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DNA指纹图谱技术在作物品种


   优良品种是作物高产的基础 , 种子质量直接关系到农业 生产的安全 、 农民增收和农村社会的稳定 。研究可靠实用的 种子真实性和种子纯度鉴定方法是摆在我们科技工作者面前 的一项亟待解决的对农业生产关系重大的课题 。早期 , 人们 采用形态学方法对品种进行识别 , 该方法简便 、 经济 , 但是由 于许多形态学性状鉴定周期长 、 受环境影响大 ,并且随着育种 亲本的利用集中化

,品种鉴定愈来愈困难 ,传统的形态学方法 也就越来越不适应品种鉴定和纯度分析 。 随着电泳技术的发展 , 电泳图谱技术逐渐应用到品种鉴 定和纯度分析中来 。这种电泳图谱多态性丰富 , 具有高度的 个体特异性和环境稳定性 , 就象人的指纹一样 , 因而被称为 “指纹图谱 ( Fingerprinting) ” 。目前在品种鉴定工作中应用较 多的指纹图谱主要有两种类型 : 一类是较早开始研究的生化 指纹图谱 ,另一类是 20 世纪 90 年代之后发展起来的 DNA 指 纹图谱 。 生化指纹图谱 , 包括贮藏蛋白电泳指纹图谱和同工酶电 泳指纹图谱 。蛋白质电泳能产生品种特征特性的蛋白质标 记 ,能准确地将不同品种区分开 ,而且稳定性 、 重复性好 ,具有 很强的适用性 。但是蛋白质电泳技术也存在一些问题 , 对某 些作物尤其对亲缘关系比较近的品种难以鉴别 。同工酶电泳 技术能分析大量样品 ,技术比较简单 ,但是同工酶是基因表达 的直接产物 ,具有组织特异性 、 可利用的数量少 、 多态性少 、 对 酶的提取要求高等缺点 , 因而在品种鉴别上常因同工酶选择 不当而得不到应有的结果 [1 ] 。 DNA 指纹图谱技术 , 主要依靠分子标记来构建品种的指 纹 ,包括常用的 RFLP 、 RAPD 、 、 SSR AFLP 等 ; 以及新兴的 SNP 、 SRAP 、 TRAP 等等 。

第 15 卷第 4 期 :74 生      物 技 术 Vol115 ,No14 :74                                    2005 年 8 月 BIOTECHNOLOGY Aug12005

专题综述 REVIEW ARTICLES

DNA 指纹图谱技术在作物品种 ( 系) 鉴定与纯度分析中的应用
孔祥彬 ,张春庆
1 13

,许子锋

2

(1. 山东农业大学 农学院 ,山东 泰安 271018 ;2. 中种集团承德长城种子有限公司 ,河北 承德 067000) 摘要 : 阐述了常用 DNA 指纹图谱技术 ( RFLP 、 RAPD 、 、 SSR AFLP 等 ) 以及其他的几种 DNA 指纹图谱技术 ( SCAR 、 、 、 ISSR SNP SRAP 、 TRAP 等) 的原理 、 优点及其应用研究概况 ,认为利用 DNA 指纹技术通过鉴定品种 DNA 水平上的差异来鉴定品种真实性和 纯度 ,具有准确可靠 、 成本较低 、 不受环境因素影响 、 便于实现鉴定自动化 ,且可鉴定表型上难于鉴别的品种等优点 ; 已初步应用 于多种作物的品种真实性和纯度分析 ,有些已实现商业化 。虽然 DNA 指纹技术还存在许多不足 ,该文认为利用 DNA 指纹图谱鉴 定品种纯度和真实性是品种鉴定的发展趋势 ,应加大力度不断完善和发展 DNA 图谱鉴定技术 ,实现 DNA 指纹鉴定的简单化 、 自 动化和商业化 。 关键词 : 指纹图谱 ; 品种鉴定 ; 纯度分析 ;DNA
中图分类号 :Q789    文献标识码 :A    文章编号 :1004 - 311X(2005) 04 - 0074 - 04

1  常用 DNA 指纹图谱技术

1. 1   RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism ,限制性长度 多态性) 指纹图谱技术 1980 年 ,RFLP 技术首先是 Botstein 等在人类基因组作图中 发展起来 。 DNA 限制性片段长度多态性其本质是生物在进化 过程中 ,由于各种原因引起了染色体 DNA 中核苷酸排列顺序 发生了变化 ,当这种碱基改变涉及到限制性酶切识别位点时 , 利用限 制 性 内 切 酶 可 将 DNA 切 割 成 长 度 不 同 的 限 制 性 片 段 [2 ,3 ] ,从而将不同品种的种子区分开 。 作物品种具有特异性 、 一致性 ,同一品种的不同个体具有 相同的遗传背景 , 任一个体的分子标记都代表其所属品种的 特性 。RFLP 能够对基因组多个基因位点同时标记 ,且不受环
收稿日期 :2005 - 04 - 01 ; 修回日期 :2005 - 04 - 21 ) 作者简介 : 孔祥彬 (1980 — , 男 , 山东曲阜人 , 硕士生 , 从事玉米 DNA 指纹图谱研究 , E - mail : xiangbinkong @163. com ; 3 通讯作者 : 张春庆 (1963 — ,男 ,山东临朐人 , 教授 , 博导 , 从事种子质量检验技术 、 ) 种子 处理方法 、 品种登记保护的 DNA 指纹技术 、 小麦品质育种的研究 , 发 表论文 30 多篇 ,主编教材 5 部 , Tel :0538 - 8242458 ,E - mail :cqzhang @ sdau. edu. cn 。

境影响 。RFLP 指纹图谱是最早在 DNA 水平上用于品种鉴别 、 种子纯度分析的一项技术 。Smith J V C , et al ( 1991 年 ) 利用 RFLP 技术 ,选用 38 个探针成功地将 78 个玉米的杂交种区分 开 ,共得到 288 个 RFLP 标记 ,并发现 RFLP 可以区分同工酶和 蛋白质电泳不能区分的玉米杂交种 [4 ] 。Vavino P , et al ( 1993 年) 利用 RFLP 技术 ,用 2 个特异性的麦谷蛋白 ( glutenins) 和麦 醇溶 ( gliadins) 探针 , 将 54 个意大利普通小麦品种区分开 [5 ] 。 在国内 ,水稻 ( 张培江等 ,2001) [6 ] , 玉米 ( 黄益勤等 ,2001 ; 袁力 行等 ,2002) [7 ,8 ] 都有应用 。RFLP 指纹图谱是进行品种真实性 和纯度分析的可靠方法 , 但该方法分析过程比较繁琐和花费 较高 ,需要进一步改进 。包颖等 ( 2003) 提出的核糖体 ITS 限制 性片段多态件 ( RFLP) 分析 ,可以快速和可靠地将稻属 CD 染色 体组物种区别开来 。先通用引物扩增 ITS 片段 ,再用特异性的 限制性内切酶 Fok Ⅰ或 Dra Ⅲ消化 PCR 扩增产物 , 然后用 1 %的琼脂糖电泳并根据消化产物的多态性特征来鉴别不同 物种 [9 ] 。 1. 2   RAPD ( Random Amplified Polymorphism DNA ,随机扩增多态 性 DNA) 指纹图谱技术 RAPD 是 1990 年美国杜邦公司 Williams 和加里福尼亚生 物研究所 Welsh 等人首次发现的 。其主要原理是以基因组 DNA 为模板 ,以一个随机的寡聚核苷酸序列为引物进行 PCR 扩增 ,揭示 DNA 序列的多态性 。 由于 RAPD 多数位点是显性的 ,需要从大量引物中筛选出 合适的引物来判别品种和纯度分析 。Tinker N A , et al ( 1993 ) 利用 RAPD 方法 ,分析了 27 个大麦品系 ,20 个双单体材料 , 用 70 个引物进行 PCR 扩增 , 发现 9 个 RAPD 多态性片段可区别 27 个大麦品系 ,认为 RAPD 方法是区别高度相似的大麦品系 的有用方法 [10 ] 。McDonald M B , et al ( 1994 ) 对玉米 、 大豆 、 花 生、 棉花 、 小麦进行 RAPD 检测 ,根据结果认为 RAPD 技术是鉴 定品 种 纯 度 的 有 效 的 方 法 [11 ] 。向 太 和 等 ( 2000 ) 从 500 个 RAPD 引物中筛选出 8 个引物能够有效的区分籼优 63 、 籼优 64 和籼优晚 3 及其亲本 [12 ] 。此外 , RAPD 还在大麦 [13 ] 、 花生 [14 ] 、 油葵 [15 ] 、 [16 ] 等作物进行了真实性鉴定和纯度分析 。由于 油菜 RAPD 的重复性和稳定性较差 , 加之其多态性不太高 , 该方法 目前实际应用不多 ,但是如果建立起不同作物的标准体系 ,严 格控制实验条件 RAPD 还是有很好的应用前景的 。 1. 3   ( Simple Sequence Repeats ,简单序列重复) 指纹图谱技 SSR 术 SSR 由 Tautz 等于 1989 年创立 ,SSR 也叫微卫星 DNA ,是一 类由几个 ( 多为 1 - 5 个) 碱基组成的串联重复 DNA 序列 ,其长 ( 度一般较短 ,广泛分布于基因组的不同位置 ,如 ( G ) n 、AC) n 、 A ( G ) n ( 其中 n 为重复次数) 等 。 AA SSR 指纹技术重复性好 ,简单易于操作 ,且是共显性标记 , 可用来鉴定品种和种子纯度分析 。N Nandakumar , et al ( 2004 ) 采用 10 个微卫星位点分析了 11 个水稻品种和它们的亲本 ,发

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现 9 个微卫星位点在 11 个杂交种具有多态性能构建指纹图谱 的 ,其中 4 个微卫星位点 ( RM206 、 RM216 、 RM258 和 RM263 ) 能 够区别所有杂交种 ,可以用来鉴定纯度和品种保护 [17 ] 。Smith J S C , et al (1997) 利用 131 个 SSR 引物和 80 个 RFLP 探针对 58 个玉米自交 系 和 4 个 杂 交 种 进 行 了 鉴 定 , 结 果 显 示 SSR 比 [18 ] RFLP 能更有效地鉴定玉米种质 。李云海等 ( 1999 ) 从 56 对 SSR 引物中筛选出 5 对引物 ,能够有效地区分所有供试的水稻 雄性不育系和恢复系 [19 ] 。彭锁堂等 ( 2003 ) 选用 26 对 SSR 引 物筛选出引物 RM17 对杂交稻组合籼优 63 和两优培九进行 [20 ] SSR 鉴定 ,与田间十分接近 。李晓辉等 (2003) 利用两个或三 个引物组合构建 SSR 指纹图谱可以将 13 个玉米杂交种区分 开 [21 ] ,随后又构建了 86 个杂交种的 SSR 指纹图谱数据库 , 确 定了 10 对核心引物和判别标准用于亲子鉴定 [22 ] 。吴渝生等 (2003) 以从 96 对 SSR 引物中筛选出 24 对引物 ,每对引物可以 检测到 1 - 6 个数目不等的多态性片段共 97 个 ,建立了可用于 种子检验中的 SSR 指纹图谱 [23 ] 。此外 , 棉花 [24 ] 、 小麦 [25 ] 等作 物也建立了部分品种的 SSR 指纹图谱 。 SSR 标记与其他标记 ( RFLP 、 RAPD 、 AFLP) 相比具有最高的 多态性信息量 ( PIC) ,其等位基因变异来源于基因组 DNA 复制 时的滑动引起的重复序列数目的的变化 , 而不是单碱基突变 或插入缺失 ,因而表现出高度的多态性 [26 ] 。因此可用来高效 准确地检测生物体中的遗传变异 , 在品种鉴定及种子检测中 具有良好的应用前景 。王凤格等 ( 2005) 针对我国玉米新品种 DNA 指纹库构建提出了相应的解决方案 , 对我国玉米种业市 场的规范及玉米新品种保护具有重要意义 [27 ] 。随着更多多态 性 SSR 位点的开发及 SSR 检测技术的进步 , 这一技术将在品 种的真实性和纯度鉴定中得到广泛应用 。 1. 4   AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism , 扩增片段长 度多态性) 指纹图谱技术 AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphism , 扩增长度片 段多态性) 是由 Zabeau 等 (1993) 和 Vos 等 ( 1995) 发明创造的一 种 DNA 分子标记新技术 。其原理是基于对基因组总 DNA 双 酶切经 PCR 扩增后的限制性片段进行选择 ,其实质是 RFLP 和 PCR 两项技术的结合 。 AFLP 技术不仅重复性好 ,而且多态性高 ,在聚丙烯酰胺凝 胶上一次可以扩增 50 - 100 条带 ,因而非常适合品种鉴定和纯 度分析 [26 ,28 ] 。Wang 等 (1998) 利用 AFLP 分析了来自半干旱热 带作物国际研究所的 10 个花生品种 ,获得 78 个多态性谱带 , 认为 AFLP 是构建花生指纹图谱的有效方法 [29 ] 。张春庆等 (2002) 筛选了 AFLP 引物组合 M21 P87 和 M73 P17 可用于水稻的 [30 ] DNA 指纹图谱构建 , 以区别不同品种 。高世斌等 ( 2001 ) 用 引物组合 EcoR Ⅰ - AGG Mse Ⅰ - CAA 对我国 19 个玉米自交 Π 系进行了 AFLP 指纹图谱分析 , 结 果 表 明 利 用 AFLP 标 记总 DNA ,能够从基因组上明确区分玉米自交系 ,可用于玉米自交 系鉴定 [31 ] 。棉花 [32 ,33 ] 、 [34 ] 等作物都有应用 。 西瓜 利用 AFLP 技术进行作物品种指纹图谱的绘制中由于亲 缘关 系 较 近 , 引 物 的 选 择 是 非 常 关 键 的 。张 春 庆 等 ( 2002 , 2003) 对水稻 、 玉米 AFLP 指纹图谱的引物的选择进行了研究 , 选出了具有多态性引物的组合 , 为作物品种指纹构建和纯度 分析指 明 了 思 路 [30 ,35 ,36 ] 。袁 力 行 等 ( 2000 ) 利 用 RFLP 、 、 SSR AFLP 和 RAPD 标记分析玉米自交系遗传多样性的比较研究中 发现 AFLP 具有最高的多态性检测效率 ,能够在一次 PCR 扩增 中检测出 DNA 水平上的微小差异 ,因而非常适于种质鉴定与 保护 [26 ] 。但是目前来看 ,AFLP 技术对实验条件要求较高 , 并 且该技术受到保护 , 难以在短时间应用到生产实践中来 。但 是随着分子指纹图谱自动化的实现 ,AFLP 技术还是有很大的 应用潜力的 。

2  新兴 DNA 指纹图谱技术

2. 1  SCAR ( Sequence Characterized Amplified Regions , 序列特征

扩增区) 技术 SCAR 标记由 Paran 等人于 1993 年提出 , 主要目的是把 RAPD 标记 ( 或其他随机半随机标记) 转变成 PCR 标记 ,方法是 首先克隆 RAPD 标记 ,测出其两端的核苷酸序列 ,再根据这些 核苷酸序列设计一对引物 ( 包括 RAPD 引物 ) 特异性扩增这个 标记 。 张志永等 (1998) 依据与 SMV ( Soybean Mosaic Virus) 抗性基 因紧密连锁的共显性 SCAR 标记 SCW — 05660 的序列测定结 果 ,合成了 2 对 SCAR 标记特异引物 ,对 30 个栽培大豆品种进 行了指纹图谱分析 。结果表明 , 较短的片段 S — 5600 和 S — 05660 是抗病品种的特征性条带 ; 而较长的片段 S — 51000 和 [37 ] S— 51600 是感病品种的特征性条带 。王斌等 ( 1999) 成功地 把其中一个自交系 8112 的特异 RAPD 标记 ( 0. 9kb) 转换成了 稳定的 SCAR 标记 [38 ] 。干滟等 (2001) 将 “蜀杂 6 号” 的父 、 母本 RAPD 标记转化为序列特异的 SCAR 标记 , 建立了用 SCAR PCR 检测杂交油菜 “蜀杂 6 号” 杂种纯度的方法 ,并逐一对照大 田杂种一代生产种的表现型 ,验证了本方法的可靠性 [39 ] 。 该方法与随机标记相比 ,具有高度稳定性 ,实现了特异性 扩增 ,对某一品种的鉴定提供了方便 。该方法与随机半随机 标记结合 ,将起到事半功倍的结果 。 2. 2  ISSR ( Inter - simple sequence repeat ,简单重复间序列) 技术 ISSR 是由 Zietkiewicz 等于 1994 年创建的一种简单序列重 复间扩增多态性分子标记 。ISSR 的基本原理就是在 SSR 的 3’ 或 5’ 端连接 1~4 个嘌呤或嘧啶碱基 , 然后以此为引物 , 对两 侧具有反向排列 SSR 的一段 DNA 序列进行扩增 ,然后进行电 泳、 染色 ,根据谱带的有无及相对位置 ,来分析不同样品间 IS2 SR 标记的多态性 。ISSR 技术的原理和操作与 SSR 、 RAPD 非常 相似 , 只是引物设计要求不同 , 但其产物多态性远比 RFLP 、 SSR 、 RAPD 更加丰富 , 可以提供更多的关干基因组的信息 , 而 且比 RAPD 技术更加稳定可靠 ,实验重复性更好 [40 ] 。 Blair M W , et al (1999) 利用 32 个 ISSR 引物构建 59 个水稻 品种指纹图谱 , 并与同样品种的 AFLP 、 RFLP 、 同工酶指纹比 较 ,发现 ISSR 指纹多态性较好 ,很适合水稻的遗传多样性分析 和品种鉴定 [40 ] 。Prevost A , et al (1999) 用 ISSR 指纹图谱于鉴别 马铃薯品种 ,仅用了 4 个 ISSR 引物就将 30 多个品种区分开 来 [41 ] 。I Pasakinskiene , et al ( 2000) 利用引物 5′ ( AG ) 4GC 、 AC 5′ AC ( G ACA) 4 和 5′ ( G ACA) 4GT , 对 4 个不同种类草进行 ISSR 指纹图谱构建 ,能够区分两种外型很相似的黑麦草 ,并发 现不同品种许多细微的指纹图谱差别 , 以利于品种鉴定 [42 ] 。 王心宇等 (2001) 对 ISSR 标记技术在构建多态水平很低的小麦 ( ( 种内指纹图谱方面做了初步研究 。发现 ( AG) n 、AC) n 、TG) n 等二核昔酸重复引物类型在小麦中多态水平最高 , 能将亲缘 关系很近的品种或品系区分开 [43 ] 。 ISSR 是以 PCR 技术为基础的分子标记 ,DNA 用量少 、 技术 要求低 、 多态性水平高 、 成本低廉 , 且 PCR 扩增时退火温度在 52 ℃ 左右 ,保证了 PCR 扩增的可重复性 ,因而利用 ISSR 标记建 立品种的指纹图谱 , 利用指纹图谱进行品种纯度和真实性鉴 定是很有潜力的方法 。 2. 3   SNP ( single nucleotide polymorphisms ,单核苷酸多态) 技术 SNP 为同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基 的变化 , 是 继 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 ( RFLP) 、 卫 星 标 记 微 ( SSR) 之后的又一种新的分子标记 , 通常呈双等位基因多态 。 生命的遗传信息存贮于 DNA 序列之中 ,高等生物每一个细胞 的全部 DNA 构成了该生物的基因组 。基因组 DNA 序列的变 异是物种遗传多样性的基础 。较普遍的 DNA 序列变异是单个 碱基的差异 ,包括单个碱基的缺失和插入 ,但更多的是单个碱 基的置换 , 即单核苷酸多态性 ( single nucleotide polymorphism , SNP) ,这是等位基因间序列差异最为普遍的类型 。这种具有 单核苷酸差异引起的遗传多态性特征的 DNA 区域 ,可以作为

                                                 15 卷第 4 期 生 物 技 术 第 76 一种 DNA 标记 ,即单核苷酸多态性 ( SNP) 标记 [44 ] 。 玉米 1 号染色体中每 104 个碱基就出现 1 个 SNP ,其多态 性程度比人类及果蝇要高得多 [45 ] 。Bhattramakki 研究组 ( 2002) 以 8 个差异性明显的玉米自交系基因组 DNA 为模板 , 用特异 引物扩增源于 EST 的 502 个基因座 。对所得到的 400 ~ 500bp 的 PCR 产物测序表明 ,86 %基因座的 PCR 产物具有 SNP 多态 性 ,52 %基因座在两个广为应用的玉米自交系 B73 和 Mo17 之 间存在 SNP 多态性 [46 ] 。因而 ,据此多态性 ,很容易绘制这种插 入或缺失的遗传图谱 ,也可通过分析 PCR 产物大小 ,以鉴别各 个体的基因型 。随着品种基因芯片的逐步开发 ,各种品种 SNP 指纹图谱将会不断涌现 。 2. 4   SRAP ( Sequence - related amplified polymorphism , 相关序列 扩增多态性) 技术 SRAP 是一种新型的基于 PCR 的标记系统 ,由美国加州大 学蔬菜作物系 Li G 与 Quiros C F 博士于 2001 年提出 , 又叫基 于序 列 扩 增 多 态 性 ( Sequence - based amplified polymorphism [47 ] SBAP) ( Ferriol , et al . ,2003a) 。该标记通过一对引物对开放 读码框 (ORFs) 进行扩增 ,分为 17 个碱基的正向引物 ( F - prim2 er) 和 18 个碱基的反向引物 ( R - primer) 。反向引物 5’ 端前 11 个碱基的填充序列 ,接着为 AATT 序列 , 随后也是 3 ’ 3 个选 端 择碱基 。其 AATT 序列可以对富含 AT 的内含子区域和启动子 区域进行扩增 。由于内含子 、 启动子和间隔序列在不同物种 甚至不同个体间变异很大 , 从而与正向引物搭配扩增出基于 内含子和外显子 SRAP 多态性标记 [47 ] 。 SRAP 标记中 ,约 20 %为共显性 , 多态性具有很好的重复 性 ,部分条带为某些作物所特有 (Li G, et al . ,2001 ;Lin , et al . [47 ,48 ] 2003) 。SRAP 标记测序显示多数标记为外显子区域 ,其多 态性产生于两方面 : 小片段插入与缺失导致片段大小改变而 产生共显性标记 ; 核苷酸改变影响引物的结合位点 ,导致显性 标记产生 。Maria Ferrio , et al ( 2004 ) 利用 11 对 SRAP 引物组合 分析 47 份南瓜种质材料 , 扩增得到 148 条条带 , 其中 98 条多 态性条带 ,多态性达 66. 2 % ,每个引物组合扩增产生 6~16 条 多态性 带 , 平 均 每 个 引 物 产 生 8. 9 条 带 [49 ] 。H Budak , et al (2004) 利用 ISSR 、 、 SSR RAPD 、 SRAP 四种 DNA 分子标记比较了 草皮草 (Buffalograss) 的遗传多样性 ,提出构建品种的 DNA 指纹 图谱 ,以应用到品种鉴定和品种保护中 [50 ] 。 SRAP 指纹图谱多态性高 ; 重复性好 ; 操作简单 ; 在基因组 中分布均匀 ; 引物具有通用性 ,而且其正向引物可以与反向引 物两两搭配组合 ,因此用少量的引物可组配得到多个引物对 , 提高了引物的使用效率 , 降低引物合成成本 。因而利用 SRAP 构建品种指纹图谱是一种值得尝试的方法 。 2. 5   TRAP ( Target Region Amplification Polymorphism ,目标区域扩 增多态性) 技术 TRAP 是基于生物信息学工具和 EST 数据库信息在已知 的目的基因序列附近产生多态性标记 ,是由 JinGuo Hu 和 Brady 在 2003 年提出的新型的基于 PCR 的标记 [51 ] 。TRAP 技术可以 用来不同基因型种质的收集和能对作物品种所需农艺性状的 基因标签 [52 ] 。随着生物信息学的崛起 , 和各种作物 EST 数据 库的日趋完善 ,各种在高等植物表达区和功能区的分子标记 不断涌现 [52 ] 。 标准指纹图谱 ,今后我们要把理论与实践结合 ,努力构建出不 同作物的标准指纹图谱 , 使其在品种鉴定和纯度分析中发挥 出巨大作用 。
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3  展望

伴随着育种进程和种子贸易的发展 , 特别是我国加入 WTO 和市场经济体制的建立 , 迫切需要建立一套快速准确的 品种鉴定体系 。DNA 指纹图谱技术具有高度的个体特异性和 环境稳定性 ,甚至可以检测到一些基因组中的微小变异 ,具有 准确性强 、 鉴别能力强等优点 。虽然目前各种分子图谱技术 存在技术上的不足 , 但是不同分子指纹图谱的相互结合非常 适合于品种鉴定 、 纯度分析以及品种保护等工作 。目前 ,DNA 指纹图谱技术仅仅停留在实验室水平 , 并且没有各种作物的

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第 15 卷第 4 期 :77 生      物 技 术 Vol115 ,No14 :77                                    2005 年 8 月 BIOTECHNOLOGY Aug12005
建研究的几点思考 [J ] . 植物学通报 ,2005 ,22 (1) :121 - 128.

Ⅲ 类内含子及其对基因表达的影响
郑斌 ,詹希美

( 中山大学中山医学院寄生虫学教研室 ,广东 广州 510080) 摘要 : 内含子是指断裂基因中的非编码区序列 。根据内含子的核苷酸序列和 RNA 潜在折叠方式不同 ,可分成四种类型 : I 类 内含子 、 类内含子 、 类内含子和 Ⅳ Ⅱ Ⅲ 类内含子 。 Ⅲ 类内含子为真核细胞前 mRNA 中的内含子 。它可以启动某些基因的表达 ,影 响基因的表达量 ; 增加 mRNA 分子的稳定性 ; 并通过选择性剪接调控基因的表达 。 Ⅲ 类内含子可以提高转基因动物基因的表达 效率 。因此 ,基因工程中 ,为了提高表达效率 ,是选用基因组基因还是 cDNA 基因 ,应视具体基因而定 。 关键词 : 内含子 ;mRNA ; 基因表达 : 选择性剪接 ; 转基因动物
中图分类号 :Q522    文献标识码 :A    文章编号 :1004 - 311X(2005) 04 - 0077 - 03

   外源基因能否在表达体系正确的 、 高水平的表达 ,是基因 工程中最重要的问题 。影响外源基因表达的因素有多种 , 如 基因信号肽序列 、 载体密码子的偏嗜性和最佳诱导表达条件 等 。随着分子生物学技术的发展 , 人们发现作为非编码序列 的内含子 ( 特别是 Ⅲ类内含子 ) 对基因表达有相当重要的作 用 。因此 ,基因工程中 , 在构建表达载体时 , 应考虑内含子对 基因表达的重要影响 ,以期达到外源基因高水平表达的目的 。
1977 年麻省理工学院的 Phillip Sharp 和冷泉港实验室的 Richard Roberts 等人发现了断裂基因 ( 此工作获 1993 年诺贝尔

1  内含子及其类型

收稿日期 :2004 - 12 - 19 ; 修回日期 :2005 - 06 - 03 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (No. 30170837) ; 国家十五科技攻关 项目 ( No. 2003BA712A03 - 07) 资助 作者简介 : 郑斌 (1970 - ) , 女 , 博士生 , 从事寄生虫免疫与分子生物学 的研究 ,Tel :020 - 87331583 , E - mail : zhengbin8899 @sina. com ; 詹希美 (1945 - ) ,男 ,博士生导师 , 教授 , 从事寄生虫免疫与分子生物学的研 究 , 主编国家统编教材五年制 、 八年制 《人体寄生虫学》 。

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生理学与医学奖 ) 。该发现使人们对基因结构的认识产生了 一次质的飞跃 。绝大多数真核基因和某些原核基因是断裂基 因 ,即基因由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续 镶嵌而成 。编码区序列称为外显子 ( exon) ,非编码区序列称为 内含子 (intron) ,又称为间插序列 (intervening sequence) 。基因表 达时 ,外显子和内含子被一起转录成一个前体 RNA 分子 ,再通 过 RNA 剪接删除内含子序列而把外显子序列连接起来 ,产生 成熟的有功能的 mRNA 、 rRNA 或 tRNA 。 根据内含子存在的宿主不同可以分为 :mRNA 内含子 、 2 tR NA 内含子 、 rRNA 内含子 、 snoRNA 内含子和 snRNA 内含子等 ; 根据其核苷酸序列和 RNA 潜在折叠方式不同 ,可分成四种类 型 : I 类内含子 、 类内含子 、 类内含子和 Ⅳ Ⅱ Ⅲ 类内含子 [1 ] 。I 类内含子 ( group I introns) 存在于线粒体 、 叶绿体及某些低等真 核生物的 rRNA 基因中 ,极个别的 Ⅰ 类内含子存在于原核生物 的噬菌体中 。 Ⅱ 类内含子 ( group Ⅱ introns) 主要见于细胞器 ( 如 线粒体) 、 细菌中 。 Ⅲ 类内含子 ( group Ⅲ introns , 又称核 mRNA 前体内含子) 最为常见 ,即绝大多数真核细胞前 mRNA 中的内 含子 。 Ⅳ 类内含子 ( group Ⅳ introns) , 又称核 tRNA 前体内含


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