当前位置:首页 >> 农林牧渔 >>

RNA干扰及其在水稻抗病毒基因工程中的应用


2010, 36( 2) : 13- 17

Plant Pr otection

专 论 与 综 述 Reviews

RNA干扰及其在水稻抗病毒基因工程中的应用

摘要

文,

吴蓓蕾,



莉,
<

br />王锡锋

*

( 中国农业科学院植物保护研究所 , 植物病 虫害生物学国家重点实验室, 北京

100193)

RN A 干扰( R N A inter ference, RN A i) 是一种基因沉 默机制。RN Ai 作为新兴的基因阻断技 术具有明 显的优

势, 已被广泛应用到 动植物功能基因组和植物抗病研究中。在抗病毒研究中, 人为地 将与病毒或宿主基因同源的双 链 RN A 分子导入转基因植株, 引起与其同源的基因发生沉 默, 达 到抗病 毒的作用。 本文主 要综述 了 RN A 干 扰的 相关知识以及在水稻抗病毒基因工程研究中的应用进展。 关键词 RN A 干扰; S 332. 3 基因工程; 水稻病毒病害 A DOI: 10. 3969/ j. issn. 0529- 1542. 2010. 02. 004 中图分类号: 文献标识码:

Advances in RNA interference and its applications in genetic engineering against Rice stripe virus
He W en, Wu Beilei, L i L i, W ang X ife ng ( State Key L abora tor y for Biology o f Plant Diseases and Insect Pests, I nst itut e o f Plant Pr otectio n , Chinese Academ y of Agr icultura l Sciences, Beijing Abstract 100193, China )

RN A inter fe rence is a mechanism of g ene silencing. As a new ly deve lo ped gene silence too l, RN A i pos

sesse s distinct advanta ges and ha s been applied to plant and animal f unctiona l geno mics a nd plant disea se r esistance re sear ch. In plant antivirus r ese arch, do uble str ands RN A ho mo lo go us to virus g ene or ho st gene is tr ansf er red into pla nt to r epre ss the v ir us r eplication and r educe its da mage . T his r eview summar izes the advances in R N A in ter fer ence techniques and its applica tio ns in r ice genetic engineer ing r ese arch. Ke words y R NA interf er ence; g enetic e ng ineer ing ; r ice virus disea ses

水稻病毒病是由病毒引起的一类系统性侵染病 害, 世界上已经发现和确认的水稻病毒病( 包括类菌 原体病) 约有 16 种, 其中在我国发生的有 11 种( 包 括两种类菌原体病) , 分别是普通矮缩病、 黄叶病、 条 纹叶枯病、 黑条 矮缩病、 黄萎病、 草状矮 缩病、 簇矮 病、 锯齿叶矮缩病、 橙叶病、 东格鲁病、 瘤矮病。中国 稻区广阔, 水稻病毒病可广泛流行, 在病害严重流行 时, 曾十几个省相继发病, 暴发成灾, 仅一个省( 市、 自治区) 因病损失稻谷即数十万 t。北方粳稻产区以 水稻条纹叶枯病发生普遍。 水稻条纹叶枯病( rice str ipe disease) 是由水稻 条纹病毒( Ri ce str ip e v ir us, RSV) 引起的一种最严
收稿日期: 基金项目: * 通信作者 2009- 03- 27 修订日期: 2009- 04- 25 国家 863 项目( 2007A A 10Z415) E mail: xf w ang@ ip pcaas. cn

重的水 稻 病 毒 病 害, 是 通 过 灰 飞 虱 [ L aodel p hax st r iatel l us ( Fall n) ] 刺吸以持久性方式传播, 汁液、 土壤及种子均不能传毒。自 20 世纪 80 年代末期以 来, 该病在我国水稻种植区的发病率逐年提高, 特别 是在粳稻种植区, 发生更为普遍。据不完全统计, 全 国近年该病的发病面积已达 267 万 hm 2 以上, 病区 发病率一般在 10% ~ 20% , 重者株发病率达 50% ~ 80% , 给农民带来重大经济损失 [ 1] 。 利用水稻品种抗性被认为是防治水稻条纹叶枯 病最经济、 有效的方法。用常规方法培育抗病品种 存在育种周期长、 效率低, 抗病基因与不良性状连锁 等问题。RNA 干扰 ( RNA int erf erence, RNAi ) 技

! 14 ! 术所具有的特异性、 稳定性、 高效、 快速以及不改变 基因组的遗传组成等特性, 为基因功能的研究提供 了强有力的手段, 同时也为转基因植物抗病毒病害 增添了新的策略和方法。
[ 7]

2010 引起的共抑制, 也能诱导 dsRNA 的产生 ; 7) 病毒 或植物细胞中的 mi RN A 基因, 其前体 miRNA( pre m iRNA) 被 DCL 1 加 工为 miRNA miRN A * 双 体 ( 即为 dsRNA) 1. 2. 2
[ 8- 9]

。无论哪种途径产生的 dsRNA,

1

RNA 干扰( RNAi)
RNA 干扰( RNA interf er ence, RNAi) 是 指双

都可引发 RNAi。 RdRp 介导的补充途径 在线虫、 植物、 真菌和果蝇中还存在依赖 RNA 的 RNA 聚合酶介导的补充途径, RdRp 可能的作用 方式 有: 1) RdRP 以 siRNA 单 链 为 引 物 合 成 靶 m RNA的互补链; 2) 不需要引物直接合成异常 RNA 的互补链; 3) 在 1 条 mRNA 链上结合了 2 条或多条 siRNA 引物, 分别由 RdRP 延伸后再由 RNA 连接 酶连接成互补链; 4) dsRNA 解旋后, 2 条链均 结合 上 siRNA 引物, 分别由 RdRP 合成互补链, 新合成 的次生 dsRNA 又被 Dicer 切割成大量次生 siRNA, 从而增强了诱导基因沉默的效率 。 1. 2. 3 RNA i 的 3 种主要途径 通过大量基因抑制现象的研究, 以及生化和遗 传学上的分析表明, 基因沉默 有 3 种 不同的途 径。 这 3 种途径都包括 dsRNA 被含有 RNase III 结构 域的 Dicer 酶切割为 21~ 26 个核苷酸小分子 RNA 的过程
[ 10] [ 6]

链 RNA( double st randed RNA, dsRN A) 分子引起 的序列特异性靶基因 mRNA 降解, 从而导致内源或 外源靶基因沉默的机制。 1. 1 RNAi 的发现 尽管 RNAi 现象只是在 20 世纪 90 年代以来才 被认 识 并 逐 渐 引 起 人 们 的 注 意, 但 是 第 1 篇 与 RNAi 相 关 的 文 章 可 能 早 在 1928 年 就 已 发 表。 Wing ar d 发现由烟草环斑病毒侵染的烟草植株开 始时表现出明显的病症, 但上部叶片的症状会逐渐 变轻, 可以从病毒侵染症状中 恢复 过来, 并且新长 出的叶片可抵抗同源病毒的再次侵染, 具有了一定 的抗性。当时并没有有关 RNAi 机制的任何信息, 甚至不知道烟草环斑病毒的基因组是 RNA。不过, 这一现象说明了抗性机制的存在可以限制或阻止病 毒的再次侵染。1998 年, F ire 等人
[ 3] [ 2]

将 dsRNA 注

入线虫( Caenor habd it is el egans ) 体内后发现可抑制 序列同源基因的表达, 抑制主要作用于转录之后, 并 将此现象称为 RN A 干扰。此后, RNA 干扰现象被 证明广泛存在于真菌、 线虫、 果蝇、 植物、 高等动物等 生物中, 发现者也因此获得了 2006 年诺贝尔生理学 或医学奖。 1. 2 RNAi 的作用机制 经研究发现有多种途径可以产生 dsRNA, 主要 为: 1) 当基因组的一些随机位点被插入一段序列的 多个拷贝时, 侧翼启动子驱动转录, 转录通读可以产 生与该正义链序列互补的双链 RNA, 形成 dsRNA; 2) 对于具有末端反向重复序列的转座子, 转录通读 产生的 RNA 会自身回折 形成发夹 结构的 dsRNA ( hairpinRNA, hpRNA) [ 4- 5] ; 3) 帮助细胞识别异常 的 RN A ( aberr ant RNA ) , 并 在 RdRP ( RNA dependent RNA poly merase) 作用下, 转变 成 dsR NA
[ 6]

。目 前研究比较清楚且使用较多的 基因

沉默小分子 RNA 主要有 siRNA ( small int erf er ing RNA) 及 m iRNA( m icroRN A) 。

1. 2. 1 dsRNA 的来源

; 4) 植 物中, RNA 病 毒感 染 可 以 直 接 引 入
图1 RNA 干扰的机制( 引自诺贝尔医学奖委员会)

dsRNA [ 4- 5] ; 5) 外源基因以反向重复的形式插入基 因组后可转录产生 hpRNA; 6) 正义 RNA 大量表达

36 卷第 2 期

何文等 : RN A 干扰及其在水稻抗病毒基因工程中的应用

! 15 !

1. 2. 3. 1

转录后基因沉默( post transcript ional gene silencing, PT GS)

上, 对靶基因进行转录后的负调控, 而靶 mRN A 并 不发生 变化, 所以 属于 一种 翻译 水平 上的 抑制 效 应 [ 25- 26] 。miRNA 和 siRNA 相同, 除了都 由 Dicer 酶加工成熟之外, RNAi 必 需的 Argo naute ( alg 1、 alg 2) 家族基因也是这两种 RNA 行使 生物功能所 必需的。在 RNAi 过程中形成的 RISC 复合物既含 有 siRNA 又含有 miRNA, 此复合物可 根据不同情 况产生不同效应, 若 siRNA 与靶序列不能严格配对 ( 如有单个碱基错配) , 则 PT GS 无法进行, 此时复合 物转而利用 miRNA 抑制核糖体在 m RNA 上 延伸 从而在翻译水平阻断基因表达 [ 27] 。

PT GS 是最普遍的一种沉默机制。此机制主要 由 siRNA 介导[ 11] 。病毒侵染的植物细胞中的 dsR NA 可能是单链 RNA 病毒的复制中间产物或是其 二级结构形态。至于植物 DN A 病毒, 其 dsRNA 可 能是具有重叠互补序列的转录物经由退火形成的。 在胞质中的 Dicer 酶或其类似物( Dicer like, DCL ) 的作用下把长链 dsRNA 切割成 siRNA, 其具 5 ?端 磷酸和 3 ?端羟基, 此外每条单链的 3 ?端均有 2~ 3 个 突出的非配对的碱基
[ 12- 13]

。由 siRNA 中的反义链

指导形成一种核蛋白体, 即 RNA 诱导的沉 默复合 体( RNA induced silencing complex , RISC ) , 然 后 siRNA 作为引导序列, 按照碱基互补配对原则识别 靶基 因转 录的 mRNA, 并 引导 RISC 复 合 体结 合 mRNA; 接着 siRNA 与 mRNA 在复合体中换位, 内 切核酸酶将 mRNA 切割成 21~ 23 nt 的片段, 特异 性地抑制靶基因的 表达; 另一 方面, 释 放的 siRNA 可结合在靶 mRNA 上 作为引物, 在 RdRp ( RNA dependent RNA Po lymerase ) 的作 用 下 合成 dsR NA , 合成的新的 dsRNA 又可以发生 RNAi 现象, 特 异地降解靶 mRNA 1. 2. 3. 2
[ 14- 16]

2

RNAi 技术在植物抗病毒研究中的应用
RNAi 技术目前已经广泛应用于植物病毒的防

治上。1998 年, 首次报道了 RNAi 技术在防治马铃 薯 Y 病毒病上的应用, Wat erhouse 等人利用马铃薯 Y 病毒( PVY ) 蛋白酶基因片段构建 IRS( inv er ted r epeat sequence) 载体 进行烟 草转 化, 使植 株完 全 免疫[ 28] 。 dsRNA 为 RNAi 的诱导起 始物。生物体 由于 病毒入侵、 转座子转录、 基因组中反向重复序列转录 以及外源基因导入等原因都可能产生 dsRNA 分子。 dsRNA 的产生有化学合成法、 体外转录法和转录载 体体内 转 录 法。 现 在普 遍 采 用 转 录 载 体 体 内 转 录法。 2. 1 2. 1. 1 RNAi 表达载体的构建 靶基因序列的选择 构建高效的 RNAi 表达载体是应用 RNA i 技术 的关键。其 中导 入的 dsRNA 具 有特 异性 是利 用 RNAi 的前提, 在保证不影响其他功能的前提 下降 解病毒基因组。这种特异性是由 dsRNA 与目的基 因的同源序列决定的, 所以如果在植物体内还有另 外的基因与 RNAi 作用的基因有同源性, 这个基因 必定也会受到 RNAi 的影响。另外, 对于 RNAi 的 作用位点要经过精心选择。位点选择不当还常常会 导致脱靶效应( of f t arg et ef fect ) 。由 于 siRNAs 和 靶 mRNA 可以有一定的错配和间隙, 因此 siRNAs 可能在一个基因 组中作用于上百 个潜在的目 标序 列
[ 29]

, 从而产生级联放大反应。

转录水平的基因沉默( transcript ional gene silencing, T GS)

T GS 机制是通过改 变靶基因染色质的 结构来 实现的。许多研究表明, 发生 T GS 的主要原因是启 动子序列的 碱基尤其 是胞嘧 啶的甲 基化。siRNA 通过 碱 基配 对 原理, 指 导 DNA 甲 基化 酶 结合 到 DNA 的特异部位, 引发该部位 DNA 中胞嘧啶的甲 基化 ( RNA direct ed DNA met hy latio n, RdDM ) 及 组蛋白 H 3 赖氨酸 9 的甲基化
[ 17- 21]

, 使靶启动子失

去功能, 导致下游基因转录沉默。另外, DNA 甲基 化可以阻止转座酶的生成, 从而抑制转座子的移动, 保持遗传稳定, 防止遗传损害 1. 2. 3. 3
[ 22]



翻译水平的基因沉默

这种机制主要是由内源的 m iRNA 介导的基因 沉默。miRNA 是由长度约 70nt 的 RNA 形成的茎 环样前体, 经 Dicer 酶作用后形成长约 21~ 25 nt 的 单链 RNA, 大多数 miRNA 与底物 m RNA 不完全 配对结合, 它们并 不改变 miRNA 的稳定性
[ 23- 24]

。现在已 经发展出若干种算法和软件帮 助选
[ 30]



择特异的 siRNA 靶序列

, 运用科学并相对 先进

这种抑制方式最终也通过形成 RISC 发挥作用, 结 合在相应 的 mRN A 的 3?末端 非翻译 区( 3? U T R)

的技术可以帮助尽量避免脱靶效应的产生。目前, RNAi 技术在植物抗病毒 研究中, 主要从两方 面来

! 16 ! 设计 RNAi 作用的靶位点: 1) 以病毒基因组序列为 靶位点设计 dsRNA, 来起到抑制的作用; 2) 以宿主 植物的基因组序列为靶位点设计 dsRNA, 来起到抑 制的作用。前一种方法目前研究和应用的比较多, 它是将植物病毒基因组的一部分片段作为 RNAi 作 用的靶位 点来设计 dsRNA, 从而 达到 抗病毒 的目 的。Shuichiro
[ 31]

2010 最广泛 的抗 病毒 手段。H ayakaw a 等 等
[ 38- 39] [ 37]

和 燕义 唐

将条纹叶枯病毒的 cp 基因分别导入到粳稻

和籼稻中, 发现表达外壳蛋白基因的转基因水稻植 株对 RSV 的侵染起到 一定的抗性。研究表明, 当 RSV 侵染水稻后, 伴随着病症的加剧, 植物细胞内 病毒的外壳蛋白 CP 和病害特异性蛋白 SP 发生积 累, 而其他病毒蛋白的积累并不明显, 因此推测这两 种蛋白都是致病相关蛋白
[ 40]

等人分别以马铃薯 X 病毒( Pot at o

vi rus X , PVX) 的外壳蛋白基因和 T GBp1 基因( 这 个基因编码 RNA 沉默抑制因子) 为靶位点来设计 siRNA, 他们分别选取了这两个基因的部分片段设 计成可产生发夹结构的反向重复序列, 结果表明这 两种 siRNA 都能干扰 PVX 的侵染。后一种方法研 究和应用的比较少, 因为它需要在对宿主植物某些 基因功能了解比较清楚的前提下进行。 2. 1. 2 dsRNA 表达结构 对于 dsRNA 表达结构, 人们多 采用基因 片段 反向连接成反向重复序列的方法, 可使表达的单链 RNA 自我配对形成发夹结构 RNA ( hpRNA) , 发夹 茎部形成稳定的 dsRNA 可诱导同源的内源基因沉 默。通常在片段之间需存在一段间隔区, 以便使载 体结构更加稳定。而用正义方向连接的内含子序列 替代 hpRNA 间隔区, 形成带有内含子结构的 ihpR NA ( int ron splicing hpRNA) 载体, 其沉默效率可达 到 90% 以上
[ 32]

。刘利华等

[ 41]

应用免

疫胶体金电镜技术发现病毒的 CP 和 SP 在寄主组 织细胞中的叶绿体和细胞质中都有存在, 线粒体中 没有, 而细胞核中只有 CP 分布, 这表明 CP 极有可 能是病害的致病相关蛋白, 甚至致病性方面比 SP 更 为重要; 并且还发现在叶肉组织细胞壁的胞间连丝 中存在 CP, 据此推测 CP 也可 能与病毒 的运输 有 关。因此, 目前在利用 RNAi 技术抗水稻条纹叶枯 病毒中经常选取病毒的 cp 基因作为靶位点。代玉 华等
[ 42]

以水稻条纹叶枯病毒的 cp 基因为靶标, 通

过将载体 pM CG161 和载体 pCAM BIA1301 双酶切 和连接, 构建了一个具有 CaM V 35S 启动子并且在 正反义链中间含有一个水稻内含子适于水稻农杆菌 转化的高表达 RNAi 载体。张恭 等[ 43] 利用已 公布 的水稻条纹叶枯病毒的序列和 siRNA T arg et Find er 软件, 获得了 168 条 siRNA 片段, 利用这些片段 在水稻基因组中 BL AST , 最终获得 6 条与水稻基因 组完全不匹配的干扰序列。选择其中的 2 条, 通过 化学合成干扰序列, 利用 pCAM BIA1301 质粒构建 了 2 个 RNA 干扰载体。这些研究为探索利用 RNA 干扰技术防治水稻条纹叶枯病奠定了基础。

。Wesley 等

[ 33]

对此进行了深入的比

较研究, 其结果表明长度为 98~ 853 bp 的靶基因反 向重复片段能够高效地导致沉默, 其转化体沉默效 率可达 66% ~ 100% ( 平均 90% ) 。另外启动子强弱 对于外源基因的表达水平也有很重要的影响, 在构 建准备转化禾本科植物( 如水稻) 的表达载体时, 可 用 Ubiquit in 启动子等, 以获得较高的干扰程度[ 34] 。 2. 2 RNAi 技术在抗水稻条纹叶枯病毒中的应用 利用 RNAi 技术赋予植物体病毒抗性具有高度 可行性, 目前已有通过 RNAi 技术获得抗性的报道。 如 Pinto 等[ 35] 将南方菜豆花叶病毒属的水稻黄斑驳 病毒( Ri ce y el low mott l e vi rus , RYM V) 复制所需 酶的部分基因通过构建载体而转化水稻, 诱发基因 沉默, 从而使植物具有对 RYM V 的抗性, 并且这种 抗性能稳定遗传 3 代。马中良等
[ 36]

3

结语
RNAi 技术已经高效地应用于能够沉默特定植

物基 因的 分 子 植 物育 种, 并 被 Science 杂 志 评 为 2001、 2002 年度自然科学十大突破之一 [ 44] , 为目前 分子生物学和遗传学研究热点。正如诺贝尔生理学 或医学奖评奖委员会主席戈兰 ! 汉松说: 我们为一 种基本机制的发现颁奖。这种机制已被全世界的发 明家证 明是 正确的, 是 给它 发个 诺贝 尔奖 的时 候 了。RNAi 技术发展迅速, 以上的研究也说明 RNA i 技术在应用 于抗水稻病毒 研究中的 巨大潜力。但 RNAi 也有其自身的不足之处。研究证实即使是有 一个碱基的突变, 也会对干扰的效果产生巨大的影 响 [ 45] 。siRNA 的脱靶效应也是进行 RNAi 试 验时

根据抗 水稻矮

缩病毒( R ice d w ar f v ir us, RDV) 序列, 构建了与其 相关的 RNA 干扰序列, 导入水稻中, 发现对水稻矮 缩病毒有很高的抗性。 转病毒外壳蛋白 cp 基因策略是研究最早、 应用

36 卷第 2 期

何文等 : RN A 干扰及其在水稻抗病毒基因工程中的应用
[ 46- 47]

! 17 !

需要注意的一个问题

。并且对于 RSV 的各基

t in nucl eat ion by t he st ress act ivat ed A TF/ CR EB f ami ly pro t ein s[ J] . Sci ence, 2004, 304( 25) : 1971- 1976. [ 17] W as senegger M , H eimes S, Riedel L, et al . RN A direct ed de n ovo m et hylat ion of genomic s equences in plant s [ J ] . Cell 1994, 76: 567- 576. [ 18] M et t e M F, A uf satz W, van der Winden J, et al . Tr ans crip t ional silencing an d prom ot er m et hylat ion t riggered by dou ble s t randed R N A [ J] . EM BO J , 2000, 19: 5194- 5201. [ 19] J on es L, Rat clif f F, Baul combe D C. R N A direct ed tr ans crip

因产物的功能及其在致病性中的作用等方面的研究 还很少。尽管仍有一些问题亟待研究, 但随着分子 生物学方法和技术的发展, 可以预见上述问题必将 一一得到解决, 有理由相信利用 RNAi 技术将在水 稻病毒基因功能研究和水稻抗病品种的培育方面发 挥重要作用。

参考文献
[ 1] 吴书俊, 钟环, 左慧, 等. 水稻抗条 纹叶枯病 的遗传与 育种研究 进展[ J] . 中国农学通报, 2007, 23( 1) : 244- 248. [ 2] W ingard S A . H ost s and sympt oms of ring spot , a viru s dis eas e of plant s[ J] . A gric Res, 1928, 37: 127- 153. [ 3] Fire A , X u S, M ont gom ery M K , et al . Potent and s pecif ic genet ic int erf erence by doub le st randed RN A in Caenorhabd it is e le gans[ J] . N at ur e, 1998, 391: 806- 811. [ 4] 彭昊, 王志兴, 窦道龙, 等. 由根 癌农杆菌介导将 葡萄糖氧化酶 基因转入水稻[ J] . 农业生物技术学报, 2003, 11( 1) : 16- 19. [ 5] Plast erk R H. RN A silencing: t he genomes immune system[ J ] . Science, 2002, 296( 5571) : 1263- 1265. [ 6] H ut vagner G , Zamore P D. R N A i: nat ure ab hors a double s t rand[ J ] . Cur r O pin G enet D ev, 2002, 12: 225- 232. [ 7] Beclin C, Bou t et S, Wat erh ou se P, et al. A branched pat hw ay f or transg ene indu ces R N A sil encin g in plan ts [ J] . Curr Biol, 2002, 12( 8) : 684- 688. [ 8] Li J, Y an g Z, Y u B, et al. M et hyl at ion prot ect s miR N A s and s iRN A s f rom a 3# end uridylat ion act ivi ty in Ar abi d op sis [ J] . Cu rr Biol, 2005, 15( 16) : 1501- 1507. [ 9] Park M Y, Wu G , G onzalez Suls er A , et al. N u clear process ing and export of mi croRN A in Ar abi d op sis [ J ] . Pr oc N at l A cad Sci U S A , 2005, 102( 10) : 3691- 3696. [ 10] Baulcombe D . RN A sil encing in plant s [ J ] . N at ure, 2004, 431: 356- 363. [ 11] H amil t on A J, Baulcom be D C. A species of sm all ant isen se RN A in post t ranscript ion al gen e s ilen cing in plant s [ J] . Sci ence, 1999, 286: 950- 952. [ 12] Zamore O D . R NA interf erence: listening t o sound of silence[ J] . Nat St ruct Biol, 2001, 8( 9) : 749. [ 13] H arbort h J, Elbashir S M , Becheft K , et al. Ident if icat ion of ess ent ial gen es in cult ur ed mammalian cells u sing sm all int er f ering R N A s[ J ] . J Cell Science, 2001, 114( 24) : 4557. [ 14] Zamore P D, T uschl T , S harp P A , et al . R N A i: double st ran ded RN A direct s t h e A T P dependent cl eavage of mRN A at 21 t o 23 nucleot ide int erval s[ J] . Cell , 2000, 101: 25- 33. [ 15] Winst on W M, M olodow it ch C, Craig P H. Syst emic R N Ai in C. elegans requires the put at ive t ransmembrane prot ein SID 1 [ J ] . Science, 2002, 295( 5564) : 2456- 2459. [ 16] Jia S, N om a K , G rew al S I. R N A i i ndependen t heteroch rom a [ 27 ]

t ional gene sil encing in plant s can be inherit ed ind ependent ly of t h e RN A t rigger an d requires M et1 f or maint enance[ J ] . Curr Biol, 2001, 11( 10) : 747- 757. [ 20] V erdel A , Songt ao J, G erber S, et al. R N A i m ediat ed t arge t ing of het erochromat in by th e R1 TS com plex [ J ] . S cien ce, 2004, 303( 30) : 672- 676. [ 21 ] Burat ow ski S, M oazed D. G en e regu lat ion: expression and s ilen cing coupled[ J] . N at ure, 2005, 435: 1174- 1175. [ 22] Zeng Y , Wagner E J, Cull en B R . Bot h nat ural and des igned m icro R N A s can inh ibit t he ex pres sion of cognat e mR N A s w h en ex pres sed in human cel ls [ J] . M ol Cel l, 2002, 9 ( 6) : 1327- 1333. [ 23] V olpe T A , K idn er C, H all I M , et al. Regulat ion of het ero chromat ic s ilen cing and hist one H 3 lysin e 9 met hylati on by R N A i[ J] . Science, 2002, 297( 5588) : 1833- 1837. [ 24] D enli A M , T ops B B, Plast erk R H, et al. Processing of pri mary microR N A s by t h e microprocess or com plex [ J] . N atu re, 2004, 432 ( 7014) : 231- 235. [ 25] Bart el D P. M icroR N A s: genomi cs, b iog enesis, mechan ism, and fun ct ion[ J] . Cell , 2004, 116( 2) : 281- 297. [ 26] Bernst ein E, Caudy A A, Hammond S M , et al. Role f or a biden t at e ribonuclease in t he init iat ion step of RN A int erf erence[ J ] . N at ure, 2001, 409 ( 6818) : 363- 366. Hannon G J. RN A int erferen ce [ J ] . N at ure, 2002, 418 ( 6894) : 244- 251. [ 28] W at erhouse P M , Graham M W , Wang M B. V irus resi st ance and gen e sil encin g in pl ant s can be induced by simu lt aneous expression of sense and ant is ens e R N A [ J] . Proc N at l A cad Sci U SA , 1998, 95( 23) : 13959- 13964. [ 29] M a Y , Creanga A , L um L, et al . Prevalence of off t arget eff ect s in D rosop hi l a R N A int erferen ce screen s [ J ] . N atu re, 2006, 443( 7109) : 359- 363. [ 30] Boese Q , Leak e D , Reynolds A , et al. M echanist ic insight s aid comput at ional s hort int erfering R N A design[ J] . M et hods Enz ymol, 2005, 392: 73- 96. [ 31] Takahas hi S, K omat su K , K akizawa S, et al. T he ef ficiency of in terf erence of P otat o v ir us X in fect ion depends on t he t arget gene[ J] . V iru s Research , 2006, 116: 214- 217. [ 32] Smit h N A , Singh S P, W ang M B. Tot al silencing by intron spliced hairpin RN As[ J] . N at ure, 2000, 407( 6802) : 319- 320. ( 下转 24 页)

! 24 !
r espon se t o t hermal s tr ess [ J] . Ins ect M ol Biol, 2007, 16: 491 - 500. [ 43] H uang L H , W ang H S, K ang L. D iff er ent evol ut ionary linea ges of large and small heat shock prot ein s in eukaryot es [ J] . C ell R esearch, 2008, 18: 1074- 1076. [ 44] K ang L, Ch en B, W ei J N , et al. Rol es of t hermal adapt at ion and chemical ecology in L i ri omy za dist ribut ion and cont rol[ J] . A n nual R ev Ent omol, 2009, 54: 127- 145. [ 45] H uang L H, Wang C Z, K ang L. Cloning and expressi on of f ive heat shock protein gen es in r elat ion t o cold hardenin g and devel opm ent in th e l eafm iner, L ir i omyz a sati v a [ J] . J In sect Phys iol, 2009, 55: 279- 285. [ 46] 王宗舜. 昆虫滞育 育激素调 节[ J ] . 昆虫知 识, 1985, 22( 4) : 181 - 183. [ 47] 李学荣. 昆虫人工诱导滞育及其利用的研究进展[ J ] . 森林病虫 通讯, 1998, 31( 6) : 50- 55. [ 48] 张珺, 吴孔明, 林克剑, 等. 二化螟温带和亚热带地理种群的滞育特 征与抗寒性差异[ J] . 中国农业科学, 2005, 38( 12) : 2451- 2456. [ 49] Gkouvit sas T , K ont ogiannat os D, K ourt i A . Diff erential expres sion of tw o small H sps during diapauses in the corn st alk borer S eaamia nonag rioides ( Lef. ) [ J] . J Insect Physiol, 2008, 54: 1503 - 1510.

2010
[ 50] 陈 利珍, 梁革梅, 吴 孔明, 等. 蛋白质 组学技术的发 展及其在昆 虫中的应用[ J] . 昆虫学报, 2008, 51( 8) : 868- 875. [ 51] Li A Q , Popova B A , Dean D H , et al. Pr ot eomics of t h e f lesh f ly brai n reveals an abun dance of upregulat ed h eat shock pro t ein s during pupal diapau se[ J ] . J Ins ect Phy siol, 2007, 53( 4) : 385- 391. [ 52] Li A , M ichaud M R , Den linger D L, et al. R apid elevat ion of Inos and decreas es in ab undan ce of ot her p rot eins at pupal dia pause t erminati on in t he fl esh f ly S arc op hag a c rassip al p is [ J] . Bioch imica et Biophysica A ct a ( BBA ) t eomi cs, 2009, 1794( 4) : 663- 668. [ 53] 吴孔明, 郭予元, 韦建 福, 等. 棉铃 虫抗寒能力 的研究 [ J] . 生态 学报, 1997, 17( 3) : 298- 302. [ 54] Li Y P, G ot o M , It o S, et al. Physiology of diapaus e and cold hardiness i n th e overw int ering pupae of t h e f all w ebw orm H y ph antr ia cunea ( Lepidopt era: A rct iidae) in Japan [ J ] . J Ins ect Physiol, 2001, 47: 1181- 1187. [ 55] 鞠珍. 美国白蛾 在不同 树种上 的生 物学 特性及 抗寒 性的 研究 [ D ] . 泰安: 山东农业大学, 2007. [ 56] 韩瑞东. 赤松毛虫抗寒性及其机理研究[ D ] . 泰安: 山东农业大 学, 2002. [ 57] 郭予元. 棉铃虫的研究[ M ] . 北京: 中国农业出版社, 1998. Prot eins & Pro

( 上接 17 页) [ 33] Wesley S V , H el liw ell C A , Smit h N A , et al. Const ruct design f or ef ficient , eff ect ive and high t hrough put gene sil en cing in pl ant s[ J] . Plant J, 2001, 27( 6) : 581- 590. [ 34] Chuang C F, M eyerowit z E M . Specific and heritable genetic int er f erence by double st randed RN A in A rabid opsi s t hal iana [ J ] . PN AS, 2000, 97( 9) : 4985- 4990. [ 35] Pint o Y M , K ok R A , Bandcombe D C. R esis tance to Ri ce ye ll ow mott l e v i rus ( RY M V ) incult ivat ed A f rican ri ce varieti es cont aini ng R Y M V t ransgenes [ J ] . N atu re Bi ot echnol ogy, 1999, 17( 7) : 702- 707. [ 36] 马 中良, 杨怀义, 王 荣, 等. 利用转 h pRN A 基因 水稻抗水稻矮 缩病毒[ J ] . 植物学报, 2004, 46( 3) : 332- 336. [ 37] H ayakaw a T, Zhu Y , It oh K , et al. Genet ically engineered rice resist ant to Ri ce st rip e v irus , an insect t ransmitt ed virus [ J ] . 异性蛋白在寄主体内的积累[ J] . 福建农业大 学学报, 1998, 27 ( 3) : 322- 326. [ 41] 刘利华. 三种水稻病毒病的 细胞病 理学[ D] . 福 州: 福 建农林 大学, 1999. [ 42] 代玉华, 王锡锋, 李莉, 等. 一 种适合水 稻农杆菌 转化的 RN A i 载体的构建和潮霉素对水稻转化的影响[ J] . 植物保护, 2007, 33( 2) : 37- 40. [ 43] 张恭, 刘立峰, 周维, 等. 水稻 条纹叶枯 病毒 R N A 干扰 载体的 构建[ J] . 华北农学报, 2008, 23( 4) : 10- 13. [ 44] 江舸, 金由辛. 微 R N A ? Sci ence 杂志 2002 年十大 科技突破第 一名[ J] . 生命的化学, 2003, 23( 1) : 1- 3. [ 45] D u Q , Th on berg H , Wang J, et al . A syst emat ic analysis of t he silencing ef f ect s of an act ive siR N A at all singl e nucl eot ide m ismat ched t arget sit es [ J] . N u clei c A cids R es , 2005, 33( 5) : 1671- 1677. [ 46] Saxena S, Jons son Z O, D utt a A . Sm all R N A s wit h imperf ect m at ch t o endogen ou s mRN A r epress t ranslat ion. Implicat ions f or of f t arget act ivit y of small inhib it ory RN A in m amm alian cell s[ J] . J Bi ol Ch em, 2003, 278( 45) : 44312- 44319. [ 47] M a H T, O n K F, T sang Y H , et al. An inducible sys t em for expression an d val idat ion of t he specif icit y of s hort hairpin R N A i n mamm alian cells [ J ] . N ucl eic A cids R es, 2007, 35 ( 4) : e22.

Proc N at l Acad Sci U SA , 1992, 89: 9865- 9869. [ 38] 燕义唐, 王晋芳, 邱并生, 等. 水 稻条纹叶枯病毒 外壳蛋白基因 在工程水 稻植株 中的表 达[ J] . 植物 学报, 1992, 34( 12) : 899 - 906. [ 39] Y an Y T , W ang J F, Q iu B S, et al. R es ist an ce t o Ri ce st ri pe v ir us conf err ed by expression of coat prot ein in t ran sgen ic indi ca rice plan ts regenerat ed f rom b om bard ed su spen sion cul t ure [ J] . V i rol ogica Sin ica, 1997, 12 ( 3) : 260- 269. [ 40] 林奇田, 林含新, 吴祖建, 等. 水 稻条纹病毒外壳 蛋白和病害特


相关文章:
基因工程及其应用专题练习
这个过程中利用 主要原理是 A.基因突变,DNA→RNA→蛋白质 C.基因工程,DNA...(4)烟草具有了抗病毒能力,这表明烟草体内产生了___,由此可见, 烟草和人体合成...
RNA干扰及其应用
RNA干扰及其应用_生物学_自然科学_专业资料。RNAi ...病毒感染 细胞所需的 CD4 受体,还是针对病毒基因组...有报道称,一种全新生物工程药品“RNA 干扰剂”(非...
RNA干扰应用研究进展
在水稻和拟南芥的基因组测序完成后,人们 获得了众多的候选基因,RNAi 为注释和...3.2 植物抗病毒研究中的应用利用 RNA 干扰技术的原理可设计合成与病毒同源的 ...
基因工程的应用
培育能固氮的水稻新品种,其在环保上的重要意义是( ...创新应用训练 1. (14 分)将人的抗病毒干扰基因“...RNA 反转录 D、免疫学方法 8、能够使植物体表达...
植物抗病毒基因工程研究进展
RNA沉默机制及其介导植物... 9页 免费 植物抗病毒基因工程育种策... 9页...CP 干扰病毒 RNA 复制,当入侵 病毒的裸露核酸进入植物细胞后,它们立即被植物...
基因工程及其在食品工业中的应用
基因工程及其在食品工业中的应用_环境科学/食品科学_...抗病毒、抗枯萎等性能 的作物,提高生存能力;培育不...院的转基因棉花一抗虫棉, 中国水稻所的转基因杂交...
跟踪练习 6-2 基因工程及其应用_图文
RNA 聚合酶 9. 利用基因工程技术可使大肠杆菌合...超级水稻 ②我国科学家将苏云金杆菌某些基因移植...的抗病毒干扰基因“嫁接” 到烟草的 DNA 分子上,...
基因工程在医药工业中的的应用
本文首先回顾了基因工程的发展简史,然后在基因工程制药,抗病毒疫苗,疾病治疗基因 诊病等方面综述了基因工程在医学中的应用基因工程将给医药方面带来更美好前景...
RNA干扰的研究进展
RNA干扰技术及其应用 4页 2财富值 RNA干扰技术 61...进化上高度保守的,能抵御外源基因或外来 摘要:病毒...[4] 乐宁,罗荡平,段承杰.水稻 Os NPR1 基因 ...
基因工程的应用第二课时导学案
⑵成果: 抗虫棉 、 抗虫水稻 、 抗虫马铃薯 等。...⑵抗病基因种类 ①抗病毒基因:病毒 外壳蛋白 基因和...基因突变,DNA→RNA→蛋白质 B.基因工程,DNA→tRNA...
更多相关标签:
rna干扰 | rna干扰技术 | 小干扰rna | rna干扰技术原理 | rna干扰原理 | rna干扰机制 | rna干扰的原理 | rna干扰载体构建 |