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2015-2016高中生物北师大版选修1配套课件 4.2 蛋白质的提取和分离.ppt


第14课时

蛋白质的提取和分离
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[学习目标定位] 1.简述蛋白质提取和分离的基本原理。 2.总结在琼脂糖凝胶电泳中影响蛋白质迁移率的因素。 3.进行乳酸脱氢酶同工酶的提取和电泳分离。

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1.归纳蛋白质多样性的原因<

br />本 课 栏 目 开 关

氨基酸的种类 不同,构成的肽链不同。 (1)图甲说明: ______________ 氨基酸的数目 不同,构成的肽链不同。 (2)图乙说明: ______________ 氨基酸的排列顺序 (3)图丙说明: ________________不同, 构成的肽链不同。 肽链的数目和空间结构 不同,构成的蛋 (4)图丁说明: _____________________
白质不同。

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催化 作用、抗体具有 2.蛋白质有多种功能,如酶具有 ______ 调节 作用、血红蛋白具有 免疫 作用、激素具有 ______ ______ 运输 作用等。 _______ 抑制剂 温度 、pH、________ 3.酶的活性受多种因素影响,如 ______
或激活剂等。 4. 乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶, 能催化乳酸脱氢生成丙 酮酸,几乎存在于所有组织中。

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第14课时

探究点一 电泳、同工酶和蛋白质组学
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带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种 类多,应用非常广泛,它已成为分子生物学技术中分离 生物大分子的重要手段。 1.电泳 (1)原理 一些生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解离的 基团, 在一定的 pH 下, 这些基团会带上正电或负电。 在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电 荷相反 ____ (相同、相反)的电极移动。因待分离样品中各

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带电性质 的 差 异 以 及 分 子 本 身 的 ______ 大小 、 种 分 子 __________ 形状 不同。使带电分子产生不同的迁移速度,从而实 ______
现样品中各种分子的分离。
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(2)常用方法种类 ①琼脂糖凝胶电泳:在电泳缓冲液和凝胶中加入琼脂 净电荷 糖,蛋白质分子的迁移速率主要取决于其所带 ________

大小和形状 等。 以及分子的 ___________
②变性胶电泳:在电泳缓冲液和凝胶中加入十二烷基硫 椭圆 形, SDS 带有 酸钠 (SDS)变性剂,蛋白质都变为 ______

负 电荷,掩盖了不同蛋白质的电荷差异,因此 大量的 ____
变性胶电泳中影响蛋白质的迁移速率的主要因素是蛋 大小 。 白质分子的 _____

学习探究区 小贴士 蛋白质的其他分离技术
(1)凝胶色谱法

第14课时

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第14课时

①凝胶色谱法也称为分配色谱法,是根据相对分子质量 的大小分离蛋白质的有效方法。凝胶实际是一些微小的
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多空球体,大多数是由多糖类化合物构成的。 ②凝胶色谱法分离蛋白质的原理 图 A:相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝 胶颗粒内部,路程较长,移动速度较慢而被滞留;相对 分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面,在颗粒 之间迅速通过。 图 B: a.蛋白质混合物上柱;

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第14课时

b. 洗脱开始,相对分子质量较小的蛋白质进入凝胶颗粒 内; 相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒之外; c. 相对分子质量较小的蛋白质被滞留; 相对分子质量较
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大的蛋白质向下移动; d.相对分子质量不同的蛋白质分子完全分开; e. 相对分子质量较大的蛋白质行程较短, 已从层析柱中 洗脱出来,相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。 (2) 透析法: 将提取液放到用半透膜材料制成的透析袋内,放到磷酸 缓冲液中,小分子的杂质能自由的扩散出透析袋,大分 子蛋白质不能透过透析袋,保留在袋内。

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2.同工酶
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同工酶是指催化的化学反应相同,酶蛋白的分子 结构 、 理化性质 乃至________ 免疫学 性质不同的一组酶。 ______ _________

5 种同工酶, 乳酸脱氢酶一般含有 ____ 其相对分子质量 不同 。 相同 ,但所带电荷 _______ ______

小贴士 同工酶存在于生物的同一种属或同一个体的 不同组织、甚至同一组织或细胞中。产生同工酶的主 要原因是在进化过程中基因发生变异,而其变异程度 尚不足以成为一个新酶。

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3.蛋白质组学
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蛋白质组学指的是在大规模水平上研究蛋白质的特 立体结构 氨基酸组成 分析、 _________ 征,包括蛋白质的 _____________

人工合成 等。 研究和蛋白质的 __________ 由此获得蛋白质水平
上的关于疾病发生、 细胞代谢等过程的整体而全面的 认识。 蛋白质组学的研究不仅能分析生物体内蛋白质 组成 ,还可以揭示各种蛋白质在生物体内的 的 ______

相互作用与联系 。 __________________

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归纳提炼 琼脂糖凝胶电泳的优点
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(1)琼脂含液体量大,近似自由电泳; (2)琼脂作为支持体有均匀、区带整齐、分辨率高、重 复性好等优点; (3)电泳速度快; (4)区带易染色,样品易回收,有利于制备; (5)操作简单、快速、灵敏。

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活学活用 1.下列说法中,不正确的是
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( B )

A.同工酶催化的化学反应相同,但结构不完全相同 B.同工酶的相对分子质量一定不同 C.蛋白质的多样性决定了其功能的多样性 D.蛋白质组学是 21 世纪生命科学研究领域新的前沿

解析 同工酶催化的化学反应相同, 但结构不完全相同, 乳酸脱氢酶的 5 种同工酶的相对分子质量是相同的。

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探究点二 乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离

第14课时

下面我们以乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离为例,体验 蛋白质的提取和分离技术。
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1.乳酸脱氢酶同工酶的提取

漂洗 干净后 ______ 剪碎 到预 (1)取 5 g 新鲜的动物心脏, ______ 磷酸提取缓冲 冷的玻璃匀浆器中,加入 25 mL________________ 冰浴研磨 成匀浆 (如图 1)。 液,然后 _________

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第14课时

离心 管中,在 ___ 4 ℃条件下 (2)将匀浆收集到冰浴的 _____ 上清液 , ___ 4 ℃条件 12 000 rpm 离心 10 min。吸取 _______
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下保存备用(如图 2)。 2.琼脂糖凝胶电泳分离 (1)制备琼脂糖凝胶

TBE电泳缓冲 液配制质量分数为 1% 的琼脂糖 用 ______________ 加热溶解 后混匀,缓慢倒入胶床中,插入适 凝胶,__________
当的梳子,室温冷却至凝胶凝固。拔出梳子,将凝胶 放入电泳槽中,然后向电泳槽中加入适量 TBE电泳缓冲 液 (如图 3)。 ________________

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第14课时

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载样缓冲 液 (质 (2)加样:取适量同工酶提取液与等量 ___________
量分数 40%的蔗糖溶液、 0.25%溴酚蓝 )混匀,然后取 样品孔 内。 20 μL 加入 ________

100 V 条件下电泳 30 min。 (3)电泳: ______ 凝胶底部 时切断电 (4)染色:当溴酚蓝指示剂电泳到 ___________ 染色液 中, 37 ℃染色 15~30 min, 源,取出胶板浸入 ________
水洗后观察电泳结果。

学习探究区 3.结果分析

第14课时

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由图中电泳结果可以看出:

乳酸脱氢酶有5种同工酶 。 5 个条带说明 _______________________ (1)每个器官形成了 __ 心脏 中含量最高,在 ________ 骨骼肌 中含量最低,说明 (2)LDH2 在 _____ 不同的器官同一种同工酶的含量不同 。 _____________________________________ LDH5 ,含量最低的是 ________ LDH1 , (3)骨骼肌中含量最高的是 _______ 同一器官不同的同工酶含量不同 。 说明 _________________________________

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4.实验讨论

第14课时

(1)提取和分离乳酸脱氢酶同工酶过程中为什么要保 持酶的活性?
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答案

酶作为一类特殊的蛋白质(具有生物催化活性),

在其提取和分离过程中必须保持其生物活性,这样分离 出的酶才有可能用来研究其生化性质及相关功能。 (2)制备乳酸脱氢酶同工酶提取液的过程中,哪些是为了

保持酶活性而采取的措施? 答案 ①提供必要的缓冲系统, 以维持 pH 的相对稳定,
防止破坏其活性;②保持低温环境,如将玻璃匀浆器和 离心管预冷, 低温离心; ③避免引入其他杂质或变性剂, 导致酶变性,如对材料进行漂洗。

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(3)溴酚蓝为什么能作为乳酸脱氢酶同工酶的指示剂?
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答案

溴酚蓝能和乳酸脱氢酶同工酶发生特定的反应,

形成特殊的蓝紫色产物。

归纳提炼 1.实验步骤概括 取材 →剪碎 →漂洗 →匀浆 →离心→制凝胶 →加样 → 电泳→染色→冲洗→观察。

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2.实验操作要点

第14课时

(1)所有提取乳酸脱氢酶同工酶用到的器具最好都提
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前在冰箱中预冷处理,这样能更好地保持酶的活性。 (2)蛋白质样品在上样之前,要与等量载体缓冲液混 匀。载样缓冲液中的蔗糖可增加蛋白质样品的比重, 防止加样时发生“漂样 ”现象; 溴酚蓝作为一种电泳 前沿指示剂,判断电泳的进行程度。 (3)将蛋白质样品加在电泳槽的负极段的加样孔,因 为在碱性缓冲液中带负电荷的蛋白质在外加电场作 用下会向正极移动。

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活学活用 2.下列说法不正确的是
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(

)

A.在酶的提取和分离过程中必须保持其生物活性 B.将心脏研磨成匀浆时要在冰浴下进行,是为了保 证酶的活性 C.载样缓冲液中的溴酚蓝是一种酸碱缓冲物质,维 持 pH 稳定 D.电泳的结果是出现了 5 个条带,说明乳酸脱氢酶 有 5 种同工酶

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解析
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酶提取之后要进行一系列活性条件下的研究, 因此

在酶的提取和分离过程中必须保持其生物活性, 将心脏研 磨成匀浆时要在冰浴下进行,就是为了保证酶的活性。载 样缓冲液中的溴酚蓝是一种指示剂,指示酶的迁移位置; 电泳出现了 5 个条带说明乳酸脱氢酶有 5 种同工酶。
答案 C

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带电性质 大小
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慢 快 小分子

匀浆
电泳 染色

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1. 在乳酸脱氢酶同工酶分离过程中, 使用缓冲液的作用
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是 A.维持溶液浓度不变 B.维持溶液酸碱度不变 C.催化蛋白质分离过程顺利完成 D.无实际意义

( B )

解析 分离蛋白质时加入缓冲液,其原因是缓冲液在 一定范围内能抵制外界酸和碱对反应溶液溶液 pH 的 影响,保持 pH 基本不变。

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2.乳酸脱氢酶有几种同工酶 A.2
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( D ) D.5

B.3

C.4

解析 乳酸脱氢酶的同工酶共有 5 种。 3.已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分
子,分子大小、电荷的性质和数量情况如图所示,下 列有关蛋白质分离的叙述中,正确的是 ( )

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A.若将样品以 2 000 r/min 的速度离心 10 min,分子戊 在沉淀中,则丙也一定在沉淀中
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B.若用电泳法分离样品中的蛋白质,则分子丁移动速 度最快 C.将样品装入透析袋中透析 12 h,若分子丙保留在袋 内,则乙也一定保留在袋内 D.若用电泳分离样品中的蛋白质分子,则分子甲和分 子丁形成的电泳带相距最远

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解析

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分子丙的相对分子质量大于戊,所以,在离心时

戊存在于沉淀中,丙也一定在沉淀中, A 项正确。电泳
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速度主要取决于颗粒大小、形状和净电荷多少,丁所带 电荷及相对分子质量都是既不最多也不最少,所以 B 项 错误。 分子丙的相对分子质量大于乙, 则丙保留在袋内, 乙可能在袋外, C 项错误。一般来说,带电颗粒直径越 小,所带净电荷越多,在电场中移动速度越快,因此, 分子甲与丙形成的电泳带相距最远, D 项错误。 答案 A

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4.科学家发现蝇体内存在一种抗菌活性蛋白。 这种蛋白 质具有极强的抗菌能力, 受到研究者的重视。 分离该
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抗菌蛋白可用电泳法,其原理是根据蛋白质分子的 __________、大小及形状不同,在电场中的________ 不同而实现分离。 答案 电荷(带电情况) 迁移速度

解析

电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的

差异以及分子本身的大小、 形状的不同, 使带电分子产 生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。


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