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ERF转录因子新成员JERF3提高百合的耐盐性


园        2007, 34 ( 6 ) : 1485 - 1490 艺 学 报 Acta Horticulturae Sinica

ERF转录因子新成员 J ER F 3 提高百合的耐盐性
杨宇红 , 尹丽蓉 , 葛   , 黄荣峰 , 肖启明 , 谢丙炎 红
( 1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081;

/>2

1

3

1

2

3

中国农业科学院生物技术研究所 , 北京 100081;

生物安全科技学院 , 长沙 410128)

摘   : 以麝香百合鳞片愈伤组织为受体 , 通过对农杆菌浓度 、培养时间及抗生素敏感性的比较试验 , 要 建立了农杆菌介导的麝香百合愈伤组织遗传转化的优化体系 , 并利用该体系将 ERF转录因子 J ER F3 基因导 入百合中 , 通过 PCR、 RT2PCR 及 Southern blot检测 , 证明 JER F3 已整合到百合基因组中并在转录水平上表 达 。对 T0 代转基因株系耐盐性鉴定表明 , 与未经转化的对照相比 , 转基因百合的耐盐性能明显提高 , 说明
J ER F3 基因的超表达能有效提高转基因百合抵抗盐害的能力 。

关键词 : 百合 ; 转录因子 ; JER F3 基因 ; 耐盐性

O verexpression of a Novel M em ber of ERF Tran scr iption Factor J ER F 3 in L ily Enhances the Tolerance to Sa lt
YANG Yu 2hong , YIN L i2rong , GE Hong , HUANG Rong2feng , X I O Q i2 ing , and X IE B ing2yan A m
1 3 1 2 3

( 1 Institu te of V egetables and F low ers, Ch inese A cadem y of A g ricu ltu ra l S ciences, B eijing 100081, Ch ina;
3

ogy R esea rch, Ch inese A cadem y of A g ricu ltu ra l S ciences, B eijing 100081, Ch ina; Hunan A g ricu ltu ra l U n iversity, Changsha 410128, Ch ina )

了百合在盐渍化问题严重的北方地区的种植及发展 , 培育抗逆耐盐品种是百合育种的重要内容 。 ERF 转录因子分别与细胞发育 、激素 、抗病 、低温及干旱 、高盐等信号的传递有关 (刘强 等 , 2000;
Pti和 Tsi等 ( Ohme 2Takagi & Shinshi, 1995; Hao et al , 1998; Singh et al , 2002 ) 。其中转录因子 . .
收稿日期 : 2007 - 04 - 26; 修回日期 : 2007 - 06 - 24 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( 30671475) 3 通讯作者 Author for correspondence ( E 2 mail: xieby@mail1 caas1 net1 cn)

CB F1 或 CB F3 在拟南芥 、烟草 、番茄及草莓中的超表达可以诱导多种低温胁迫应答基因 COR 的强表

达 , 从而提高植物的 抗冻 性 ( Jaglo 2 ttosen et al , 1998; Gilm our et al , 2000; Thom ashow et al , O . . . 2001; Owens et al , 2002 ) ; DR EB 1A 在拟南芥 、烟草中的超表达增强了包括 rd29A 在内的多种干旱 . 胁迫应答基因以及多种低温胁迫应答基因 COR 的表达 , 表现出对干旱 、高盐和冻害的抗性能力增强

Abstract: U sing the callus of L ilium scales, we established an op tim um A g robacterium 2 mediated trans2 for ation system after comparative assays among A g robacterium concentration, cultivation tim e and antibiotics m sensitivity W ith this system , an ERF fam ily novel mem ber J ER F3 was transferred into lily Identification . . using PCR amp lification, RT2PCR and Southern blot assay indicated that the J ER F3 gene was integrated into lilyπ genome and transcrip tionally exp ressed. And overexp ression of J ER F3 in lily effectively enhanced the tol2 s erance to salt . Key words: L ily; Transcrip tion factor; J ER F3 gene; Tolerance to salt

百合属于盐敏感性植物 , 对土壤的盐碱度要求非常高 。目前百合品系中尚无耐盐碱的品种 , 阻碍

Singh et al , 2002 ) , 许多功能得到确证的抗逆 、抗病相关转录因子都属于此家族 , 如 CB F、DREB、 .

中图分类号 : S 68212    文献标识码 : A    文章编号 : 0513 2 353X ( 2007 ) 06 2 1485 2 06
2

College of B io2safety S cience and Technology,

13

3

湖南农业大学

Institu te of B iotechnol2

13

1486

园          艺 学 报

34 卷

(L iu et al , 1998; Kasuga et al , 1999; 刘强 等 , 2000 ) ; Pti4、 Pti5 或 Pti6 可激活多种抗病相关的 . .
PR 基因的表达 , 提高了转基因烟草和番茄等对细菌 、真菌性病害的抗性 ( He et al , 2001; Gu et al , . .

因烟草的耐盐性和抗病性 ( Park et al , 2001 ) , 其在辣椒中的异源超表达也表现出转基因辣椒对病害 . 的广谱抗病性 ( Shin et al , 2002 ) 。以上多项研究表明 ERF 在植株的防卫反应中起着重要的调控作 . 用 , 在植物中的超表达能够提高植物的抗逆 、抗病能力 ( Kasuga et al , 1999; Park et al , 2001; . .
Shin et al , 2002 ) 。 .
J ER F3 是从番茄 cDNA 表达文库中筛选得到的新的 ERF 类转录因子 , 其表达受 JA、乙烯 、脱落

酸 、低温的诱导 , 能够与顺式作用元件 GCC 2box、DRE (水分缺失应答相关的元件 ) 结合 。抗逆试验 初步证明超表达 J ER F3 能提高转基因烟草的耐旱和耐盐性 (W ang et al , 2004 ) 及转基因辣椒抗疫 . 病 、疮痂病的能力 (杨国顺 , 2003 ) , 说明 J ER F 3 通过识别多个胁迫相关的顺式作用元件激活大量抗 逆 、抗病相关下游功能基因的表达 , 从而提高植物对生物和非生物胁迫的抗性 。 本研究是在建立百合遗传转化优化体系的基础上 , 利用农杆菌介导法将 J ER F 3 基因转入百合 , 获得了超表达的转基因植株 , 以探讨通过分子手段培育耐盐百合新品种的可行性 , 并为 J ER F3 基因 耐盐机理的研究奠定基础 。

麝香百合组培苗由中国农业科学院蔬菜花卉研究所花卉组培室提供 , 其愈伤组织由鳞片诱导产 生 。 J ER F3 基因 、供试质粒 pB I121 (含 CaMV35S启动子以及抗卡那霉素的 N PT Ⅱ 基因 ) 和农杆菌菌 株 LBA4404 由中国农业科学院生物技术研究所黄荣峰博士实验室提供 。 pROK2 表达载体构建如图 1。

统计愈伤组织的褐化率 。

农杆菌浓度的筛选 : 将 1 cm 大小的百合愈伤组织浸于农杆菌菌液中 , 菌液浓度分别稀释至 OD600 值为 014、 016、 018 和 110, 感染时间为 10 m in, 共培养 3 d, 转入芽分化选择培养基 (M S + 6 2 BA
110 mg /L +NAA 011 mg /L + Kan 100 m g /L + Carb 300 m g /L +蔗糖 310% +琼脂 0165% ) 中诱导培养 , 30 d 后统计愈伤组织的褐化率 。
2

后 , 在灭菌滤纸上沥干菌液 , 置共培养基 (M S + 2, 4 2 210 mg /L + 6 2 013 mg /L +蔗糖 310% +琼 D BA 脂 0165% +AS 100 μmol/L ) 上 , 每皿 10 个 , 正面朝上 , 在 25 ℃ 黑暗条件下培养 。共培养时间设 1、
2、 3、 4、 5、 6 和 7 d, 然后转入芽分化筛选培养基 (同上 ) 中 , 30 d 后统计愈伤组织的褐化率 。 113   抗生素敏感性试验
2 卡那霉素 ( Km ) 梯度筛选 : 将 1 cm 大小的愈伤组织分别接种在含 Km 0、 25、 50、 75 和 100 mg /L 的分化培养基上 (M S + 6 2 110 mg /L +NAA 011 m g /L ) 培养 , 或切取百合无菌鳞片分化的长 BA

2002; W u et al , 2002 ) ; Tsi1 通过其 ERF结合域与顺式元件 GCC 2box和 DRE 互作 , 同时提高了转基 .

1  材料与方法

111   材料

112   转化体系优化筛选

2 预培养时间的筛选 : 取 1 cm 大小的百合愈伤组织 , 在预培养基 (M S + 2, 4 2 210 mg /L + 6 2 D BA 013 mg /L +蔗糖 310% +琼脂 0165% ) 上培养 。预培养时间分别设为 0、 12、 24、 48、 72 h。 30 d 后 2

共培养时间的筛选 : 将百合愈伤组织切成 1 cm 大小 , 在 OD600为 014 的农杆菌菌液中感染 10 m in

F ig. 1  Con struction of recom b inan t plan t expression vector pRO K2 2JERF3

图 1  重组植物表达载体 pRO K2 2JERF3 结构图

 6 期

杨宇红等 : ERF转录因子新成员 J ER F3 提高百合的耐盐性  

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约 1 cm 的幼芽 , 分别接种于含上述浓度的卡那霉素生根培养基 ( 1 /2 M S + I A 013 mg /L ) 中 , 30 d B 后统计愈伤组织的褐化率或检查生根情况 。
2 羧苄青霉素 ( Carb ) 抑菌浓度筛选 : 将 1 cm 大小愈伤组织在 LBA4404 菌液中浸泡 10 m in 后分别

置于含 0、 150、 300、 450、 600 mg /L Carb的分化培养基 (同上 ) 上 , 15 d 后统计抑菌情况 。
114   百合的转化与再生

将预培养 48 h的愈伤组织浸于农杆菌菌液中 10 m in, 在灭菌滤纸上沥干菌液后置共培养基上 ,

于 25 ℃ 暗培养 3 d, 然后转入芽分化培养基中 。待小苗长至 2 ~3 cm 长时 , 从愈伤组织上切割小苗转 入生根培养基中 , 15 d 左右继代 1 次 。当经 PCR 检测为阳性的试管苗长至 5 ~6 cm 时 , 切取小鳞片 , 转入鳞片快繁培养基 (M S + 6 2 110 mg /L +NAA 011 m g /L +蔗糖 310% +琼脂 017% ) , 待小苗长至 BA
5 ~6 cm 长时再次进行扩繁 。 115   转基因百合的分子检测

阳性扩增菌液测序 , 用 NCB I的 BLAST 程序和 DNAMAN 软件进行序列比较 , 分析其同源性 。或取 理 , 然后使用 SuperScrip tⅡ 逆转录酶合成第 1 链 cDNA , 取 1 μL cDNA 用上述引物及 PCR 程序进行
RT2PCR 扩增并分析序列的同源性 。 116   转基因百合的耐盐性鉴定 Southern blot分析 : 选取部分 PCR 为阳性的植株进行 Southern 杂交分析 。将 15 μg转基因植株和 100 mg叶组织 , 采用 TR IZOL Reagent试剂盒提取总 RNA , 用 RQ1 RNase 2Free DNase 进行 DNA 消化处

对照植株总 DNA 用 EcoR Ⅰ 酶切 , 经电泳分离转移到尼龙膜上 , 以 J3 和 J4 为引物 , 用纯化的 pROK2 2 JERF3 质粒 PCR 产物做探针标记 , 用试剂盒 ( D IG H igh Prim e Labeling and Detection Starter Kit I) 标 记探针 , 进行 Southern blot分析 。 取经过分子鉴定的 T0 代转基因植株和对照的生根小鳞球分别接种于含 100、 200、 300、 400 和

菌感染后愈伤组织的褐化率 , 以预培养 48 h的效果最好 , 褐化率最低 ( 40% ) ; 农杆菌菌液浸染浓度
表 1  预培养时间 、菌液浓度及共培养时间对愈伤组织褐变率的影响 菌液浓度 愈伤组织褐变率
Callus induction browning ( % ) 43 54 87 93 Table 1  The effect of pre2culture dura tion, A g robacterium concen tra tion and co 2cultiva tion ti e on ca llus in duction brown in g m

预培养时间 Pre2culture

m in的条件下循环 25 次 ; 最后 72 ℃ 延伸 10 m in。扩增产物在 112%的琼脂凝胶电泳上进行检测 , 并对

duration ( h) 0 12 24 48 72

J ER F3 基因的 cDNA 序列设计引物 , 进行 PCR 扩增反应 。引物序列 : J3: 5 ′ 2TCACCGCCGAGTTTC2

94 ℃ 变性 30 s, 62 ℃ 退火 30 s, 72 ℃ 延伸 1 m in, 共 10 个循环 ; 继续在 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s , 72 ℃ 1

500 mmol/L NaCl的 M S + I A 013 mg /L +糖 10%的培养基中分化培养 , 45 d 后统计再生率和死亡率 。 B

211   百合转化体系的确立

21111   预培养时间 、菌液浓度及共培养时间的确立   1 表明 , 对愈伤组织实行预培养可减少农杆 表
愈伤组织褐变率
Callus induction browning ( % ) 90 70 67 40 67
A g robacterium concen tra tion (OD )

TATG2 ′ J4: 5 ′ 3; 2TAATGGTCATCCTCCACGC 2 ′ 由上海生工合成 。扩增条件为 94 ℃预变性 3 m in; 3 ,

2  结果与分析

PCR 及 RT2PCR 检测 : 取 5 g转基因植株和对照植株叶片 , 用 SDS法提取百合基因组 DNA , 根据
014 016 018 110

共培养时间 Co 2cultivation
tim e ( d) 1 2 3 4 5 6 7

愈伤组织褐变率
Callus induction browning ( % ) 93 87 37 43 70 97 100

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以 OD600为 014 时愈伤组织褐变较轻 , 浓度越高 , 愈伤组织褐变越严重 ; 共培养时间 3 ~4 d 较好 , 共 培养时间减少或增加 , 均加重愈伤组织的褐变率 。 21112   卡那霉素 ( Km ) 和羧苄青霉素 ( Carb ) 浓度的确定   2 表明 , 百合愈伤组织对 Km 较为敏 表 感 , 浓度为 25 mg /L 时褐变率就已达到 67% , 100 mg /L 时基本全部褐化 ; 而鳞片分化的幼芽根部对
Km 的耐受力稍强 , Km 浓度为 50 mg /L 时仍有 54%的生根率 。在实际研究中 , 一般确定筛选浓度略

低于全致死浓度 。本试验确定愈伤组织和小苗生根系统的 Km 筛选浓度为 100 mg /L。 的要求 , 是保证百合转化成功的最佳浓度选择 。
表 2  不同浓度卡那霉素 ( Km ) 对百合愈伤组织的影响
Table 2  Effect of d ifferen t Km concen tra tion s on lily ca llus of explan t

由表 3 可知 , Carb 浓度为 300 mg /L 时可达到恰好能完全抑制农杆菌生长又不影响植物细胞生长

表 3  羧苄青霉素 ( Carb) 的抑菌效果

Table 3  Effect of Carb concen tra tion s on con trol of bacter ium

Km (mg /L )

接种数

愈伤组织褐变率
Callus induction browning ( % ) 0 67 83 90 97

生根率

0 25 50 75 100

Number of exp lant 30 30 30 30 30

Root rate (% ) 100 87 54 30 10

Carb (mg /L ) 0 150 300 450 600

接种数

细菌死亡率

芽诱导频率

Number of exp lant 30 30 30 30 30

Dead rate of bacteria ( % ) 100 87 0 0 0

Shoot regeneration rate ( % ) 0 0 100 86 54

电泳检测 , 可见转基因植株在 500 ~600 bp 之间均稳定地扩增出 1 条清晰的条带 , 对照植株则没有扩 增出相应条带 (图 2, A ) ; 扩增产物经测序分析表明与 J ER F3 核苷酸序列完全一致 ; 进一步经 RT2
PCR 扩增 , 从转基因植株中亦扩增出一段约 590 bp 的特异片段 (图 2, B ) , 与阳性对照的片段一致 ,

而非转化对照株无此目标带 。由此说明 J ER F3 基因已整合到百合的基因组中并得以表达 。

外源基因在百合基因组中的整合情况 、插入拷贝 数等 , 对部分经 J3、 J4 引物 PCR 检测呈阳性的百 合植 株 的 基 因 组 DNA 用 EcoR Ⅰ酶 切 , 以 质 粒
J ER F3 基因 PCR 扩增回收纯化产物作探针 , 任选

一株转基因植株进行 Southern 杂交 , 结果可见转 基因组织有两个条带 , 而非转基因的则没有 (图
3 ) , 进一步证实了 J ER F3 基因已整合进百合基因

212   分子检测结果

21211  PCR 及 RT2PCR 检测结果   分别对 5 个株系的转基因植株和未转化植株的 PCR 扩增产物进行
M: 分子量标记 ; CK + : 质粒阳性对照 ; CK - : 未转基因植株 ; 1 ~5: 转基因植株 。 F ig. 2  PCR ana lysis ( A) and RT 2PCR ana lysis ( B) of tran sgen ic plan ts
+

21212  Southern blot分析结果   为了进一步了解

M: Marker; CK + : Plas id positive control; CK - : Non2transgenic negative p lants; 1 - 5: Transgenic p lants m . p lants; 4: Transgenic p lants .

图 2  转基因植株 PCR 检测 ( A) 和 RT 2PCR检测 ( B)

图 3  转基因植株 Southern 杂交检测

CK : 阳性对照 ; CK - : 未转基因植株 ; 4: 转基因植株 。 F ig. 3  Southern blot ana lysis of tran sgen ic L ilium plan ts CK + : Positive control; CK - : Non 2transgenic negative

 6 期 组中 , 其拷贝数为 2。
213   耐盐性测定结果

杨宇红等 : ERF转录因子新成员 J ER F3 提高百合的耐盐性  

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对 50 株转基因百合和对照的生根小鳞茎进行不同浓度 NaC l盐胁迫处理 , 培养 45 d 后 (图 4 ) ,

可见在含 NaC l 100 mmol/L 的培养基中 , 转基因百合小鳞茎萌发的新叶鲜绿色 , 株高较未转化的对照 植株增高 40% ~50% , 生长势与对照在无盐培养 基中生长情况类似 ; 而对照萌发率低 , 小鳞茎颜 色变淡 , 生长受到抑制 。 在含 NaC l 200 mmol/L 培养基中 , 转基因百 合的存活率仍高达 100% (表 4 ) , 小鳞茎颜色稍 变淡 , 但生长势与无盐培养的对照百合基本类似 ; 而对照植株存活率仅 30% , 小鳞茎变黄且不萌 发 。NaCl浓度增至 400 mmol/L 时 , 转化株与对 照株均不萌发 , 但转化株的存活率仍有 30% , 而 对照株全部变褐死亡 。
100 200 300 400 500

表 4   J ER F 3 基因植株耐盐性测定结果 转
Table 4  Sa lt tolerance of J ER F 3 tran sgen ic plan ts (% )

转化株
NaCl (mmol/L) Transgenic p lants

发芽率
Germ ination rate 70 60 0 0 0

死亡率
Death rate 0 0 40 70 90

图 4  NaC l处理的转基因植株 ( 左 ) 与非转基因植株 ( 右 )
F ig. 4  Tran sgen ic plan ts ( left) and non 2tran sgen ic plan ts ( r ight) in NaC l
2

3  讨论

本研究通过对与转化相关的参数的筛选与比较 , 建立了农杆菌介导的麝香百合愈伤组织遗传转化

的优化体系 : 先将 1 cm 大小的百合愈伤组织预培养 4 h, 浸染菌液浓度 OD600为 014, 浸染时间 10
m in, 选择培养的 Km 适宜浓度为 100 mg /L , Carb 浓度为 300 mg /L , 共培养 3 d 后转入选择性芽分化

培养基中诱导培养 ; 当不定芽长至 2 cm 左右时切下接入选择性生根培养基中进行生根筛选 ; 最后将 阳性的转化苗在鳞片快繁培养基上扩繁获得转基因再生苗 。该体系提高了百合的转化效率 。 在植物抗病 、抗逆反应体系中 , 由于转录因子具有调控与同类性状相关的多个基因表达的特点而 被广泛运用于改良作物的抗病 、抗逆性状方面 , 并取得了很多可喜的进展 ( Sambrook et al , 1989; .
L iu et al , 1998; Eulgem et al , 2000; Yu et al , 2001 ) 。 J ER F3 作为 ERF 转录因子家族的新成员 , 在 . . .

烟草 、辣椒中的超表达已表现出显著的耐旱 、耐盐及抗病性 (杨国顺 , 2003; W ang et al , 2004 ) , 因 . 此应用植物基因工程技术 , 将 J ER F 3 基因导入百合现代栽培品种中 , 可为百合的品种改良及获得抗 逆百合新品系开拓新的途径 。 本研究将 J ER F3 基因导入百合中获得卡那霉素抗性再生株 , 经 PCR、 RT2PCR 及 Southern 检测 ,

表明目的基因已整合到百合基因组中 , 并显著提高了转基因百合的耐盐性 。这些结果表明 J ER F3 可 能作为一种正调控因子参与了百合的耐盐反应 。由于植物的抗逆反应是一个非常复杂的生理过程 , 如 植物的抗盐性不仅取决于糖醇 、四价铵离子等溶解质和渗透保护物质等效应剂 ( effector) 的积累 ,

对照株 Non 2transgenic p lants 发芽率 死亡率
Germ ination rate 40 0 0 0 0 0 70 85 100 100

Death rate

也取决于抗盐性调节因子如转录因子 、信号传导因子等对与耐盐相关下游因子的调控作用 ( Hasegawa

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et al , 2000 ) , 因此抗盐信号传导过程更具复杂性 ( Gong et al , 2001 ) 。虽然 J ER F3 能够与顺式作用 . .

元件 GCC 2box、DRE (水分缺失应答相关的元件 ) 结合 , 但 J ER F3 基因调控何种下游基因的表达提 高百合的耐盐性 , 还需进一步深入研究 。
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