4 2 5 4 7 0 58 检出率(%) Detection rate 42.8 14.2 75.0 71.4 50.0 97.9 57.1 86.6 90.0 68.7 86.6 30.0 100.0 79.2

单抗阻断ELISA检测PCV2灭活疫苗抗体消长规律
试验猪 号 Pig No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 PCV2 灭活疫苗免疫后不同时间血清抗体测定(阻抑率/ %) Antibody level at different weeks post-immunization with PCV2- inactivated vaccine (PI/ %) 0w 32.72 31.48 24.78 -2.29 57.24 29.54 46.00 32.15 43.51 25.13 36.29 1w 18.84 32.83 7.15 -4.77 52.75 2.92 22.6 5.64 44.42 9.68 20.95 2w 6.13 23.26 19.96 11.11 50.42 20.17 18.19 7.11 78.64 30.01 81.28 3w 4.78 4.39 5.53 71.36 53.55 34.12 69.03 51.97 87.7 68.97 82.82 4w -9.4 -1.43 -2.97 78.06 77.74 77.92 81.61 74.43 87.21 83.68 94.65 5w -2.59 -1.93 6.43 87.32 75.81 82.19 82.28 80.03 84.05 86.78 92.27 6w 2.82 9.87 5.4 87.32 82.15 87.37 91.91 81.57 90.67 88.76 93.17 7w 2.37 12.34 1.31 88.35 95.32 91.00 92.49 81.99 89.21 88.17 88.76 8w 19.18 32.12 2.03 83.14 83.09 93.57 93.17 80.22 89.13 94.47 95.01 9w 73.56 85.03 81.19 92.58 91.41 96.54 97.57 88.42 89.88 94.78 94.02 10 w 78.90 87.05 84.22 93.48 91.37 95.77 97.12 87.21 93.19 95.46 93.88 11 w 83.93 88.85 87.03 94.83 89.21 96.63 96.99 88.64 92.85 92.54 97.39

基于单克隆抗体的阻断ELISA抗体检测试剂盒

病毒核酸检测-常规PCR和荧光定量PCR

猪圆环病疫苗类型
1. 全病毒灭活苗: 病毒细胞培养液灭活后与佐剂乳化制备的疫苗 2.亚单位疫苗:重组杆状病毒表达的Cap蛋白产物制备的疫苗 3.弱毒疫苗:细胞传代获得的致弱毒株,用于制备冻干疫苗 4.嵌合型病毒疫苗:PCV2与PCV1的ORF2基因互换的嵌合病毒 5.病毒活载体疫苗:用腺病毒、伪狂犬病毒表达的PCV2Cap蛋白 6.DNA疫苗:构建ORF2基因至真核表达载体制备的核酸疫苗

国外猪圆环病毒疫苗的应用情况
1.美国富道:6个猪场育肥猪接种,未接种疫苗组死亡率 为7.7%,接种后死亡率下降为1.8%。 2.德国勃林格:对保育猪接种,未接种疫苗为死亡率为 9.5%;疫苗接种后死亡率下降为2.4%。 3. 法国梅里亚:在母猪使用,保育猪的死亡率从4.4%下 降到2.6%;育肥猪死亡率从6.6% 下降到5.1% 。

PCV2毒株分离鉴定

病毒 分离

临床PMWS病例

疫苗种毒的培育与传代
图 1 P CV 2/LG 株 传 代 毒 价 测 定 曲 线 7 6 5.45 毒价( Log10 对数) 5 4 3.5 3 2 1 0 1 5 10 15 20 25 30 35 代次 40 45 50 55 60 1.75 2.75 3 4.25 3.75 5.6 6 6 6.3 6.6 6.5

病毒繁殖动力学观察
120h

12h

24h

48h

72h

96h

120h

PCV2/LG株理化特性试验
耐热性试验 处理时间 毒价测定 耐酸碱试验 毒价测定 有机溶剂 毒价测定 核酸型鉴定 毒价测定 红细胞凝集 结果判定 -20℃ 7d 105.5 pH3.0 104.3 乙醚处理 104.5 5-IUDR 104.6 鸡 无 4℃ 7d 104.7 pH5.0 105.0 甲醛处理 100.0 未处理 105.5 豚鼠 无 家兔 无 绵羊 无 猪 无 20℃ 7d 104.5 pH7.0 105.5 氯仿处理 104.3 37℃ 7d 104.3 pH9.0 104.7 未处理 105.5 56℃ 30min 104.7 pH11.0 103.0 70℃ 30min 102.7

疫苗免疫佐剂的筛选

14000 12000 10000 抗体效价 Antibody titers 8000 6000 4000 2000 0 0W 1W 2W 3W 4W 5W 6W 7W

A B C D E F

油包水 国产白油 水包油包水 ISA206 水剂型 ISA15VG 纳米佐剂 IMS1315 铝胶佐剂 铝胶 PBS 对照 PBS

周数(Weeks)

疫苗免疫剂量试验
剂 量 猪 号

0.1 ml
1 2 3

0.5 ml
4 5 6 7

1 ml
8 9
<25 <25 <25
200 200 200 200 100 200 800 1600 25 50 400 800

2 ml
10 11 12
<25 <25 <25
50 800 1600 800 200 200 50 100

4 ml
13 14 15
<25 <25 <25
25 50 100 200 100 400 25 200

对照组
16 17 18
<25 <25 <25 <25 <25 <25 <25 <25 <25 <25 <25 <25 <25 <25 <25

0w 1w 2w 3w 4w

<25 <25 <25 <25 <25 <25
100 400 200 100 100 200 400 400 200 200 100 200 100 200 200 200 200 200 800 400 400 800

200 400 400 1600

800 1600 1600 3200

1600 1600




400 100 200


100 100


1600 1600 800 3200 6400


100


800 1600 1600


800 1600


400 800 800 800


400 1600


400 3200


100 50 100


50 200 400 25 100 400

5w 6w 7w

50

100 400

200 1600 800

400 3200

200 1600 200

400 1600

1600 3200

1600 3200 3200

3200 1600 12800

疫苗安全性试验

疫苗 批号

试验 猪 头数 11 10 9 10 8 10

接种 剂量

单剂量疫苗接种临床观察结果 采食 消瘦 局部反应 热反应 过敏反应 抗体阳转 无影响 无影响 无影响 无影响 无影响 无影响 无 无 无 无 无 无 无 无 无 无 无 无 无 无 无 无 无 无 无 无 1/9 无 无 无 11/11 10/10 9/9 10/10 8/8 0/10

结果 判定

200701 200702 200703 200704 200705 对照组

4ml 4ml 4ml 4ml 4ml 未注

安全 安全 安全 安全 安全 正常

疫苗免疫效力试验
疫苗 批号 试验 免疫 猪数 剂量 1+1ml 1+1ml 1+1ml 1+1ml 1+1ml 未注 间隔 日数 21d 21d 21d 21d 21d 21d 攻毒 剂量
1×105.0 1×105.0 1×105.0 1×105.0 1×105.0 1×105.0

抗体效价检测 免疫前 效检前 ≤1:50 ≤1:50 ≤1:50 ≤1:50 ≤1:50 ≤1:50

免疫保护率评价 临床保护 病理保护 11/11 10/10 10/10 9/9 11/11 0/10 10/11 9/10 10/10 9/9 11/11 0/10

保护率

200701 11 200702 10 200703 10 200704 9 200705 11 对照组 10

1:200~800 1:200~800 1:200~1600 1:200~1600 1:200~1600 ≤1:50

90.9% 90.0% 100% 100% 100% 0%

免疫效力评价-毒血症变化

攻毒后21天病毒血症检测;

攻毒后第28天迫杀猪腹股沟淋巴结病毒检测

疫苗临床试验
仔猪主动免疫试验 试验组别 疫苗免疫组 空白对照组 试验猪数 5592 2640 发病率 5.8% 21% 死淘率 3.0% 6.6% 出栏率 94.2% 79.0%

母猪被动免疫试验 试验组别 疫苗免疫组 空白对照组 母猪数 309 149 仔猪数 返情率 出生发病率 断奶发病率 3236 1495 6.3% 14.2% 94.2% 86.6% 96.4% 88.9%

疫苗在“高热病”爆发猪场的使用
PRRS活苗 Ch1R 株 PCV2 灭活疫苗 LG株

40 35 30 25 20 15 10 5 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 时间(月)

死亡率%

保育猪 育肥猪

全国26省推广应用,疫苗接种达 1500万头份

猪圆环病毒灭活疫苗( LG株)的应用情况
? 全国26个省推广应用 ? 疫苗接种1500万头份 ? 疫苗安全好,无应激反应 ? 有效率达98% ? 平均死亡率降低8%左右 ? 平均出栏率提早5-7天 ? 药物使用量减少30% ? 每头经济效益50-100元,投入比>1:5 ? 15个猪场与进口疫苗对比各项指标基本一致

疫苗免疫程序
1.仔猪:2-3周龄首免,间隔3周加强免疫一次,1ml; 2.后备母猪:配种前做基础免疫二次,间隔3周,产前1个 月加强免疫一次,2ml; 3.经产母猪:跟胎免疫,产前1个月接种一次,2ml; 4.公猪及成年猪:实施普免,每半年免疫一次2ml。
抗 100 体 效 80 价 ( 60 ) 40 20 0 5 10 15 20 25 30 35 40d PI%

五、免疫防控对策
? 疫苗免疫是预防控制本病的关键,已经取得了满意效果 ? 鉴于PCV2与PRRSV混合感染十分普遍,与PRRSV活疫苗联合免 疫效果更好 ? 引进种猪严格检疫,全进全出,定期消毒,规范管理 ? 添加支原净、金霉素、强力霉素、阿莫西林等保健,控制其 它病原感染 ? 对发病猪群,清除发病猪,淘汰阳性猪


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猪圆环病毒病及其综合防治
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