当前位置:首页 >> 农林牧渔 >>

植物抗冻蛋白及其基因工程研究


河北农业科学 , 2008, 12 ( 2) : 14 - 16
Journal of Hebei Agricultural Sciences

  责任编辑   李布青

植物抗冻蛋白及其基因工程研究
任   , 毛雪飞   敏
(新乡学院应用生物系 , 河南 新乡  453000 )

摘要 : 抗冻蛋白 ( AFP ) 是一种适应低温的特异蛋白质 , 它能阻止体液内冰核的形成与生长 , 维持体液的非冰 冻状态 。了解其特征和抗冻生理机制对农作物抗冻品种选育有重要意义 。以动物方面的研究资料及近年发表的 有关植物 AFP 的文献为基础 , 进行分析归纳 , 籍以阐明植物 AFP 的生化特性 、作用机制 、基因工程研究进展 等 , 并展望了植物 AFP 的应用前景 。 关键词 : 植物 ; 抗冻蛋白 ; 基因工程 中图分类号 : Q78     文献标识码 : A     文章编号 : 1008 2 1631 ( 2008 ) 02 2 0014 2 03
p rotein was summarized1 Key words: Plant; Antifreeze p rotein; Genetic engineering

Stud ies in Plan t An tifreeze Prote in s and The ir Genetic Eng in eer ing REN M in, MAO Xue2fei

( App lied B iology Department of Xinxiang College, Xinxiang 453000, China)

   冻害对大多数的细胞是有害的 , 有时甚至是致死性

的 , 它可以使细胞内环境脱水 、结晶 , 从而造成细胞物 理性损害或死亡 。在农业生产中 , 低温冻害是一种严重 的自然灾害 , 查明植物抗寒性的生理机制及其遗传因 素 , 不仅在基础理论研究上有重要意义 , 在解决生产实 际问题上也有广泛的应用价值 。 一个世纪以来 , 植物冻害机理的研究受到世界各国

学者的重视 。在植物冻害的成因 , 植物在抗寒锻炼过程 中的代谢途径 , 细胞结构 (膜磷脂含量 、膜脂脂肪酸不 饱和度 、细胞骨架的冷稳定性等 ) 的变化 , 以及已经对 农业生产产生良好的经济效益的水稻育秧抗寒剂的研制 等诸多方面都取得了很大进展 。许多研究表明 , 植物要 抵抗冰冻的危害 , 需要具备 2 个最基本的要素 : 一是避 免细胞内结冰 ; 二是细胞膜结构及核酸蛋白质等生命物 质的低温稳定性 。大量研究表明 , 细胞外结冰和细胞液 的过冷却是植物避免细胞内结冰伤害的最主要和最普遍 的 2 种适应机制 。抗冻蛋白 ( antifreeze p rotein, AFP ) 是一种适应低温的特异蛋白质 , 它能阻止体液内冰核的 形成与生长 , 维持体液的非冰冻状态 。 Guy推测植物体 内可能存在能够阻止冰核形成的物质 , 即 AFP, 这种可 以改变水结冰性质的物质在植物中的含量随季节温度起 伏而消长 。AFP 最先是从动物中获得的 , 近年来 , 在植 物中也发现了 AFP。了解 AFP 的特征和抗冻生理机制对
收稿日期 : 2007 2 2 11 14

作者简介 : 任   敏 ( 1962 - ) , 女 , 河南新乡人 , 副教授 , 主要从事 生物技术专业教学与研究 。

maintaining non 2frozen state1 In recent years, the discovery p rocess, basic characteristics, and p rogress of genetic engi2 neering of p lant antifreeze p rotein were analyzed according to the related documents1 The app lication p rospect of antifreeze

Abstract: Antifreeze p rotein is one kind of special p rotein adap ted to low temperature1A t first, it was found from the sea

fish in polar regions1 It could p revent ice nucleation from form ing and growing within fluid1 It also could keep body fluids

农作物抗冻品种选育有重要意义 。以动物方面的研究资 料及近年发表的有关植物 AFP 的文献为基础 , 进行分 析归纳 , 籍以阐明植物抗冻蛋白的生化特性 、作用机制 等 , 并对植物抗冻蛋白的应用前景进行了展望 。

1  抗冻蛋白的发现

境的生物抵御冰冻的一种有效方式 。AFP 最早由 Dever2 海鱼血液淋巴中发现的 , 后来各个实验室又陆续将抗冻 蛋白的研究扩展到昆虫 , 以及其他的无脊椎动物和脊椎 动物 , 现在抗冻蛋白在鱼类 (尤其是深海鱼类 ) 方面 的研究已较成熟 。目前 , 在鱼类的研究中 , 将鱼类的抗 冻蛋白分为 6 类 : 抗冻糖蛋白 ( AFGPs)
( APF II) , III 型 抗 冻 蛋 白 ( APF III) , ( APF I ) 和 Hyperactive 2 V AFP。 (最早被提取

的抗冻蛋白 ) , I型抗冻蛋白 ( APF I) , II型抗冻蛋白
I 型抗冻蛋白 V

发现后 , 研究对象陆续扩大到细菌 、真菌 、无脊椎动物 和脊椎动物 , 而植物抗冻蛋白的研究则较晚 , 曾经用于 研究的植物材料多达 30 余种 , 但是真正被分离纯化获 得 AFP 的不多 , 直到 1992 年 , 加拿大 Griffith 等
[1 ]

炼的可以忍受胞外结冰的冬黑麦 ( Secale cereale ) 叶片

111   动物抗冻蛋白的发现 112   植物抗冻蛋白的发现

AFP 是一些生活在极地 、高山以及深水域等寒冷环

1 次明确提出获得了植物内源 AFPs, 他们从经过低温锻

ies于 1969 年在南极 Mcmurdo 海峡的一种 Noto 2theneniid

自 20 世纪 60 年代抗冻蛋白在鱼类 、昆虫中被陆续



第 2期

任  敏等 : 植物抗冻蛋白及其基因工程研究

?15?

质外体中得到并部分纯化了抗冻蛋白 。同年 , 美国圣母 大学的 Duman 实验室在多种植物中发现了具有热滞效 应的蛋白质
[2 ]

美国北印第安那州研究的 23 种被子植物及常绿植物中 , 秋 、冬季 均 可 检 测 到 AFPs, 但 夏 季 这 种 AFPs 消 失 了
[2 ]

。 1994 年我国学者费云标等
[4]

[3 ]

从常绿抗

, 由该现象可以推测抗冻蛋白是一类低温诱导蛋白

冻植物沙冬青 ( Ammop ip tanthus monglicus) 叶片中分离 得到了抗冻蛋白 。随后卢存福 在高山植物唐古特红景 天叶片及悬浮培养细胞中获得具有抗冻活性的蛋白质 。 到 21 世纪初 , 已经检测到含有热滞活性蛋白的植物有
26 种 。 1998 年英国 York 大学 Dawn Worrall等
[5 ]

质 , 是抗冻植物对冬季低温较为普遍的适应机制 。胡萝 卜的 AFP 基因在非冷驯化状态下不表达 , 而在冷驯化 状态下表达水平迅速呈特异性地提高 达
[8 ] [7 ]

。转基因植物的

AFPs 通 常 只 在 低 温 ( 4 ℃) 诱 导 下 才 能 检 测 到 其 表

在胡萝

。更值得一提的是 , AFPs 有亲水性和热稳定性 ,
[9 ]

卜中发现了第一个植物 AFP 基因 。 2001 年尹明安等成 功克 隆 出 中 国 胡 萝 卜 ( Var1 sativus ) 和 英 国 胡 萝 卜
( Var1 autumn ) 的 AFP 基因 。

这也与冷诱导蛋白相似
Antikainen 等
[ 10 ]



2  植物 AFPs的结构模型

驯化后 , AFPs只在抗冻的单子叶植物 (冬春黑麦 、冬 大麦 、冬春小麦 、春燕麦 ) 叶片质外体中积累 , 而在不 耐寒的玉米中则无 AFPs 积累 。在所研究的双子叶植物 中无论抗寒性较强的菠菜 、油菜 、羽衣甘蓝等 , 还是不 耐寒的烟草等 , 均未检测到 AFPs的存在 。对此 , 可能 有 2 种解释 : 一种可能的解释是双子叶植物 AFPs可能 定位在细胞内 ; 另一种可能的解释是双子叶植物抗冻能 力需在冰冻温度条件下才能被诱导 , AFPs才能积累 。

   关于植物 AFPs 的结构模型报道甚少 。 Kuiper 等

[6 ]

在多年生黑麦草中发现的 AFPs 的冰晶抑制活性高 , 热 滞活性低 , 一级结构中含有重复性序列 。基于这个特 点 , 他们从理论上提出一个 3 维结构模型 : 黑麦草 AF2
Ps是由 118 个氨基酸组成的多肽 , 在这个多肽中每 14 ~ 15 个氨基酸组成一个环 , 8 个环组成一个筒状结构 , 筒

状结构的一端是保守的缬氨酸疏水核 , 另一端是由内部 天冬酰氨酸组成的梯状结构 。已知缬氨酸是疏水性氨基 酸 , 天冬酰氨酸是亲水性氨基酸 。筒状结构的亲水端与 冰晶表面吻合互补 , 疏水端则有效地防止了水与冰的结 合 , 阻止了冰继续生长 。这个模型很好地解释了植物
AFPs热滞活性低 、冰重结晶抑制活性高的现象 。但是

抗冻蛋白基因的发现 , 为抗寒基因工程注入了新的活 力 。在此前的 10 多年中 , 通过抗冻蛋白基因改变动植 物抗冻活性的研究都局限于鱼类抗冻蛋白基因 。为了提 高作物的抗冻性 , 人们对鱼类 AFPs基因的开发利用进 行了不懈的努力 , 取得了一些有益的成果 : 1987 年 Da2
vies等将抗冻蛋白基因整合在 Ti质粒上 , 用叶圆片法转 1989 年 Curler等用真空透析法将冬比目鱼抗冻蛋白基因

与鱼类相比 , 植物抗冻蛋白要复杂的多 , 而且种类也是 多种多样 , 并不能像鱼类那样用简单的一个或几个模式 的植物 , 或者与某些植物的相类似 , 因此并未得到广泛 认可 。但它为找出植物抗冻蛋白之间的一些共性提供了 一条可以尝试的道路 。 由该模型及其他植物的相关研究结果可以看出 , 抗

就能概括 , 所以 Kuiper等所构思的模型只适用于极少数

化郁金香 、烟 草 、油 菜 等 , 获 得 了 一 定 的 抗 冻 能 力 。 导入马铃薯 、拟南芥和欧洲油菜 , 使植物自然结冰温度 降低 118 ℃, 证实了转抗冻蛋白基因可提高植物的抗寒 性 。 1990 年 Georges等用合成的冬蝶鱼抗冻蛋白基因构 建了含 35S启动子 、抗冻蛋白基因和 Cat (编码氯霉素 击导入玉米原生质体 , 通过 CAT 分析以及用抗冻蛋白
1991 年 H ightower 等将极区鱼的 Cafa3AFPs 基因转化并 Cafa3AFPs有高水平的 mRNA, 但在组织中未检测到重 (去掉两头的葡萄球菌蛋白 A +抗冻蛋白 ) 的嵌合基因

冻蛋白大都富含甘氨酸 , 因为甘氨酸在蛋白质中大都出 现在肽链转角的地方 , 由此可以推测 , 在抗冻蛋白中的 折叠区域较多 , 应该形成一个封闭的或者是半封闭的结 构 。而且大多数抗冻蛋白中还含有较多的天冬氨酸 、天 冬酰氨 , 谷氨酸 、谷氨酰氨等酸性氨基酸和赖氨酸等碱 性氨基酸以及一些含有羟基的氨基酸如丝氨酸 、苏氨 酸 , 这些氨基酸都是亲水性的 , 可以广泛的分布于蛋白 质 3 级结构的外部 , 并且还含有较多的疏水性氨基酸 , 以包含在蛋白质的中间 , 通过疏水作用力来维持蛋白质 的结构 , 进一步说明了植物抗冻蛋白应该是一个封闭的 或者是半封闭的结构 。

酰基转移酶 CAT) 基因的载体 PGC51, 将该质粒通过电

和 CAT的抗血清作的蛋白印迹检测到了融合肽的产生 。 获得 转 基 因 烟 草 和 番 茄 , 在 转 基 因 植 物 叶 片 中 ,

结晶作用的活性 。然而他们在含有编码一种融合蛋白 的番茄组织中 , 检测到了 mRNA 和融合蛋白 。而且在含 有融合蛋白的组织中检测到了重结晶抑制作用 。据报道
1997 年 W allis等人人工合成 PHA 2 AFP 基因 , 该基因被 Ps。同年 , 我国的黄永芬等将美洲拟蝶抗冻基因整合在

3  植物 AFPs的生物特性

这种番茄果实可经受冷冻而不坏 , 已申请大田试验 。 转入马铃薯后 , 用免疫杂交方法检测到了表达产物 AF2

311   植物 AFPs属于冷诱导蛋白

tion p rotein, CA IP; cold regulatory p rotein, CORP ) 。在

植物 AFPs属于冷诱导蛋白 ( cold acclimation induc2

312   植物 AFPs只在单子叶植物中有发现

近来的研究表明 , 经 2 ~5 ℃低温

4  抗冻蛋白基因工程研究进展

  1998 年 l0 月 , 第 1 个植物抗冻蛋白基因 — 胡萝卜

?1 6 ?

河北农业科学

2008 年

Ti质粒上 , 然后用花粉管道和子房注射方法导入番茄

( 4 ) 在工业上 , 抗冻蛋白可作为一种高级防冻剂加以

中 , 获得了杂交带 。试验表明 , 在春季平均气温低于正 常年份 414 ℃条件下 , 转基因植株生长优势优于对照 组 。 1998 年赵晓祥等同样利用美洲拟蝶抗冻基因转入 番茄中 。试验表明 , 番茄植株经低温锻炼 , 过氧化氢 酶 、过氧化物酶和超氧化物歧化酶都明显高于对照 , 表 明转基因植株在生理生化水平上获得了有益的变异 , 且 抗寒性增强 。 Holmberg等采用引物重叠延伸法 , 将云杉 蚜虫抗冻蛋白基因组成 CaMV35S2sbwAFP 2 胭脂碱合成酶 检测到了 sbwAFP 的转 录 。在转 基因 烟 草中 , 质 外体
sb1AFP 的表达抑制了冰重结晶 、提高了热滞效应 。

应用 ;

( 5 ) 在医学研究中 , 植物 AFPs 可以应用于细

胞 , 器官等的低温保存 。有研究表明 , 植物 AFPs可以 用于精子 、卵子等的超低温保存 , 用来改善其冷冻质 量 ; ( 6 ) 在食品工业中 , 可以将 AFPs应用于冰激凌的 制造和保存 。现在我国的冷鲜肉工业的发展速度迅猛 ,
AFPs还可以应用于冷鲜肉的保藏 , 除了可以降低成本 ,

还可以保持肉的口感 。有研究表明 , AFPs 在食品的冰 冻 、储藏 、运输和解冻等过程中均能抑制重结晶化 , 并 能减少滴液以防止营养成分的损失 。 但是目前仅仅通过从生物体内提取抗冻蛋白远不能 满足人们的诸多需求 。人们可以通过生物技术的方法 , 用某种生物反应器来定向生产抗冻蛋白 。随着科学研究 的不断发展 , 抗冻蛋白将会为工业 、农业 、医学等更广 泛的领域提供更广阔的应用前景 。 参考文献 :
[ 1 ] Grifith M. Antifreeze p roteins p roduced endogenously in w in2 ter rye leaves [ J ]. - 596. Plant Physical 1992, 100 ( 21 ) : 593 . [ 2 ] U rrutia M E, Duman J G, Knight C A 1 Plant thermal hyster2 [ 3 ] Fei Yunbao, Sun Longhua, Tao Huang, et a l1An important antifreeze mechanism of overw intering p rotion ( AFP ) w ith high ativity in Ammop ip tanthus monglicus [ J ] 1Crychiology, [ J ]. 生物化学与生物物理进展 , 1998, 25 ( 3 ) : 210 in transgenic tobacco iscold 2specific [ J ]. (3) : 423 - 4321 Plant Mol B io1. , insect [ J ]. Nature, 2000, 406: 325 - 328. 1994, 31 ( 6 ) : 560 [ 4 ] 卢存福 , 王   , 简令成 , 等 . 植物抗冻蛋白研究进展 红 2161 1998, 282: 115 - 117 [ 6 ] KuiperM J. A theoretical model of a p lant antifreeze p rotein from Lolium perenne [ J ]. B iophys J, 2001, 81 ( 6 ) : 3560 - 3565. [ 7 ] M eyer K, keil M , NaldrettM J 1 et a l A leucine 2rich repeat . p rotein of carrot that exhibits antifreeze activity [ J ]. FEBS Letters, 1999, 447: 171 - 178. [ 8 ] Kenward K D. Accumulation of type I fish antifreeze p rotein 1993, 23 (2) : 377 - 385. binding p roperties of a hyperactive antifreeze p rotein from an [ 10 ] Antikainen M , Griffith M 1Antifreeze p rotion accumulation in freezing2tolerant cereala [ J ] 1 Physiol Plant, 1997, 99 repeatp rotein that inhibits ice recrystallization [ J ] 1 Science, esis p rotion [ J ] 1B iochim B tophys Acta, 1992, 1121 (1) : 199 - 206

融合基因 , 采用 T2 DNA 双元载体导人烟草中 , RT2PCR 但在大多数情况下转抗冻蛋白基因并不理想 , 可以 想象鱼类和植物在分类学上的演化关系相差太远 , 其基 因结构也存在巨大差异 。在此情形下 , 人们寄希望于植 物 AFPs基因的早日发现和利用 。因而胡萝卜 AFPs基因 的获得 , 为植物抗冻基因工程研究开辟了新的途径 。除 胡萝卜 36 kD 的 AFPs 基因外 , 新近克隆到的植物抗冻 蛋白基因还包括黑麦草 1117 kD 的 AFPs的 cDNA。冬黑 麦中 3117 kD 的 AFPs的 CHT9 基因 , 2418 kD 的 AFPs的
CHT46 基因 。来自冬黑麦中的这 2 个抗冻蛋白基因 , 均

已被转化到大肠杆菌中 。检测结果表明 , 表达蛋白具有 抗冻活性 。但到目前为止 , 仍未有木本植物抗冻蛋白基 因克隆成功的报道 。

5  植物 AFPs的应用前景

   我国是一个农业大国 , 同时也是一个畜牧业大国 ,

而且我国主要的粮食产地以及几乎所有的大型牧场都位 于北方 , 也就说寒灾对我国来说是一个急待解决的问 题 , 尤其是近年来 , 新疆 、内蒙古一带的牧场几乎每年 都受到寒流的袭击 , 从而造成草场的植被大面积死亡 , 进而使牧场的牲畜由于没有饲料而饿死 , 翌年春天沙尘 暴将在植被稀疏的地面上更加的肆无忌惮 。因此 , 将
AFPs应用于此也是最能体现抗冻蛋白的经济价值 、社

会价值以及环境价值的一个方面 。

抗冻蛋白在其他的方面的应用前景 :

( 1 ) 在农业

上 , 将 AFPs的基因导入目标作物中 , 使之表达 , 可以 增强作物在田间的抗寒能力 , 而且会改善作物在收获后
Ps的基因导入花卉中 , 以增强花卉的抗寒 、抗冻能力 ,

的贮藏加工特性 ; ( 2 ) 在花卉培养中 , 可以通过将 AF2 从而使一些优良的品种在较低的温度下也可以正常开 到冬季 , 就会有大量的蔬菜由于在较低的温度下没有妥 善的保管而被冻坏 , 致使无法食用 , 从而照成极大的浪 费 。可以利用 AFPs的特性 , 将抗冻蛋白基因导入蔬菜 中以增强蔬菜的抗冻能力 , 使其即使在较低的温度下储 存也不会发生变质 , 在口感上不会出现太大的差异 ; 放 , 以此可以获得较高的经济价值和社会价值 ; ( 3 ) 每

[ 5 ] Worrall D , Eliasll, A shford D , et a l A carrot leucinerich2 . [ 9 ] Graether sp , Kuiper M J, Gagne S M. β2helix and ice2


相关文章:
植物耐盐基因工程研究进展
植物耐旱基因工程研究进展 5页 免费喜欢此文档的还喜欢 植物抗冻基因研究进展 4...Ca2+在植物适应环境及发育过程中是一个重要的信使,钙联蛋白的 感受蛋白分子可以...
植物抗寒基因工程研究 谢岭
近年来,随着基因工程的发 展,对植物的抗寒机理进行了深入的研究,并克隆了许多与抗寒相关的基因.本文 从膜稳定性、抗氧化酶活性、抗冻蛋白、低温信号转录因子和渗透...
植物抗寒基因工程研究进展
深入的研究 ,并克隆了许多与抗寒相关的基因 .本文从膜稳定性 、抗氧化酶活性 、抗冻蛋白、 温信号转录因子和渗透调节物质等方面对植物耐冷性基因工程研究进展进 ...
北极比目鱼中有抗冻基因,其编号的抗冻蛋白具有11个氨基...
单选题6分 生物 植物的组织培养、基因工程的原理技术 北极比目鱼中有抗冻基因,其编号的抗冻蛋白具有11个氨基酸的重复序列,该序列重复次数越多,抗冻能力越多,越强...
植物抗寒性及其基因工程研究进展
植物抗寒性及其相关基因工程研究进展摘 要:低温是影响植物分布、产量及品质的重要...2.2 抗冻蛋白基因 抗冻蛋白(antifreezeprotein, AFP)是一类具有热滞效应和冰晶...
植物基因工程的重要意义
动物基因如萤火虫的发光蛋白基因,寒带鱼的抗冻蛋白基因, 蛇、 蝎的毒液基因等也...品种的光合与养分效率、 病害与虫害抗性正在成 为植物基因工程研究重点,促使...
生物制药论文定稿
园艺植物抗寒基因工程研究进展 摘要 低温是影响植物生长、发展、生存及分布的一个...关键词:抗寒基因同工酶 抗冻蛋白 转基因 超氧化物酶 药学专业 2010 级生物...
植物抗逆性的研究
关键词:植物;抗逆性;高温;低温;高盐;基因工程 干旱...Straub 等研究发现,大麦 HVA1(LEA3 同 源蛋白)与...3.4 植物抗冻蛋白(AFP)基因 AFP 是植物对低温的...
1.3基因工程的应用学案
酶基因 B、抗除草剂大豆——抗除草剂基因 C、抗盐碱和干旱植物——植物凝集素基因 D、耐寒的番茄——抗冻蛋白基因 二、动物基因工程 1.如何利用动物基因工程技术...
基因工程论文
胡萝卜抗冻蛋白(AFPs) 及其基因的发现 , 为植物抗寒基因工程注入了新的活力。...我国在抗逆基因的分离、克隆和转化等方 面的研究也有新进展,克隆的耐盐碱相关...
更多相关标签: