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DOXYCYCLINE抑制人肝癌细胞系HEPG2生长的实验研究


毕业论文

作者:张强波 李杰 时昌文 李捷 孙京杰 曹莉莉 【关键词】 肝肿瘤·Doxycycline·细胞 凋亡·FasL·MMP-2 多西环素(Doxycycline)为 4 环素类抗生素的 1 种,已有研究表 明其对前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤生长有明显的抑制作用[1-3] ,而其对人肝癌 细胞的生长抑制作用国内外未见报道。本研究观察了 Doxycycline 对人肝癌细胞系 HepG2 的 生长抑制和凋亡的影响, 并初步探讨其作用机制。 1 材料与方法 1.2 方法 1.2.2 TUNEL 检测细胞凋亡 取对数生长期生长良好的 HepG2 细胞,将其分别接种于 200 mL 培养瓶 中,细胞贴壁后更换成含终质量浓度分别为 5mg/L 和 20 mg/L Doxycycline 的条件培养液作 用 24、48 和 72 h。胰酶消化各组细胞后,取 1 滴细胞悬液于已消毒载玻片上,细胞贴壁生 长 4 h 制成细胞爬片, 用 1∶1 甲醇丙酮固定 30 min,保存备用。 按 TUNEL 试剂说明书 (Roche) 操作, 采用倒置荧光显微镜成像, 随机选取 5 个视野 300 个细胞计算细胞凋亡率。 1.3 判 断标准 FasL、Fas 及 MMP-2 蛋白定位于细胞膜和(或)细胞质,阳性反应为细胞膜和(或) 细胞质内着棕黄色颗粒。免疫组织化学结果判定参照文献[4] ,以阳性细胞百分比及着色强 度计分做半定量分析。 随机观察 5 个高倍视野, 根据阳性细胞数占细胞总数的百分比计为 0~ 4 分: 无阳性细胞为 0 分, <25%为 1 分, 26%~50%为 2 分, 51%~75%为 3 分, >75% 为 4 分;染色的深度以多数细胞的显色反应为准,着色强度计 0~4 分:无色为 0 分,淡黄色 为 1 分,深黄色为 2 分,棕黄色为 3 分,棕褐色为 4 分。将上述两项指标的评分相加。每张 片分别由 2 个观察者进行盲法测定, 最后取两观察者所得平均值。 1.4 统计学处理 使用 SPSS11.0 统计软件,多组数据间的比较采用单因素方差分析或独立样本 t 检验,P<0.05 为差异有统计学意义。 [NextPage]2 结果 2.2 Doxycycline 对 HepG2 细胞凋亡的影响 本研究选用 5、20 mg/L 两个药物浓度观察其对 HepG2 细胞凋亡的影响 ,在 24 h 后各组凋亡率差异无统计学意义 (P>0.05) ,而在作用 48、72 h 后各实验组细胞凋亡率较对照组明显增加,P<0.01(表 2,图 2) 。 2.3 Doxycycline 对 HepG2 细胞 FasL、Fas 及 MMP-2 蛋白表达的影响 本研究选用 20 mg/L Doxycycline 作用 HepG2 细胞观察对 FasL、Fas 及 MMP-23 种蛋白表达 的影响,作用 48 h 后,FasL、Fas 及 MMP-23 种蛋白表达见表 3。其中 FasL 蛋白表达积分较 对照组明显增加(图 3),MMP-2 蛋白表达积分较对照组明显降低(图 4),而 Fas 蛋白表达与对 照组相比差异无统计学意义,P>0.05(图 5)。 3 讨论 细胞凋亡是 1 个比较复杂 的过程,可通过多条启动途径实现,其中膜受体途径(Fas/FasL)是最重要的途径之 1。Liu J 等[7]发现 Doxycycline 可通过 Fas/FasL 介导的膜受体途径诱导 T 淋巴细胞凋亡,最近 研究报道 Doxycycline 能够明显抑制人胰腺癌细胞增殖,并证实其主要通过 Caspase 依赖的 细胞凋亡发挥作用[3] 。有报道表明人肝癌细胞系 HepG2 表面 Fas 有较强的表达[8] 。本研 究结果显示 20 mg/LDoxycycline 作用 HepG2 细胞 48 h 后 FasL 蛋白表达明显增加,与对照组 比较差异有统计学意义(P<0.05) ,而 Fas 蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05) 。提 示 Doxycycline 可能通过上调细胞表面 FasL 的表达而启动 Fas/FasL 介导的信号传导途径诱 导细胞凋亡。 药物对肿瘤的抑制作用机制往往是多方面、 多途径的, 同样 Doxycycline 通过何种途径影响细胞 FasL 及 MMP-2 表达, 其具体机制尚不完全清楚, 有待做更进 1 步的实 验研究和机制探讨。但初期的体外研究得到了较理想实验结果,有望为肝癌的临床诊治寻求 1 种新的药物治疗。 【参考文献】[2] Fife RS, Sledge GW Jr, Roth BJ, et al. Effects of doxycycline on human prostate cancer cells in vitro[J]. Cancer Lett, 1998 ,127 (1-2):37-41.[4] 刑传平,刘斌,董亮.免疫组织化学标记结果的判断方法[J].中华病理学

杂志,2001,30(4) :318。[6] Bettany JT, Peet NM, Wolowacz RG, et a1. Tetracyclines induce apoptosis in osteocoasts[J]. Bone, 2000, 27(1) :75—80.[8] Masato Nakamura, Hiroaki Nagano, Sakon M, et al. Role of the Fas/FasL pathway in combination therapy with interferon-α and fluorouracil against hepatocellular carcinoma in vitro[J]. Journal of Hepatology, 2007,46(1):77-78.[9] Fife RS, Rougraff BT, Proctor C, et al. Inhibition of proliferation and induction of apoptosis by doxycycline in cultured human osteosarcoma cells[J]. J Lab Clin Med, 1997,130(5):530-534.[11] Mitsiades N, Yu WH, Poulaki V, et al. Matrix metalloproteinase-7 mediated cleavage of Fas ligand protects tumor cells from chemotherapeutic drug cytotoxicity[J]. Cancer Res, 2001,61 (2):577-581.


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