当前位置:首页 >> 农林牧渔 >>

RNA干扰及其在水稻抗病毒基因工程中的应用


2010, 36( 2) : 13- 17

Plant Pr otection

专 论 与 综 述 Reviews

RNA 干扰及其在水稻抗病毒基因工程中的应用

摘要

文,

吴蓓蕾,



莉,

王锡锋

*

( 中国农业科学院植物保护研究所 , 植物病 虫害生物学国家重点实验室 , 北京

100193)

RN A 干扰 ( R N A inter ference, RN A i) 是一种基因沉 默机制 。 RN Ai 作为新兴的基因阻断技 术具有明 显的优

势 , 已被广泛应用到 动植物功能基因组和植物抗病研究中 。 在抗病毒研究中 , 人为地 将与病毒或宿主基因同源的双 链 RN A 分子导入转基因植株 , 引起与其同源的基因发生沉 默 , 达 到抗病 毒的作用 。 本文主 要综述 了 RN A 干 扰的 相关知识以及在水稻抗病毒基因工程研究中的应用进展 。 关键词 RN A 干扰 ; S 332. 3 基因工程 ; 水稻病毒病害 A DOI: 10. 3969/ j. issn. 0529- 1542. 2010. 02. 004 中图分类号 : 文献标识码 :

Advances in RNA interference and its applications in genetic engineering against Rice stripe virus
He W en, Wu Beilei, L i L i, W ang X ife ng ( State Key L abora tor y for Biology o f Plant Diseases and Insect Pests, I nst itut e o f Plant Pr otectio n , Chinese Academ y of Agr icultura l Sciences, Beijing Abstract 100193, China )

RN A inter fe rence is a mechanism of g ene silencing. As a new ly deve lo ped gene silence too l, RN A i pos

sesse s distinct advanta ges and ha s been applied to plant and animal f unctiona l geno mics a nd plant disea se r esistance re sear ch. In plant antivirus r ese arch, do uble str ands RN A ho mo lo go us to virus g ene or ho st gene is tr ansf er red into pla nt to r epre ss the v ir us r eplication and r educe its da mage . T his r eview summar izes the advances in R N A in ter fer ence techniques and its applica tio ns in r ice genetic engineer ing r ese arch. Ke y words R NA interf er ence; g enetic e ng ineer ing ; r ice virus disea ses

水稻病毒病是由病毒引起的一类系统性侵染病 害, 世界上已经发现和确认的水稻病毒病( 包括类菌 原体病) 约有 16 种, 其中在我国发生的有 11 种 ( 包 括两种类菌原体病) , 分别是普通矮缩病、 黄叶病、 条 纹叶枯病、 黑条 矮缩病、 黄萎病、 草状矮 缩病、 簇矮 病、 锯齿叶矮缩病、 橙叶病、 东格鲁病、 瘤矮病。中国 稻区广阔, 水稻病毒病可广泛流行, 在病害严重流行 时, 曾十几个省相继发病, 暴发成灾, 仅一个省 ( 市、 自治区 ) 因病损失稻谷即数十万 t。北方粳稻产区以 水稻条纹叶枯病发生普遍。 水稻条纹叶枯病 ( rice str ipe disease) 是由水稻 条纹病毒( Ri ce str ip e v ir us, RSV) 引起的一种最严
收稿日期 : 基金项目 : * 通信作者 2009- 03- 27 修订日期 : 2009- 04- 25 国家 863 项目 ( 2007A A 10Z415) E mail: xf w ang@ ip pcaas. cn

重的水 稻 病 毒 病 害, 是 通 过 灰 飞 虱 [ L aodel p hax st r iatel l us ( Fall n) ] 刺吸以持久性方式传播, 汁液、 土壤及种子均不能传毒。自 20 世纪 80 年代末期以 来 , 该病在我国水稻种植区的发病率逐年提高 , 特别 是在粳稻种植区 , 发生更为普遍。据不完全统计, 全 国近年该病的发病面积已达 267 万 hm 2 以上, 病区 发病率一般在 10% ~ 20% , 重者株发病率达 50% ~ 80% , 给农民带来重大经济损失 [ 1] 。 利用水稻品种抗性被认为是防治水稻条纹叶枯 病最经济、 有效的方法。用常规方法培育抗病品种 存在育种周期长、 效率低, 抗病基因与不良性状连锁 等问题。 RNA 干扰 ( RNA int erf erence, RNAi ) 技

! 14 ! 术所具有的特异性、 稳定性、 高效、 快速以及不改变 基因组的遗传组成等特性 , 为基因功能的研究提供 了强有力的手段, 同时也为转基因植物抗病毒病害 增添了新的策略和方法。
[ 7]

2010 引起的共抑制, 也能诱导 dsRNA 的产生 ; 7) 病毒 或植物细胞中的 mi RN A 基因, 其前体 miRNA( pre m iRNA) 被 DCL 1 加 工为 miRNA miRN A * 双 体 ( 即为 dsRNA) 1 . 2. 2
[ 8- 9]

。无论哪种途径产生的 dsRNA,

1

RNA 干扰( RNAi)
RNA 干扰 ( RNA interf er ence, RNAi) 是 指双

都可引发 RNAi。 RdRp 介导的补充途径 在线虫、 植物、 真菌和果蝇中还存在依赖 RNA 的 RNA 聚合酶介导的补充途径 , RdRp 可能的作用 方式 有 : 1) RdRP 以 siRNA 单 链 为 引 物 合 成 靶 m RNA 的互补链; 2) 不需要引物直接合成异常 RNA 的互补链; 3) 在 1 条 mRNA 链上结合了 2 条或多条 siRNA 引物, 分别由 RdRP 延伸后再由 RNA 连接 酶连接成互补链; 4) dsRNA 解旋后 , 2 条链均 结合 上 siRNA 引物 , 分别由 RdRP 合成互补链 , 新合成 的次生 dsRNA 又被 Dicer 切割成大量次生 siRNA, 从而增强了诱导基因沉默的效率 。 1 . 2. 3 RNA i 的 3 种主要途径 通过大量基因抑制现象的研究, 以及生化和遗 传学上的分析表明 , 基因沉默 有 3 种 不同的途 径。 这 3 种途径都包括 dsRNA 被含有 RNase III 结构 域的 Dicer 酶切割为 21~ 26 个核苷酸小分子 RNA 的过程
[ 10] [ 6]

链 RNA( double st randed RNA, dsRN A) 分子引起 的序列特异性靶基因 mRNA 降解 , 从而导致内源或 外源靶基因沉默的机制。 1. 1 RNAi 的发现 尽管 RNAi 现象只是在 20 世纪 90 年代以来才 被认 识 并 逐 渐 引 起 人 们 的 注 意 , 但 是 第 1 篇 与 RNAi 相 关 的 文 章 可 能 早 在 1928 年 就 已 发 表。 Wing ar d 发现由烟草环斑病毒侵染的烟草植株开 始时表现出明显的病症 , 但上部叶片的症状会逐渐 变轻, 可以从病毒侵染症状中 恢复 过来, 并且新长 出的叶片可抵抗同源病毒的再次侵染, 具有了一定 的抗性。当时并没有有关 RNAi 机制的任何信息, 甚至不知道烟草环斑病毒的基因组是 RNA 。不过, 这一现象说明了抗性机制的存在可以限制或阻止病 毒的再次侵染。 1998 年, F ire 等人
[ 3] [ 2]

将 dsRNA 注

入线虫( Caenor habd it is el egans ) 体内后发现可抑制 序列同源基因的表达 , 抑制主要作用于转录之后, 并 将此现象称为 RN A 干扰。此后, RNA 干扰现象被 证明广泛存在于真菌、 线虫、 果蝇、 植物、 高等动物等 生物中 , 发现者也因此获得了 2006 年诺贝尔生理学 或医学奖。 1. 2 RNAi 的作用机制 经研究发现有多种途径可以产生 dsRNA, 主要 为: 1) 当基因组的一些随机位点被插入一段序列的 多个拷贝时 , 侧翼启动子驱动转录, 转录通读可以产 生与该正义链序列互补的双链 RNA, 形成 dsRNA; 2) 对于具有末端反向重复序列的转座子, 转录通读 产生的 RNA 会自身回折 形成发夹 结构的 dsRNA ( hairpinRNA, hpRNA) [ 4- 5] ; 3) 帮助细胞识别异常 的 RN A ( aberr ant RNA ) , 并 在 RdRP ( RNA dependent RNA poly merase) 作用下 , 转变 成 dsR NA
[ 6]

。目 前研究比较清楚且使用较多的 基因

沉默小分子 RNA 主要有 siRNA ( small int erf er ing RNA) 及 m iRNA( m icroRN A) 。

1. 2. 1 dsRNA 的来源

; 4) 植 物中 , RNA 病 毒感 染 可 以 直 接 引 入
图1 RNA 干扰的机制 ( 引自诺贝尔医学奖委员会 )

dsRNA [ 4- 5] ; 5) 外源基因以反向重复的形式插入基 因组后可转录产生 hpRNA; 6) 正义 RNA 大量表达

36 卷第 2 期

何文等 : RN A 干扰及其在水稻抗病毒基因工程中的应用

! 15 !

1. 2. 3. 1

转录后基因沉默 ( post transcript ional gene silencing, PT GS)

上 , 对靶基因进行转录后的负调控, 而靶 mRN A 并 不发生 变化 , 所以 属于 一种 翻译 水平 上的 抑制 效 应 [ 25- 26] 。 miRNA 和 siRNA 相同 , 除了都 由 Dicer 酶加工成熟之外 , RNAi 必 需的 Argo naute ( alg 1、 alg 2) 家族基因也是这两种 RNA 行使 生物功能所 必需的。在 RNAi 过程中形成的 RISC 复合物既含 有 siRNA 又含有 miRNA, 此复合物可 根据不同情 况产生不同效应 , 若 siRNA 与靶序列不能严格配对 ( 如有单个碱基错配) , 则 PT GS 无法进行 , 此时复合 物转而利用 miRNA 抑制核糖体在 m RNA 上 延伸 从而在翻译水平阻断基因表达 [ 27] 。

PT GS 是最普遍的一种沉默机制。此机制主要 由 siRNA 介导[ 11] 。病毒侵染的植物细胞中的 dsR NA 可能是单链 RNA 病毒的复制中间产物或是其 二级结构形态。至于植物 DN A 病毒 , 其 dsRNA 可 能是具有重叠互补序列的转录物经由退火形成的。 在胞质中的 Dicer 酶或其类似物 ( Dicer like, DCL ) 的作用下把长链 dsRNA 切割成 siRNA, 其具 5 ?端 磷酸和 3 ?端羟基 , 此外每条单链的 3 ?端均有 2~ 3 个 突出的非配对的碱基
[ 12- 13]

。由 siRNA 中的反义链

指导形成一种核蛋白体 , 即 RNA 诱导的沉 默复合 体 ( RNA induced silencing complex , RISC ) , 然 后 siRNA 作为引导序列 , 按照碱基互补配对原则识别 靶基 因转 录的 mRNA, 并 引导 RISC 复 合 体结 合 mRNA; 接着 siRNA 与 mRNA 在复合体中换位, 内 切核酸酶将 mRNA 切割成 21~ 23 nt 的片段 , 特异 性地抑制靶基因的 表达; 另一 方面, 释 放的 siRNA 可结合在靶 mRNA 上 作为引物 , 在 RdRp ( RNA dependent RNA Po lymerase ) 的作 用 下 合成 dsR NA , 合成的新的 dsRNA 又可以发生 RNAi 现象 , 特 异地降解靶 mRNA 1. 2. 3. 2
[ 14- 16]

2

RNAi 技术在植物抗病毒研究中的应用
RNAi 技术目前已经广泛应用于植物病毒的防

治上。 1998 年 , 首次报道了 RNAi 技术在防治马铃 薯 Y 病毒病上的应用, Wat erhouse 等人利用马铃薯 Y 病毒 ( PVY ) 蛋白酶基因片段构建 IRS( inv er ted r epeat sequence) 载体 进行烟 草转 化, 使植 株完 全 免疫[ 28] 。 dsRNA 为 RNAi 的诱导起 始物。生物体 由于 病毒入侵、 转座子转录、 基因组中反向重复序列转录 以及外源基因导入等原因都可能产生 dsRNA 分子。 dsRNA 的产生有化学合成法、 体外转录法和转录载 体体内 转 录 法。 现 在普 遍 采 用 转 录 载 体 体 内 转 录法。 2. 1 2 . 1. 1 RNAi 表达载体的构建 靶基因序列的选择 构建高效的 RNAi 表达载体是应用 RNA i 技术 的关键。其 中导 入的 dsRNA 具 有特 异性 是利 用 RNAi 的前提 , 在保证不影响其他功能的前提 下降 解病毒基因组。这种特异性是由 dsRNA 与目的基 因的同源序列决定的 , 所以如果在植物体内还有另 外的基因与 RNAi 作用的基因有同源性, 这个基因 必定也会受到 RNAi 的影响。另外, 对于 RNAi 的 作用位点要经过精心选择。位点选择不当还常常会 导致脱靶效应 ( of f t arg et ef fect ) 。由 于 siRNAs 和 靶 mRNA 可以有一定的错配和间隙 , 因此 siRNAs 可能在一个基因 组中作用于上百 个潜在的目 标序 列
[ 29]

, 从而产生级联放大反应。

转录水平的基因沉默 ( transcript ional gene silencing, T GS)

T GS 机制是通过改 变靶基因染色质的 结构来 实现的。许多研究表明, 发生 T GS 的主要原因是启 动子序列的 碱基尤其 是胞嘧 啶的甲 基化。 siRNA 通过 碱 基配 对 原理 , 指 导 DNA 甲 基化 酶 结合 到 DNA 的特异部位, 引发该部位 DNA 中胞嘧啶的甲 基化 ( RNA direct ed DNA met hy latio n, RdDM ) 及 组蛋白 H 3 赖氨酸 9 的甲基化
[ 17- 21]

, 使靶启动子失

去功能, 导致下游基因转录沉默。另外 , DNA 甲基 化可以阻止转座酶的生成 , 从而抑制转座子的移动, 保持遗传稳定, 防止遗传损害 1. 2. 3. 3
[ 22]



翻译水平的基因沉默

这种机制主要是由内源的 m iRNA 介导的基因 沉默。miRNA 是由长度约 70nt 的 RNA 形成的茎 环样前体 , 经 Dicer 酶作用后形成长约 21~ 25 nt 的 单链 RNA, 大多数 miRNA 与底物 m RNA 不完全 配对结合 , 它们并 不改变 miRNA 的稳定性
[ 23- 24]

。现在已 经发展出若干种算法和软件帮 助选
[ 30]



择特异的 siRNA 靶序列

, 运用科学并相对 先进

这种抑制方式最终也通过形成 RISC 发挥作用 , 结 合在相应 的 mRN A 的 3?末端 非翻译 区 ( 3? U T R)

的技术可以帮助尽量避免脱靶效应的产生。目前, RNAi 技术在植物抗病毒 研究中, 主要从两方 面来

! 16 ! 设计 RNAi 作用的靶位点: 1) 以病毒基因组序列为 靶位点设计 dsRNA, 来起到抑制的作用; 2) 以宿主 植物的基因组序列为靶位点设计 dsRNA, 来起到抑 制的作用。前一种方法目前研究和应用的比较多, 它是将植物病毒基因组的一部分片段作为 RNAi 作 用的靶位 点来设计 dsRNA, 从而 达到 抗病毒 的目 的。 Shuichiro
[ 31]

2010 最广泛 的抗 病毒 手段。 H ayakaw a 等 等
[ 38- 39] [ 37]

和 燕义 唐

将条纹叶枯病毒的 cp 基因分别导入到粳稻

和籼稻中, 发现表达外壳蛋白基因的转基因水稻植 株对 RSV 的侵染起到 一定的抗性。研究表明 , 当 RSV 侵染水稻后 , 伴随着病症的加剧 , 植物细胞内 病毒的外壳蛋白 CP 和病害特异性蛋白 SP 发生积 累 , 而其他病毒蛋白的积累并不明显, 因此推测这两 种蛋白都是致病相关蛋白
[ 40]

等人分别以马铃薯 X 病毒( Pot at o

vi rus X , PVX) 的外壳蛋白基因和 T GBp1 基因 ( 这 个基因编码 RNA 沉默抑制因子 ) 为靶位点来设计 siRNA, 他们分别选取了这两个基因的部分片段设 计成可产生发夹结构的反向重复序列, 结果表明这 两种 siRNA 都能干扰 PVX 的侵染。后一种方法研 究和应用的比较少, 因为它需要在对宿主植物某些 基因功能了解比较清楚的前提下进行。 2. 1. 2 dsRNA 表达结构 对于 dsRNA 表达结构 , 人们多 采用基因 片段 反向连接成反向重复序列的方法, 可使表达的单链 RNA 自我配对形成发夹结构 RNA ( hpRNA) , 发夹 茎部形成稳定的 dsRNA 可诱导同源的内源基因沉 默。通常在片段之间需存在一段间隔区, 以便使载 体结构更加稳定。而用正义方向连接的内含子序列 替代 hpRNA 间隔区 , 形成带有内含子结构的 ihpR NA ( int ron splicing hpRNA) 载体 , 其沉默效率可达 到 90% 以上
[ 32]

。刘利华等

[ 41]

应用免

疫胶体金电镜技术发现病毒的 CP 和 SP 在寄主组 织细胞中的叶绿体和细胞质中都有存在, 线粒体中 没有, 而细胞核中只有 CP 分布, 这表明 CP 极有可 能是病害的致病相关蛋白 , 甚至致病性方面比 SP 更 为重要 ; 并且还发现在叶肉组织细胞壁的胞间连丝 中存在 CP, 据此推测 CP 也可 能与病毒 的运输 有 关。因此, 目前在利用 RNAi 技术抗水稻条纹叶枯 病毒中经常选取病毒的 cp 基因作为靶位点。代玉 华等
[ 42]

以水稻条纹叶枯病毒的 cp 基因为靶标 , 通

过将载体 pM CG161 和载体 pCAM BIA1301 双酶切 和连接 , 构建了一个具有 CaM V 35S 启动子并且在 正反义链中间含有一个水稻内含子适于水稻农杆菌 转化的高表达 RNAi 载体。张恭 等[ 43] 利用已 公布 的水稻条纹叶枯病毒的序列和 siRNA T arg et Find er 软件 , 获得了 168 条 siRNA 片段, 利用这些片段 在水稻基因组中 BL AST , 最终获得 6 条与水稻基因 组完全不匹配的干扰序列。选择其中的 2 条, 通过 化学合成干扰序列 , 利用 pCAM BIA1301 质粒构建 了 2 个 RNA 干扰载体。这些研究为探索利用 RNA 干扰技术防治水稻条纹叶枯病奠定了基础。

。Wesley 等

[ 33]

对此进行了深入的比

较研究, 其结果表明长度为 98~ 853 bp 的靶基因反 向重复片段能够高效地导致沉默, 其转化体沉默效 率可达 66% ~ 100% ( 平均 90% ) 。另外启动子强弱 对于外源基因的表达水平也有很重要的影响, 在构 建准备转化禾本科植物 ( 如水稻) 的表达载体时, 可 用 Ubiquit in 启动子等, 以获得较高的干扰程度[ 34] 。 2. 2 RNAi 技术在抗水稻条纹叶枯病毒中的应用 利用 RNAi 技术赋予植物体病毒抗性具有高度 可行性, 目前已有通过 RNAi 技术获得抗性的报道。 如 Pinto 等[ 35] 将南方菜豆花叶病毒属的水稻黄斑驳 病毒 ( Ri ce y el low mott l e vi rus , RYM V) 复制所需 酶的部分基因通过构建载体而转化水稻, 诱发基因 沉默 , 从而使植物具有对 RYM V 的抗性 , 并且这种 抗性能稳定遗传 3 代。马中良等
[ 36]

3

结语
RNAi 技术已经高效地应用于能够沉默特定植

物基 因的 分 子 植 物育 种 , 并 被 Science 杂 志 评 为 2001、 2002 年度自然科学十大突破之一 [ 44] , 为目前 分子生物学和遗传学研究热点。正如诺贝尔生理学 或医学奖评奖委员会主席戈兰 ! 汉松说 : 我们为一 种基本机制的发现颁奖。这种机制已被全世界的发 明家证 明是 正确的 , 是 给它 发个 诺贝 尔奖 的时 候 了。RNAi 技术发展迅速, 以上的研究也说明 RNA i 技术在应用 于抗水稻病毒 研究中的 巨大潜力。但 RNAi 也有其自身的不足之处。研究证实即使是有 一个碱基的突变, 也会对干扰的效果产生巨大的影 响 [ 45] 。 siRNA 的脱靶效应也是进行 RNAi 试 验时

根据抗 水稻矮

缩病毒( R ice d w ar f v ir us, RDV) 序列 , 构建了与其 相关的 RNA 干扰序列 , 导入水稻中, 发现对水稻矮 缩病毒有很高的抗性。 转病毒外壳蛋白 cp 基因策略是研究最早、 应用

36 卷第 2 期

何文等 : RN A 干扰及其在水稻抗病毒基因工程中的应用
[ 46- 47]

! 17 !

需要注意的一个问题

。并且对于 RSV 的各基

t in nucl eat ion by t he st ress act ivat ed A TF/ CR EB f ami ly pro t ein s[ J] . Sci ence, 2004, 304( 25) : 1971- 1976. [ 17] W as senegger M , H eimes S, Riedel L, et al . RN A direct ed de n ovo m et hylat ion of genomic s equences in plant s [ J ] . Cell 1994, 76: 567- 576. [ 18] M et t e M F, A uf satz W, van der Winden J, et al . Tr ans crip t ional silencing an d prom ot er m et hylat ion t riggered by dou ble s t randed R N A [ J] . EM BO J , 2000, 19: 5194- 5201. [ 19] J on es L, Rat clif f F, Baul combe D C. R N A direct ed tr ans crip

因产物的功能及其在致病性中的作用等方面的研究 还很少。尽管仍有一些问题亟待研究, 但随着分子 生物学方法和技术的发展 , 可以预见上述问题必将 一一得到解决, 有理由相信利用 RNAi 技术将在水 稻病毒基因功能研究和水稻抗病品种的培育方面发 挥重要作用。

参考文献
[ 1] 吴书俊 , 钟环 , 左慧 , 等 . 水稻抗条 纹叶枯病 的遗传与 育种研究 进展 [ J] . 中国农学通报 , 2007, 23( 1) : 244- 248. [ 2] W ingard S A . H ost s and sympt oms of ring spot , a viru s dis eas e of plant s[ J] . A gric Res, 1928, 37: 127- 153. [ 3] Fire A , X u S, M ont gom ery M K , et al . Potent and s pecif ic genet ic int erf erence by doub le st randed RN A in Caenorhabd it is e le gans [ J] . N at ur e, 1998, 391: 806- 811. [ 4] 彭昊 , 王志兴 , 窦道龙 , 等 . 由根 癌农杆菌介导将 葡萄糖氧化酶 基因转入水稻 [ J] . 农业生物技术学报 , 2003, 11( 1) : 16- 19. [ 5] Plast erk R H. RN A silencing: t he genomes immune system[ J ] . Science, 2002, 296( 5571) : 1263- 1265. [ 6] H ut vagner G , Zamore P D. R N A i: nat ure ab hors a double s t rand[ J ] . Cur r O pin G enet D ev, 2002, 12: 225- 232. [ 7] Beclin C, Bou t et S, Wat erh ou se P, et al. A branched pat hw ay f or transg ene indu ces R N A sil encin g in plan ts [ J] . Curr Biol, 2002, 12( 8) : 684- 688. [ 8] Li J, Y an g Z, Y u B, et al. M et hyl at ion prot ect s miR N A s and s iRN A s f rom a 3# end uridylat ion act ivi ty in Ar abi d op sis [ J] . Cu rr Biol, 2005, 15( 16) : 1501- 1507. [ 9] Park M Y, Wu G , G onzalez Suls er A , et al. N u clear process ing and export of mi croRN A in Ar abi d op sis [ J ] . Pr oc N at l A cad Sci U S A , 2005, 102( 10) : 3691- 3696. [ 10] Baulcombe D . RN A sil encing in plant s [ J ] . N at ure, 2004, 431: 356- 363. [ 11] H amil t on A J, Baulcom be D C. A species of sm all ant isen se RN A in post t ranscript ion al gen e s ilen cing in plant s [ J] . Sci ence, 1999, 286: 950- 952. [ 12] Zamore O D . R NA interf erence: listening t o sound of silence[ J] . Nat St ruct Biol, 2001, 8( 9) : 749. [ 13] H arbort h J, Elbashir S M , Becheft K , et al. Ident if icat ion of ess ent ial gen es in cult ur ed mammalian cells u sing sm all int er f ering R N A s[ J ] . J Cell Science, 2001, 114( 24) : 4557. [ 14] Zamore P D, T uschl T , S harp P A , et al . R N A i: double st ran ded RN A direct s t h e A T P dependent cl eavage of mRN A at 21 t o 23 nucleot ide int erval s[ J] . Cell , 2000, 101: 25- 33. [ 15] Winst on W M, M olodow it ch C, Craig P H. Syst emic R N Ai in C. elegans requires the put at ive t ransmembrane prot ein SID 1 [ J ] . Science, 2002, 295( 5564) : 2456- 2459. [ 16] Jia S, N om a K , G rew al S I. R N A i i ndependen t heteroch rom a [ 27 ]

t ional gene sil encing in plant s can be inherit ed ind ependent ly of t h e RN A t rigger an d requires M et1 f or maint enance[ J ] . Curr Biol, 2001, 11( 10) : 747- 757. [ 20] V erdel A , Songt ao J, G erber S, et al. R N A i m ediat ed t arge t ing of het erochromat in by th e R1 TS com plex [ J ] . S cien ce, 2004, 303( 30) : 672- 676. [ 21 ] Burat ow ski S, M oazed D. G en e regu lat ion: expression and s ilen cing coupled[ J] . N at ure, 2005, 435: 1174- 1175. [ 22] Zeng Y , Wagner E J, Cull en B R . Bot h nat ural and des igned m icro R N A s can inh ibit t he ex pres sion of cognat e mR N A s w h en ex pres sed in human cel ls [ J] . M ol Cel l, 2002, 9 ( 6) : 1327- 1333. [ 23] V olpe T A , K idn er C, H all I M , et al. Regulat ion of het ero chromat ic s ilen cing and hist one H 3 lysin e 9 met hylati on by R N A i[ J] . Science, 2002, 297( 5588) : 1833- 1837. [ 24] D enli A M , T ops B B, Plast erk R H, et al. Processing of pri mary microR N A s by t h e microprocess or com plex [ J] . N atu re, 2004, 432 ( 7014) : 231- 235. [ 25] Bart el D P. M icroR N A s: genomi cs, b iog enesis, mechan ism, and fun ct ion[ J] . Cell , 2004, 116( 2) : 281- 297. [ 26] Bernst ein E, Caudy A A, Hammond S M , et al. Role f or a biden t at e ribonuclease in t he init iat ion step of RN A int erf erence[ J ] . N at ure, 2001, 409 ( 6818) : 363- 366. Hannon G J. RN A int erferen ce [ J ] . N at ure, 2002, 418 ( 6894) : 244- 251. [ 28] W at erhouse P M , Graham M W , Wang M B. V irus resi st ance and gen e sil encin g in pl ant s can be induced by simu lt aneous expression of sense and ant is ens e R N A [ J] . Proc N at l A cad Sci U SA , 1998, 95( 23) : 13959- 13964. [ 29] M a Y , Creanga A , L um L, et al . Prevalence of off t arget eff ect s in D rosop hi l a R N A int erferen ce screen s [ J ] . N atu re, 2006, 443( 7109) : 359- 363. [ 30] Boese Q , Leak e D , Reynolds A , et al. M echanist ic insight s aid comput at ional s hort int erfering R N A design[ J] . M et hods Enz ymol, 2005, 392: 73- 96. [ 31] Takahas hi S, K omat su K , K akizawa S, et al. T he ef ficiency of in terf erence of P otat o v ir us X in fect ion depends on t he t arget gene[ J] . V iru s Research , 2006, 116: 214- 217. [ 32] Smit h N A , Singh S P, W ang M B. Tot al silencing by intron spliced hairpin RN As[ J] . N at ure, 2000, 407( 6802) : 319- 320. ( 下转 24 页 )

! 24 !
r espon se t o t hermal s tr ess [ J] . Ins ect M ol Biol, 2007, 16: 491 - 500. [ 43] H uang L H , W ang H S, K ang L. D iff er ent evol ut ionary linea ges of large and small heat shock prot ein s in eukaryot es [ J] . C ell R esearch, 2008, 18: 1074- 1076. [ 44] K ang L, Ch en B, W ei J N , et al. Rol es of t hermal adapt at ion and chemical ecology in L i ri omy za dist ribut ion and cont rol[ J] . A n nual R ev Ent omol, 2009, 54: 127- 145. [ 45] H uang L H, Wang C Z, K ang L. Cloning and expressi on of f ive heat shock protein gen es in r elat ion t o cold hardenin g and devel opm ent in th e l eafm iner, L ir i omyz a sati v a [ J] . J In sect Phys iol, 2009, 55: 279- 285. [ 46] 王宗舜 . 昆虫滞育 育激素调 节 [ J ] . 昆虫知 识 , 1985, 22( 4) : 181 - 183. [ 47] 李学荣 . 昆虫人工诱导滞育及其利用的研究进展 [ J ] . 森林病虫 通讯 , 1998, 31( 6) : 50- 55. [ 48] 张 珺 , 吴孔明 , 林克剑, 等. 二化螟温带和亚热带地理种群的滞育特 征与抗寒性差异[ J] . 中国农业科学, 2005, 38( 12) : 2451- 2456. [ 49] Gkouvit sas T , K ont ogiannat os D, K ourt i A . Diff erential expres sion of tw o small H sps during diapauses in the corn st alk borer S eaamia nonag rioides ( Lef. ) [ J] . J Insect Physiol, 2008, 54: 1503 - 1510.

2010
[ 50] 陈 利珍 , 梁革梅 , 吴 孔明 , 等 . 蛋白质 组学技术的发 展及其在昆 虫中的应用 [ J] . 昆虫学报 , 2008, 51( 8) : 868- 875. [ 51] Li A Q , Popova B A , Dean D H , et al. Pr ot eomics of t h e f lesh f ly brai n reveals an abun dance of upregulat ed h eat shock pro t ein s during pupal diapau se[ J ] . J Ins ect Phy siol, 2007, 53( 4) : 385- 391. [ 52] Li A , M ichaud M R , Den linger D L, et al. R apid elevat ion of Inos and decreas es in ab undan ce of ot her p rot eins at pupal dia pause t erminati on in t he fl esh f ly S arc op hag a c rassip al p is [ J] . Bioch imica et Biophysica A ct a ( BBA ) t eomi cs, 2009, 1794( 4) : 663- 668. [ 53] 吴孔明 , 郭予元 , 韦建 福 , 等 . 棉铃 虫抗寒能力 的研究 [ J] . 生态 学报 , 1997, 17( 3) : 298- 302. [ 54] Li Y P, G ot o M , It o S, et al. Physiology of diapaus e and cold hardiness i n th e overw int ering pupae of t h e f all w ebw orm H y ph antr ia cunea ( Lepidopt era: A rct iidae) in Japan [ J ] . J Ins ect Physiol, 2001, 47: 1181- 1187. [ 55] 鞠珍 . 美国白蛾 在不同 树种上 的生 物学 特性及 抗寒 性的 研究 [ D ] . 泰安 : 山东农业大学 , 2007. [ 56] 韩瑞东 . 赤松毛虫抗寒性及其机理研究 [ D ] . 泰安 : 山东农业大 学 , 2002. [ 57] 郭予元 . 棉铃虫的研究 [ M ] . 北京 : 中国农业出版社 , 1998. Prot eins & Pro

( 上接 17 页 ) [ 33] Wesley S V , H el liw ell C A , Smit h N A , et al. Const ruct design f or ef ficient , eff ect ive and high t hrough put gene sil en cing in pl ant s[ J] . Plant J, 2001, 27( 6) : 581- 590. [ 34] Chuang C F, M eyerowit z E M . Specific and heritable genetic int er f erence by double st randed RN A in A rabid opsi s t hal iana [ J ] . PN AS, 2000, 97( 9) : 4985- 4990. [ 35] Pint o Y M , K ok R A , Bandcombe D C. R esis tance to Ri ce ye ll ow mott l e v i rus ( RY M V ) incult ivat ed A f rican ri ce varieti es cont aini ng R Y M V t ransgenes [ J ] . N atu re Bi ot echnol ogy, 1999, 17( 7) : 702- 707. [ 36] 马 中良 , 杨怀义 , 王 荣 , 等 . 利用转 h pRN A 基因 水稻抗水稻矮 缩病毒 [ J ] . 植物学报 , 2004, 46( 3) : 332- 336. [ 37] H ayakaw a T, Zhu Y , It oh K , et al. Genet ically engineered rice resist ant to Ri ce st rip e v irus , an insect t ransmitt ed virus [ J ] . 异性蛋白在寄主体内的积累 [ J] . 福建农业大 学学报 , 1998, 27 ( 3) : 322- 326. [ 41] 刘利华 . 三种水稻病毒病的 细胞病 理学 [ D] . 福 州 : 福 建农林 大学 , 1999. [ 42] 代玉华 , 王锡锋 , 李莉 , 等 . 一 种适合水 稻农杆菌 转化的 RN A i 载体的构建和潮霉素对水稻转化的影响[ J] . 植物保护 , 2007, 33( 2) : 37- 40. [ 43] 张恭 , 刘立峰 , 周维 , 等 . 水稻 条纹叶枯 病毒 R N A 干扰 载体的 构建 [ J] . 华北农学报 , 2008, 23( 4) : 10- 13. [ 44] 江舸 , 金由辛 . 微 R N A ? Sci ence 杂志 2002 年十大 科技突破第 一名 [ J] . 生命的化学 , 2003, 23( 1) : 1- 3. [ 45] D u Q , Th on berg H , Wang J, et al . A syst emat ic analysis of t he silencing ef f ect s of an act ive siR N A at all singl e nucl eot ide m ismat ched t arget sit es [ J] . N u clei c A cids R es , 2005, 33( 5) : 1671- 1677. [ 46] Saxena S, Jons son Z O, D utt a A . Sm all R N A s wit h imperf ect m at ch t o endogen ou s mRN A r epress t ranslat ion. Implicat ions f or of f t arget act ivit y of small inhib it ory RN A in m amm alian cell s[ J] . J Bi ol Ch em, 2003, 278( 45) : 44312- 44319. [ 47] M a H T, O n K F, T sang Y H , et al. An inducible sys t em for expression an d val idat ion of t he specif icit y of s hort hairpin R N A i n mamm alian cells [ J ] . N ucl eic A cids R es, 2007, 35 ( 4) : e22.

Proc N at l Acad Sci U SA , 1992, 89: 9865- 9869. [ 38] 燕义唐 , 王晋芳 , 邱并生 , 等 . 水 稻条纹叶枯病毒 外壳蛋白基因 在工程水 稻植株 中的表 达 [ J] . 植物 学报 , 1992, 34( 12) : 899 - 906. [ 39] Y an Y T , W ang J F, Q iu B S, et al. R es ist an ce t o Ri ce st ri pe v ir us conf err ed by expression of coat prot ein in t ran sgen ic indi ca rice plan ts regenerat ed f rom b om bard ed su spen sion cul t ure [ J] . V i rol ogica Sin ica, 1997, 12 ( 3) : 260- 269. [ 40] 林奇田 , 林含新 , 吴祖建 , 等 . 水 稻条纹病毒外壳 蛋白和病害特


相关文章:
基因工程在番茄育种中的应用
基因工程在水稻育种中的应... 5页 5财富值如...2. 番茄抗病基因工程 2.1 番茄抗病毒基因工程 在...除此外壳蛋白基因外,将病毒基因反义 RNA,卫星 RNA...
RNAi技术及在植物中的应用-生命基地112-廖仕秒-13211127
抑制入侵病毒和转座子的活动,在基因工程中,外源基 ...(NNN)的含量;利用RNAi技术沉默水稻鲨烯合酶基因, ...RNA干扰及其在植物研究中的应用[J]. 生物技术通报,...
人教版试题试卷基因工程及其应用 练习 2
人教版试题试卷基因工程及其应用 练习 2_理化生_...(6)将抗病毒基因“嫁接”到水稻中,形成抗病毒水稻...以目的基因转录 成的信使 RNA 为模板逆转录出单链...
RNA干扰iRNA技术及其应用
RNA干扰iRNA技术及其应用_医药卫生_专业资料。RNA 干扰...RNA , iRNA) 是正常生物体内抑制特定基因表达一...siRNA 已证实介导人 类细胞细胞间抗病毒免疫,用...
...第2节 基因工程及其应用 Word版含解析
第6章 第2节 基因工程及其应用 Word版含解析_数学...目的基因、运载体、受体细胞 B.重组 DNA、RNA 聚合...中国青年科学家陈大炬成功地把人的抗病毒干扰素基因...
...课时跟踪检测(三)基因工程的应用 新人教版选修3
基因工程培育抗虫植物也能抗病毒 B.基因工程在畜牧业上的应用主要是培育...盐害是导致全球水稻减产重要原因之一,中国水稻研究所等单位专家通过农杆 菌...
...1.3基因工程的应用同步练习(含解析)浙科版选修3
转基因棉、番茄、烟草、 马铃薯、 水稻和杨树; ③___: 有转基因烟草、 番茄...抗病毒基因的存在可能会增大变异可能 性。] 7.C [目前,基因治疗只是处于临床...
高一生物 基因工程及其应用必修2
高一生物 基因工程及其应用必修2_从业资格考试_资格...(6)将抗病毒基因“嫁接”到水稻中,形成抗病毒水稻...以目的基因转 录成的信使 RNA 为模板逆转录出单链...
基因工程的应用
教学目标 1.举例说出基因工程应用及取得丰硕成果。...2.在抗病毒转基因植物中,为什么使用病毒外壳蛋白基因...或者将 外壳蛋白基因变成反义 RNA 基因,整合到植物...
高二生物基因工程的应用人教实验版知识精讲.doc
转基因植物:水稻、玉米、棉、马铃薯、番茄、大豆、...目前利用基因工程不断获得了各种抗病毒植株,黄瓜花叶...或者 将外壳蛋白基因变成反义 RNA 基因, 整合到...
更多相关标签: