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植物抗冻蛋白及其基因工程研究


河北农业科学 , 2008, 12 ( 2) : 14 - 16
Journal of Hebei Agricultural Sciences

  责任编辑   李布青

植物抗冻蛋白及其基因工程研究
任   , 毛雪飞   敏
(新乡学院应用生物系 , 河南 新乡  453000 )

摘要 : 抗冻蛋白 ( AFP ) 是一种适应低温的特异蛋白质 , 它能阻止体液内冰核的形成与生长 , 维持体液的非冰 冻状态 。了解其特征和抗冻生理机制对农作物抗冻品种选育有重要意义 。以动物方面的研究资料及近年发表的 有关植物 AFP 的文献为基础 , 进行分析归纳 , 籍以阐明植物 AFP 的生化特性 、作用机制 、基因工程研究进展 等 , 并展望了植物 AFP 的应用前景 。 关键词 : 植物 ; 抗冻蛋白 ; 基因工程 中图分类号 : Q78     文献标识码 : A     文章编号 : 1008 2 1631 ( 2008 ) 02 2 0014 2 03
p rotein was summarized1 Key words: Plant; Antifreeze p rotein; Genetic engineering

Stud ies in Plan t An tifreeze Prote in s and The ir Genetic Eng in eer ing REN M in, MAO Xue2fei

( App lied B iology Department of Xinxiang College, Xinxiang 453000, China)

   冻害对大多数的细胞是有害的 , 有时甚至是致死性

的 , 它可以使细胞内环境脱水 、结晶 , 从而造成细胞物 理性损害或死亡 。在农业生产中 , 低温冻害是一种严重 的自然灾害 , 查明植物抗寒性的生理机制及其遗传因 素 , 不仅在基础理论研究上有重要意义 , 在解决生产实 际问题上也有广泛的应用价值 。 一个世纪以来 , 植物冻害机理的研究受到世界各国

学者的重视 。在植物冻害的成因 , 植物在抗寒锻炼过程 中的代谢途径 , 细胞结构 (膜磷脂含量 、膜脂脂肪酸不 饱和度 、细胞骨架的冷稳定性等 ) 的变化 , 以及已经对 农业生产产生良好的经济效益的水稻育秧抗寒剂的研制 等诸多方面都取得了很大进展 。许多研究表明 , 植物要 抵抗冰冻的危害 , 需要具备 2 个最基本的要素 : 一是避 免细胞内结冰 ; 二是细胞膜结构及核酸蛋白质等生命物 质的低温稳定性 。大量研究表明 , 细胞外结冰和细胞液 的过冷却是植物避免细胞内结冰伤害的最主要和最普遍 的 2 种适应机制 。抗冻蛋白 ( antifreeze p rotein, AFP ) 是一种适应低温的特异蛋白质 , 它能阻止体液内冰核的 形成与生长 , 维持体液的非冰冻状态 。 Guy推测植物体 内可能存在能够阻止冰核形成的物质 , 即 AFP, 这种可 以改变水结冰性质的物质在植物中的含量随季节温度起 伏而消长 。AFP 最先是从动物中获得的 , 近年来 , 在植 物中也发现了 AFP。了解 AFP 的特征和抗冻生理机制对
收稿日期 : 2007 2 2 11 14

作者简介 : 任   敏 ( 1962 - ) , 女 , 河南新乡人 , 副教授 , 主要从事 生物技术专业教学与研究 。

maintaining non 2frozen state1 In recent years, the discovery p rocess, basic characteristics, and p rogress of genetic engi2 neering of p lant antifreeze p rotein were analyzed according to the related documents1 The app lication p rospect of antifreeze

Abstract: Antifreeze p rotein is one kind of special p rotein adap ted to low temperature1A t first, it was found from the sea

fish in polar regions1 It could p revent ice nucleation from form ing and growing within fluid1 It also could keep body fluids

农作物抗冻品种选育有重要意义 。以动物方面的研究资 料及近年发表的有关植物 AFP 的文献为基础 , 进行分 析归纳 , 籍以阐明植物抗冻蛋白的生化特性 、作用机制 等 , 并对植物抗冻蛋白的应用前景进行了展望 。

1  抗冻蛋白的发现

境的生物抵御冰冻的一种有效方式 。AFP 最早由 Dever2 海鱼血液淋巴中发现的 , 后来各个实验室又陆续将抗冻 蛋白的研究扩展到昆虫 , 以及其他的无脊椎动物和脊椎 动物 , 现在抗冻蛋白在鱼类 (尤其是深海鱼类 ) 方面 的研究已较成熟 。目前 , 在鱼类的研究中 , 将鱼类的抗 冻蛋白分为 6 类 : 抗冻糖蛋白 ( AFGPs)
( APF II) , III 型 抗 冻 蛋 白 ( APF III) , ( APF I ) 和 Hyperactive 2 V AFP。 (最早被提取

的抗冻蛋白 ) , I型抗冻蛋白 ( APF I) , II型抗冻蛋白
I 型抗冻蛋白 V

发现后 , 研究对象陆续扩大到细菌 、真菌 、无脊椎动物 和脊椎动物 , 而植物抗冻蛋白的研究则较晚 , 曾经用于 研究的植物材料多达 30 余种 , 但是真正被分离纯化获 得 AFP 的不多 , 直到 1992 年 , 加拿大 Griffith 等
[1 ]

炼的可以忍受胞外结冰的冬黑麦 ( Secale cereale ) 叶片

111   动物抗冻蛋白的发现 112   植物抗冻蛋白的发现

AFP 是一些生活在极地 、高山以及深水域等寒冷环

1 次明确提出获得了植物内源 AFPs, 他们从经过低温锻

ies于 1969 年在南极 Mcmurdo 海峡的一种 Noto 2theneniid

自 20 世纪 60 年代抗冻蛋白在鱼类 、昆虫中被陆续



第 2期

任  敏等 : 植物抗冻蛋白及其基因工程研究

?15?

质外体中得到并部分纯化了抗冻蛋白 。同年 , 美国圣母 大学的 Duman 实验室在多种植物中发现了具有热滞效 应的蛋白质
[2 ]

美国北印第安那州研究的 23 种被子植物及常绿植物中 , 秋 、冬季 均 可 检 测 到 AFPs, 但 夏 季 这 种 AFPs 消 失 了
[2 ]

。 1994 年我国学者费云标等
[4]

[3 ]

从常绿抗

, 由该现象可以推测抗冻蛋白是一类低温诱导蛋白

冻植物沙冬青 ( Ammop ip tanthus monglicus) 叶片中分离 得到了抗冻蛋白 。随后卢存福 在高山植物唐古特红景 天叶片及悬浮培养细胞中获得具有抗冻活性的蛋白质 。 到 21 世纪初 , 已经检测到含有热滞活性蛋白的植物有
26 种 。 1998 年英国 York 大学 Dawn Worrall等
[5 ]

质 , 是抗冻植物对冬季低温较为普遍的适应机制 。胡萝 卜的 AFP 基因在非冷驯化状态下不表达 , 而在冷驯化 状态下表达水平迅速呈特异性地提高 达
[8 ] [7 ]

。转基因植物的

AFPs 通 常 只 在 低 温 ( 4 ℃) 诱 导 下 才 能 检 测 到 其 表

在胡萝

。更值得一提的是 , AFPs 有亲水性和热稳定性 ,
[9 ]

卜中发现了第一个植物 AFP 基因 。 2001 年尹明安等成 功克 隆 出 中 国 胡 萝 卜 ( Var1 sativus ) 和 英 国 胡 萝 卜
( Var1 autumn ) 的 AFP 基因 。

这也与冷诱导蛋白相似
Antikainen 等
[ 10 ]



2  植物 AFPs的结构模型

驯化后 , AFPs只在抗冻的单子叶植物 (冬春黑麦 、冬 大麦 、冬春小麦 、春燕麦 ) 叶片质外体中积累 , 而在不 耐寒的玉米中则无 AFPs 积累 。在所研究的双子叶植物 中无论抗寒性较强的菠菜 、油菜 、羽衣甘蓝等 , 还是不 耐寒的烟草等 , 均未检测到 AFPs的存在 。对此 , 可能 有 2 种解释 : 一种可能的解释是双子叶植物 AFPs可能 定位在细胞内 ; 另一种可能的解释是双子叶植物抗冻能 力需在冰冻温度条件下才能被诱导 , AFPs才能积累 。

   关于植物 AFPs 的结构模型报道甚少 。 Kuiper 等

[6 ]

在多年生黑麦草中发现的 AFPs 的冰晶抑制活性高 , 热 滞活性低 , 一级结构中含有重复性序列 。基于这个特 点 , 他们从理论上提出一个 3 维结构模型 : 黑麦草 AF2
Ps是由 118 个氨基酸组成的多肽 , 在这个多肽中每 14 ~ 15 个氨基酸组成一个环 , 8 个环组成一个筒状结构 , 筒

状结构的一端是保守的缬氨酸疏水核 , 另一端是由内部 天冬酰氨酸组成的梯状结构 。已知缬氨酸是疏水性氨基 酸 , 天冬酰氨酸是亲水性氨基酸 。筒状结构的亲水端与 冰晶表面吻合互补 , 疏水端则有效地防止了水与冰的结 合 , 阻止了冰继续生长 。这个模型很好地解释了植物
AFPs热滞活性低 、冰重结晶抑制活性高的现象 。但是

抗冻蛋白基因的发现 , 为抗寒基因工程注入了新的活 力 。在此前的 10 多年中 , 通过抗冻蛋白基因改变动植 物抗冻活性的研究都局限于鱼类抗冻蛋白基因 。为了提 高作物的抗冻性 , 人们对鱼类 AFPs基因的开发利用进 行了不懈的努力 , 取得了一些有益的成果 : 1987 年 Da2
vies等将抗冻蛋白基因整合在 Ti质粒上 , 用叶圆片法转 1989 年 Curler等用真空透析法将冬比目鱼抗冻蛋白基因

与鱼类相比 , 植物抗冻蛋白要复杂的多 , 而且种类也是 多种多样 , 并不能像鱼类那样用简单的一个或几个模式 的植物 , 或者与某些植物的相类似 , 因此并未得到广泛 认可 。但它为找出植物抗冻蛋白之间的一些共性提供了 一条可以尝试的道路 。 由该模型及其他植物的相关研究结果可以看出 , 抗

就能概括 , 所以 Kuiper等所构思的模型只适用于极少数

化郁金香 、烟 草 、油 菜 等 , 获 得 了 一 定 的 抗 冻 能 力 。 导入马铃薯 、拟南芥和欧洲油菜 , 使植物自然结冰温度 降低 118 ℃, 证实了转抗冻蛋白基因可提高植物的抗寒 性 。 1990 年 Georges等用合成的冬蝶鱼抗冻蛋白基因构 建了含 35S启动子 、抗冻蛋白基因和 Cat (编码氯霉素 击导入玉米原生质体 , 通过 CAT 分析以及用抗冻蛋白
1991 年 H ightower 等将极区鱼的 Cafa3AFPs 基因转化并 Cafa3AFPs有高水平的 mRNA, 但在组织中未检测到重 (去掉两头的葡萄球菌蛋白 A +抗冻蛋白 ) 的嵌合基因

冻蛋白大都富含甘氨酸 , 因为甘氨酸在蛋白质中大都出 现在肽链转角的地方 , 由此可以推测 , 在抗冻蛋白中的 折叠区域较多 , 应该形成一个封闭的或者是半封闭的结 构 。而且大多数抗冻蛋白中还含有较多的天冬氨酸 、天 冬酰氨 , 谷氨酸 、谷氨酰氨等酸性氨基酸和赖氨酸等碱 性氨基酸以及一些含有羟基的氨基酸如丝氨酸 、苏氨 酸 , 这些氨基酸都是亲水性的 , 可以广泛的分布于蛋白 质 3 级结构的外部 , 并且还含有较多的疏水性氨基酸 , 以包含在蛋白质的中间 , 通过疏水作用力来维持蛋白质 的结构 , 进一步说明了植物抗冻蛋白应该是一个封闭的 或者是半封闭的结构 。

酰基转移酶 CAT) 基因的载体 PGC51, 将该质粒通过电

和 CAT的抗血清作的蛋白印迹检测到了融合肽的产生 。 获得 转 基 因 烟 草 和 番 茄 , 在 转 基 因 植 物 叶 片 中 ,

结晶作用的活性 。然而他们在含有编码一种融合蛋白 的番茄组织中 , 检测到了 mRNA 和融合蛋白 。而且在含 有融合蛋白的组织中检测到了重结晶抑制作用 。据报道
1997 年 W allis等人人工合成 PHA 2 AFP 基因 , 该基因被 Ps。同年 , 我国的黄永芬等将美洲拟蝶抗冻基因整合在

3  植物 AFPs的生物特性

这种番茄果实可经受冷冻而不坏 , 已申请大田试验 。 转入马铃薯后 , 用免疫杂交方法检测到了表达产物 AF2

311   植物 AFPs属于冷诱导蛋白

tion p rotein, CA IP; cold regulatory p rotein, CORP ) 。在

植物 AFPs属于冷诱导蛋白 ( cold acclimation induc2

312   植物 AFPs只在单子叶植物中有发现

近来的研究表明 , 经 2 ~5 ℃低温

4  抗冻蛋白基因工程研究进展

  1998 年 l0 月 , 第 1 个植物抗冻蛋白基因 — 胡萝卜

?1 6 ?

河北农业科学

2008 年

Ti质粒上 , 然后用花粉管道和子房注射方法导入番茄

( 4 ) 在工业上 , 抗冻蛋白可作为一种高级防冻剂加以

中 , 获得了杂交带 。试验表明 , 在春季平均气温低于正 常年份 414 ℃条件下 , 转基因植株生长优势优于对照 组 。 1998 年赵晓祥等同样利用美洲拟蝶抗冻基因转入 番茄中 。试验表明 , 番茄植株经低温锻炼 , 过氧化氢 酶 、过氧化物酶和超氧化物歧化酶都明显高于对照 , 表 明转基因植株在生理生化水平上获得了有益的变异 , 且 抗寒性增强 。 Holmberg等采用引物重叠延伸法 , 将云杉 蚜虫抗冻蛋白基因组成 CaMV35S2sbwAFP 2 胭脂碱合成酶 检测到了 sbwAFP 的转 录 。在转 基因 烟 草中 , 质 外体
sb1AFP 的表达抑制了冰重结晶 、提高了热滞效应 。

应用 ;

( 5 ) 在医学研究中 , 植物 AFPs 可以应用于细

胞 , 器官等的低温保存 。有研究表明 , 植物 AFPs可以 用于精子 、卵子等的超低温保存 , 用来改善其冷冻质 量 ; ( 6 ) 在食品工业中 , 可以将 AFPs应用于冰激凌的 制造和保存 。现在我国的冷鲜肉工业的发展速度迅猛 ,
AFPs还可以应用于冷鲜肉的保藏 , 除了可以降低成本 ,

还可以保持肉的口感 。有研究表明 , AFPs 在食品的冰 冻 、储藏 、运输和解冻等过程中均能抑制重结晶化 , 并 能减少滴液以防止营养成分的损失 。 但是目前仅仅通过从生物体内提取抗冻蛋白远不能 满足人们的诸多需求 。人们可以通过生物技术的方法 , 用某种生物反应器来定向生产抗冻蛋白 。随着科学研究 的不断发展 , 抗冻蛋白将会为工业 、农业 、医学等更广 泛的领域提供更广阔的应用前景 。 参考文献 :
[ 1 ] Grifith M. Antifreeze p roteins p roduced endogenously in w in2 ter rye leaves [ J ]. - 596. Plant Physical 1992, 100 ( 21 ) : 593 . [ 2 ] U rrutia M E, Duman J G, Knight C A 1 Plant thermal hyster2 [ 3 ] Fei Yunbao, Sun Longhua, Tao Huang, et a l1An important antifreeze mechanism of overw intering p rotion ( AFP ) w ith high ativity in Ammop ip tanthus monglicus [ J ] 1Crychiology, [ J ]. 生物化学与生物物理进展 , 1998, 25 ( 3 ) : 210 in transgenic tobacco iscold 2specific [ J ]. (3) : 423 - 4321 Plant Mol B io1. , insect [ J ]. Nature, 2000, 406: 325 - 328. 1994, 31 ( 6 ) : 560 [ 4 ] 卢存福 , 王   , 简令成 , 等 . 植物抗冻蛋白研究进展 红 2161 1998, 282: 115 - 117 [ 6 ] KuiperM J. A theoretical model of a p lant antifreeze p rotein from Lolium perenne [ J ]. B iophys J, 2001, 81 ( 6 ) : 3560 - 3565. [ 7 ] M eyer K, keil M , NaldrettM J 1 et a l A leucine 2rich repeat . p rotein of carrot that exhibits antifreeze activity [ J ]. FEBS Letters, 1999, 447: 171 - 178. [ 8 ] Kenward K D. Accumulation of type I fish antifreeze p rotein 1993, 23 (2) : 377 - 385. binding p roperties of a hyperactive antifreeze p rotein from an [ 10 ] Antikainen M , Griffith M 1Antifreeze p rotion accumulation in freezing2tolerant cereala [ J ] 1 Physiol Plant, 1997, 99 repeatp rotein that inhibits ice recrystallization [ J ] 1 Science, esis p rotion [ J ] 1B iochim B tophys Acta, 1992, 1121 (1) : 199 - 206

融合基因 , 采用 T2 DNA 双元载体导人烟草中 , RT2PCR 但在大多数情况下转抗冻蛋白基因并不理想 , 可以 想象鱼类和植物在分类学上的演化关系相差太远 , 其基 因结构也存在巨大差异 。在此情形下 , 人们寄希望于植 物 AFPs基因的早日发现和利用 。因而胡萝卜 AFPs基因 的获得 , 为植物抗冻基因工程研究开辟了新的途径 。除 胡萝卜 36 kD 的 AFPs 基因外 , 新近克隆到的植物抗冻 蛋白基因还包括黑麦草 1117 kD 的 AFPs的 cDNA。冬黑 麦中 3117 kD 的 AFPs的 CHT9 基因 , 2418 kD 的 AFPs的
CHT46 基因 。来自冬黑麦中的这 2 个抗冻蛋白基因 , 均

已被转化到大肠杆菌中 。检测结果表明 , 表达蛋白具有 抗冻活性 。但到目前为止 , 仍未有木本植物抗冻蛋白基 因克隆成功的报道 。

5  植物 AFPs的应用前景

   我国是一个农业大国 , 同时也是一个畜牧业大国 ,

而且我国主要的粮食产地以及几乎所有的大型牧场都位 于北方 , 也就说寒灾对我国来说是一个急待解决的问 题 , 尤其是近年来 , 新疆 、内蒙古一带的牧场几乎每年 都受到寒流的袭击 , 从而造成草场的植被大面积死亡 , 进而使牧场的牲畜由于没有饲料而饿死 , 翌年春天沙尘 暴将在植被稀疏的地面上更加的肆无忌惮 。因此 , 将
AFPs应用于此也是最能体现抗冻蛋白的经济价值 、社

会价值以及环境价值的一个方面 。

抗冻蛋白在其他的方面的应用前景 :

( 1 ) 在农业

上 , 将 AFPs的基因导入目标作物中 , 使之表达 , 可以 增强作物在田间的抗寒能力 , 而且会改善作物在收获后
Ps的基因导入花卉中 , 以增强花卉的抗寒 、抗冻能力 ,

的贮藏加工特性 ; ( 2 ) 在花卉培养中 , 可以通过将 AF2 从而使一些优良的品种在较低的温度下也可以正常开 到冬季 , 就会有大量的蔬菜由于在较低的温度下没有妥 善的保管而被冻坏 , 致使无法食用 , 从而照成极大的浪 费 。可以利用 AFPs的特性 , 将抗冻蛋白基因导入蔬菜 中以增强蔬菜的抗冻能力 , 使其即使在较低的温度下储 存也不会发生变质 , 在口感上不会出现太大的差异 ; 放 , 以此可以获得较高的经济价值和社会价值 ; ( 3 ) 每

[ 5 ] Worrall D , Eliasll, A shford D , et a l A carrot leucinerich2 . [ 9 ] Graether sp , Kuiper M J, Gagne S M. β2helix and ice2


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