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STS标记在扬麦158


分子植物育种, 2008 年, 6 卷, 3 期, 499-503 页 第 第 第 Molecular Plant Breeding, 2008, Vol.6, No.3, 499-503

研究报告 Research Report

STS 标记在扬麦 158×淮麦 18 F4 群体中的应用及其与 PPO 活性的关系
何贤芳 王

晓波 司红起 夏云祥 马传喜 *
安徽农业大学农学院, 合肥, 230036 * 通讯作者, machx@163.net

小麦籽粒中的多酚氧化酶活性是导致酶促褐变的主要因素。选育低多酚氧化酶活性的品种是改良 面制食品外观品质的重要途径之一。本研究利用位于小麦 2A 和 2D 染色体上 PPO 基因分子标记 PPO18 和 STS01, 对扬麦 158× 说明不同带型与 PPO 活性的相关 淮麦 18 组合的 300 个 F4 代分离株系进行 PCR 扩增, 性。结果表明用 PPO18 扩增的 300 个分离株系中有 59 个扩增出 876 bp (2Aaa 型)的目标片段, 其活性均值 为 82.01; 个同时扩增出 685 bp 和 876 bp 的目标片段(2Aab 型)其活性均值为 163.41; 46 其余 195 个扩增出 685 bp 的目标片段(2Abb 型)其活性均值为 233.73。方差分析表明三者的 PPO 活性差异达到极显著水平, 其 中基因型为 2Aaa 型的 PPO 活性值明显低于 2Abb 型; PPO18 在本试验群体中对 PPO 活性的决定系数为 66.61%; STS01 扩增的 300 个株系中都扩增出了 560 bp 的片段, 用 群体间没有差异。文中说明了两对引物 在该群体中的效应及其与 PPO 活性的关系。 关键词 小麦, 多酚氧化酶, STS 标记, 分离株系
摘 要

The Application of STS Marker in Yangmai158 ×Huaimai18 F4 Separating Plant Lines and its Relations with PPO Activity
He Xianfang Wang Xiaobo
* Corresponding author, machx@163.net

Si Hongqi

Xia Yunxiang Ma Chuanxi *

College of Agronomy Anhui Agriculture University, Hefei, 230036

Polyphen ol oxidase (PPO) activity is the major factor of resulting the brown discoloration of Abstr act wheat-end-products. It is an important way to breed new wheat cultivars with low PPO activity in order to improve their quality in appearance. Two STS markers PPO18 and STS01 were used to screen the 300 F4 separating plant lines derived from a cross Yangmai158 ×Huaimai18 and validate the correlation between the polymorphic frag- ments of PPO18, STS01 and grain PPO activity. The results indicated that PPO18 could amplify 685 bp and 876 bp in different genotypes. 59 plant lines with the genotype 2Aaa showed low PPO activity (mean value: 82.01); 46 plant lines with the genotype 2Aab showed middle PPO activity (mean value: 163.41); the rest 195 plant lines with the genotype 2Abb showed high PPO activity (mean value: 233.73). The R-square of this maker (PPO18) in the separating plant lines is 66.61% of phenotypic variance for PPO activity. PPO18 is an efficient and reliable molec- ular marker for PPO activity and can be used in wheat breeding programs so as to choose low PPO activity culti- vars. All plant lines amplified 560 bp fragments using STS01. The article also evaluated the two markers for their feasibility in breeding programs. Keywor ds Wheat, Polyphenol oxidase, STS marker, Separating plant lines 面制食品在我国居民膳食结构中占有很大的比 例。在馒头、 饺子和鲜面蒸煮前的几个甚至几十个小 时的贮存期间或挂面干燥过程中,颜色褐变现象十 分普遍(刘建军等, 2002)。这种褐变不仅影响面制食 品的外观品质,而且还影响其蒸煮特性和营养价值 (李军红等, 2000)。研究表明多酚氧化酶(polyphenol

基金项目: 本研究由国家科技支撑计划(2006BAD01A02), 公益性行业(农业)科研支项(nyhyzx07-002), 农业部 引进国际先进农 “ 业科学技术” 项目(2006-G2)资助

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oxidase, PPO) 活性及其相应的底物是引起颜色褐变 的主要原因(Bhattacharya et al., 1999)。 籽粒中的 PPO 活性可以决定面条 (团) 颜色稳定性的 50% ̄70% (Morris et al., 2000)。许多植物 PPO 由多基因家族编 码(彭世清, 2000), 小麦 PPO 的同工酶也有 12 种之 多 (Kruger, 1976)。Jimenz 和 Dubcovsky (1999)与 Anderson 和 Moms (2001)通过对代换系 PPO 活性的 同时指出针对 PPO 的底物专化性存在多个等位基 因。 Demeke 等(2001)指出 PPO 活性是多基因控制的 遗传性状, 在很大程度上受环境因素的影响, 小麦中 与 PPO 活性有关的基因可能在 2D, 2B, 3D, 2A, 3B, 6D 染色体上。Baik 等(1994)也发现种植在澳大利亚 和美国的同一品种籽粒 PPO 活性之间存在显著差 异, 但对同一地点的不同品种进行比较, 发现基因型 是影响 PPO 活性的主要因素。葛秀秀等(2003)提出 小麦多酚氧化酶活性的高低不仅受环境的影响, 同 时也受基因型影响,且主要受两对主基因和微效基 因的影响。葛秀秀等(2004)应用植物数量性状主基 因+多基因混合遗传模型对冬小麦 PPO 活性的遗传 分析进一步表明, PPO 活性受 2 对独立主基因控制。 张立平等(2005)采用复合区间作图法对冬小麦品种 中优 9507 与品种 CA9632 杂交组合的 DH 群体的 PPO 活性进行 QTL 分析, 发现控制小麦 PPO 活性的 主效 QTL 有两个, 且分别在 2AL 和 2DL 染色体上, 二者贡献率分别为 37.9% ̄50.0%和 25.0% ̄29.1%, 该 QTL 与 SSR 引物 Xgwm312 紧密连锁。韩俊利用 盖钧镒和章元明(2002)提出的植物数量性状单个分 离世代群体遗传模型分析方法分别对本组合的 F2 群 体、 2:3 家系群体的 PPO 活性值进行遗传分析,结果 F 表明 PPO 活性受两对主基因控制,且主基因表现为 加性—显性效应, 基因遗传率达到 88.44% (韩俊等, 2006)。基因型是影响 PPO 活性的主要因素, 不同品 种间 PPO 活性存在较大差异, 因此, 通过遗传改良选 育低多酚氧化酶活性的品种来改善各种面制食品外 观品质是可行的。 Sun 等(2005)根据 AY596268 这一 cDNA 序列 设计引物, 发现 PPO18 在不同 PPO 活性品种中扩增 片段的长度表现出多态性,即低 PPO 活性品种比高 PPO 活性品种的 PPO 基因在第一内含子的 5' 端多 了一段长度为 191 bp 的序列, 并将此标记定位在 2A 染色体上。王晓波等(王晓波, 2007, 私人通讯)根据 Aderson (http://www.ncbi.nih.gov/) 发 表 的 一 段 mR- NA 序列(GenBank 登录号 AY515506)开发出一个定

位于 2D 染色体上的 STS 标记 -STS01, 发现这对引 物在不同 PPO 活性品种中表现扩增片段的显隐性多 态性, 即在低 PPO 活性品种中扩增出 560 bp 的目标 片段, 而在高 PPO 活性品种中则扩增不出任何片段。 本研究利用 PPO18 和 STS01 两个分子标记对扬麦 158× 淮麦 18 的 300 个 F4 分离株系进行 PCR 扩增, 旨在说明此两对引物在该群体中的效应及其与 PPO

测定,也推测控制小麦 PPO 的主效基因为 1 ̄2 个, 活性的关系。

1 材料与方法
1.1 材料 将 2005 年收获普通小麦(Triticum Aestivum)扬麦 158× 淮麦 18 的 300 个单株 F3 种子于 2005-2006 年 度在安徽农业大学试验农场(合肥)秋播, 行长 2 m, 行 距 25 cm, 每行播种 100 粒。 分行收获、 脱粒、 储藏。 该 杂交组合的 F4 株系种子用于本研究。 1.2 PPO 活性的检测 按照 Morris 和 Anderson (1998) 和 Anderson 和 Morris (2001)方法, 并做部分修改。 用瑞典产旋风磨制 备全麦粉(过 0.5 mm 筛)。 称取 0.3 g 全麦粉放入 50 mL 小烧杯中, 加入 7.5 mL 反应试剂(50 mmol, pH 6.5 的 MOPS 缓冲液, mmol L-DOPA),恒温气浴振荡器 10 振荡器速度设 上振荡 5 min (样品充分暴露在空气中)。 为 175 rpm, 温度设为 37℃。 迅速将反应后的样品放在 冰块上终止反应 3 min。 快速混匀样品, 倒入 10 mL 的 离心管中, 离心 5 min, 离心速度设为 8 000 rpm。 以反 应试剂(空白 L-DOPA/MOPS)为对照, 475 nm 下测 在 PPO A 定上清液的吸光度。 活性计算为: 475*103/(5*0.3), PPO 活性单位为 AU/min*g。 1.3 小麦基因组 DNA 的提取 利 用 改 良 的 SDS 单 籽 粒 法 提 取 小 麦 基 因 组 DNA。 每个株系随机选出 100 粒小麦种子, 磨粉, 称重。 并称取全麦粉重的 1%放入 1.5 mL 的离心管中,加入 0.7 mL SDS 提取缓冲液 (288 mmol NaCl, 200 mmol Tris-HCL, 25 mmol EDTA, 0.5% SDS), 0.5 mL 酚:氯 用 仿:异戊醇(25:24:1)抽提去除蛋白质, 经异丙醇沉淀, 70%酒精漂洗后, 真空干燥, 加入 40 μ 双蒸水, h L 24 后紫外分光光度计测定 DNA 浓度, -20℃保存备用。 1.4 PPO18 PCR 扩增 PPO18 是 Sun 等(2005)开发的一个小麦 2A 染色 体上的 STS 分子标记。 总反应体系(略有改动)为 20 μ L,

STS 标记在扬麦 158× 淮麦 18 F4 群体中的应用及其与 PPO 活性的关系 The Application of STS Marker in Yangmai158 × Huaimai18 F4 Separating Plant Lines and its Relations

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CAA-3'。 下 游 引 物 序 列 为 5'-AGAAGGACCACAAGC- 酶。反应条件为 95℃预变性 5 min; 95℃变性 30 s, CGTAG-3'。 PCR 扩增产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳分离, 缓 60℃退火 30 s, 72℃延伸 1 min, 循环 40 次, 最后 72℃ TAE 溶液, v 电压电泳 1.2 h, 110 EB 冲液体系为 1× 延伸 10 min。 染色, 凝胶成像系统拍照、 分析并保存。 上游引物序列为 5'-AACTGCTGGCTCTTCTTC 含有 1× PCR 缓 冲 液 , mmol/L Mg2+, mmol/L 1.5 0.2 dNTP, 上下游引物各约 12 pmol, 模板 80 ng, U Taq 1.5 CCA-3'。 下游引物序列为 5'-AAGAAGTTGCCCATGTC- CGC-3'。 1.5 STS01 PCR 扩增 STS01是王晓波等 (王晓波, 2007, 私人通讯)开 发的一个小麦 2D 染色体上的 STS 分子标记。总反 应体系为 20 μ L,含有 1× PCR 缓冲液, mmol/L 1.5 2+ Mg , mmol/L dNTP,上下游引物各约 12 pmol, 0.2 模 板 80 ng, U Taq 酶。 1.5 反应条件为 94℃预变性 5 min; 94℃变性 1 min, 60℃退火 30 s, 72℃延伸 1 min, 循环 36 次, 最后 72℃延伸 8 min。 上 游 引 物 序 列 为 5'-CGCCGACCATTTCAA- 1.6 数据处理 采用统计分析软件 SAS 对所测试验数据进行常 规统计分析。

2 结果与分析
2.1 不同株系的 PCR 扩增结果 用 PPO18 扩增的 300 个 F4 株系中出现 2Aaa、 2Aab 和 2Abb 三种不同的电泳条带(图 1), 比例分别 2Aaa 型电泳条带约占该群体 20.00%, 2Aab 型约 为: 占 15.00%, 2Abb 型的占 65.00%;用 STS01 扩增的 300 个分离株系中都出现了 560 bp 的目标片段, 群 体间没有差异(图 2)。

图 1 PPO18 在群体中的 PCR 扩增表型 122、 292、 191、 192、 193、 194、 197、 199 和 200 分别为不同株系的编号 195、 198、 注: M 为 DNA marker, 224、 291、 Figure 1 PCR results of PPO18 in population Note: M: DNA marker, 224, 122, 291, 292, 191, 192, 193, 194, 195, 197, 198, 199 and 200 are different plant lines

图 2 STS01 在群体中的 PCR 扩增表型 122、 291、 292、 191、 192、 193、 194、 195、 198、 和 200 分别为不同株系的编号 197、 199 注: M 为 DNAmarker, 224、 Figure 2 PCR results of STS01 in population Note: M: DNA marker, 224, 122, 291, 292, 191, 192, 193, 194, 195, 197, 198, 199 and 200 are different plant lines

2.2 不同基因型条带的 PPO 活性变异 检测结果表明不同基因型的 PPO 活性变幅较 大, 其中基因型为 2Abb 的群体表现尤为突出。从图 3、 5 中我们可以看出基因型为 2Abb 和 2Aaa 的群 图

体中 PPO 活性值呈近偏态分布,活性值分别主要集 中在 220 ̄260 和 70 ̄80 这两个区段内,个数分别为 83 和 13 个, 占群体的 42.57%和 22.03%; 其中 2Abb 型条带,活性均值为 233.73 变幅为 61.00 ̄470.67;

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2Aaa 型条带活性均值为 82.01, 变幅为 45.33 ̄175.33。 PPO 活性均值为 163.41, 变幅为 100.00 ̄275.33。 图 4 中我们可以看出在基因型为 2Aab 型的群体中 从图 6 我们可以看出在扬麦 158× 淮麦 18 的 300 PPO 活性值分布在各个区段内相对比较均衡, 群体间 个 F4 分离后代中 PPO 活性主要集中在 200 ̄250 这一 区段, 109 个株系, 有 站群体的 36.33%; 其中最大值 为 470.67, 最小值为 45.33, 平均值为 163.05。 2.3 不同带型株系 PPO 活性的差异 对 2Aaa、 2Aab 和 2Abb 这三种不同的基因型条 带进行方差分析,结果表明三种基因型间 PPO 活性 差异达到极显著水平(P<0.01), 群体间检测基因型为 2Aaa 的 变 异 系 数 为 32.31% , 2Aab 的 变 异 系 数 为 25.43%, 2Abb 型的变异系数为 20.62%;且 PPO18 这 个 STS 分子标记在该群体中对 PPO 活性的决定系数 达到 66.61%; 染色体上 59 个株系扩增出了 876 bp 2A 的目标片段, 个株系扩增出了 685 bp 和 876 bp 的 46 目标片段, 个株系扩增出了 685 bp 的目标片段, 195 多重比较表明三者活性均值间差异达到极显著水平 (表 1, P<0.01)。
表 1 PPO18 在 2A 染色体上 PPO 基因等位变异间效应分析 Table 1 Analysis of the effects of Allelic variation in PPO gene on 2A chromosome using PPO18 图 4 基因型为 2Aab 型的 PPO 活性分布 Figure 4 PPO activity distribution of genotype 2Aab 表现型 Phenotype 2Aaa 2Aab 2Abb 个数 59 46 195 均值 82.01A 163.41B 233.73C 变幅 Range 变异系数(%) CV (%)

图 3 基因型为 2Abb 型的 PPO 活性分布 Figure 3 PPO activity distribution of genotype 2Abb

Number Mean

45.33 ̄175.33 32.31 100.00 ̄275.33 25.43 61.00 ̄470.67 20.62

注: PPO 活性单位为 A U/min*g, A, B 和 C 表示三种基因型 PPO 活性均值间差异达极显著(P<0.01) Note: The Unit of PPO activity is A U/min*g, A, B and C express significant differences of PPO activity mean on three genotypes (P<0.01) 图 5 基因型为 2Aaa 型的 PPO 活性分布 Figure 5 PPO activity distribution of genotype 2Aaa

3 讨论
本研究利用位于 2A 和 2D 染色体上的 PPO 基 淮麦 18 的 因分子标记 PPO18 和 STS01 对扬麦 158× 300 个 F4 分离株系分析后发现, 染色体上 PPO 基 2A 因的等位变异对籽粒的 PPO 活性有显著性效应, 在 选育低多酚氧化酶的过程中可加以辅助应用;而在 2D 染色体上的 PPO 基因在该群体中没有差异, 群体 中一致表现为低活性。Chang 等(2006)指出在 2D 染 色体上高低活性品种间 PCR 的扩增结果有差异, 高 活性品种中的第二个内含子处 TTAA” “ 重复序列丢 失,而在低活性品种中第二个内含子处存在三个 “ TTAA” 重复序列, 本研究在 2D 染色体的扩增结果

图 6 F4 分离群体中 PPO 活性 Figure 6 PPO activity distribution of F4 separating population

STS 标记在扬麦 158× 淮麦 18 F4 群体中的应用及其与 PPO 活性的关系 The Application of STS Marker in Yangmai158 × Huaimai18 F4 Separating Plant Lines and its Relations

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与其结论有差异,品种材料的来源不同可能是导致 结论有差异的主要原因,具体原因有待于进一步深 入研究讨论。根据扩增结果我们可以推测出组合亲 本在 A 位点上是有多态性差异的, D 位点上亲本 在 之间没有差异, 因此, 在该群体中控制 PPO 活性的另 一对主效基因可能在 2B 染色体或其他位点上; 此外 通过数据分析可以看出具有相同基因型条带的株系 之间 PPO 活性值差异较大,在基因型为 2Abb 型的 株系中表现尤为突出,可能是另一对主效基因或者 其他基因对 PPO 活性的影响;在群体中基因型为 2Aaa 型和 2Abb 型的比列接近 1:3, 不符合孟德尔的 独立遗传规律,原因可能是在 2A 染色体上的 PPO 基因不是完全独立遗传,而是和其它位点的等位基 因相互连锁遗传;也有可能是在选育过程中亲本在 此位点上并没有完全纯合,最终原因有待于进一步 讨论研究。

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