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植物种质资源的保存


第七章 植物种质资源的保存
一、概念及保存类型
植物种质资源保存是指利用天然或 人工创造的适宜环境保存种质资源,使 个体中所包含的遗传物质保持其遗传完 整性和活力,并能通过繁殖将其遗传特 性传递下去。 保存类型有两种,即原生境保存和 非原生境保存。

1、原生境保存 将植物的遗传材料保存在它们的 自然环境中。原生境保存的地方多是 植物保护

区,另一种方法为农田种植 保存。

珍 宝 岛 国 家 级 自 然 保 护 区

美国、马里兰、农田

2、非原生境保存
将植物的遗传材料保存在不是它们 的自然生境的地方。 非原生境保存方式有植物园、种子 库、种质圃、试管苗库、超低温库等。 具体保存方法有四种:种植保存、 贮藏保存、离体保存和基因文库保存。

华南植物园

超 低 温 库

二、种质资源离体保存
离体保存方法:


低温保存 超低温保存 生长抑制剂保存





(一)低温保存 一种缓慢生长保存方法,是通过 控制培养温度来限制培养物各种生长 因子的作用,使培养物生长减少到最 低限度。

低温保存的基本特征是保存材料 的定期继代培养,不断繁殖更新; 基本措施是控制保存材料所处的 温度和光照。 延缓保存材料生长速度的另一项 措施是改变培养基的成分。

种质库要定期检查,保持清 洁,及时清除污染材料,并注意 积累资料。

(二)超低温保存 即冷冻保存,一般以液N2为冷 源,使保存温度维持在-196℃。

1、保存原理 低温冰冻过程中,如果生物细胞 内水分结冰,细胞结构就遭到不可逆 的破坏,导致细胞和组织死亡。植物 材料在超低温条件下,冰冻过程中避 免了细胞内水分结冰,并且在解冻过 程中防止细胞内水分次生结冰而达到 植物材料保存目的。

植物细胞含水量大,冰冻保存 难度大,投放液N2中易引起组织 和细胞死亡,故须借助于冷冻防护 剂,防止细胞冰冻或解冻时引起过 度脱水而遭到破坏,保护细胞。

超低温冰箱

2、基本程序 超低温保存的基本程序包括 预处理、冷冻处理、冷冻贮存、 解冻和再培养。

(1)预处理 为保证茎尖在液N2处理后具有稳 定且高的存活率,需进行一定的预处 理,或在冷冻防护剂存在下进行预培 养,或直接进行低温(-3—10℃)预 处理。

(2)冷冻处理 冷冻处理的方法有快速冷冻法、 慢速冷冻法、预冷冻法和干燥冷冻法。

a、快速冷冻法 指将植物材料从0℃或者其他预 处理温度直接投入液氮中保存的方 法,降温速度为1000℃/min。 要求细胞体积小、细胞质浓厚、 含水量低、液泡化程度低的材料。

b、慢速冷冻法 将处于0℃或其他预处理温度的 材料以1—2℃/min的降温速度从起始 温度降到-100℃,稳定1h后,投入到 液氮保存或以此降温速度连续降温 至-196℃的方法。 适宜保存的材料有成熟的、含有 大液泡和含水量高的细胞,对于保 存在悬浮培养中的细胞特别有效。

c、预冷冻法 指将植物保存材料放入液氮前, 需经过短暂时间的低温锻炼的方法。 可分为两步冷冻法和逐级冷冻法。 可使保存材料细胞内充分脱水, 避免因细胞内结冰而导致不可逆伤害 的出现。

d、干燥冷冻法 将材料置于27—29℃烘箱内降低 植物含水量,再投入液氮中保存的方 法。可防止材料冻死。

(3)冷冻贮存 适宜温度下贮存冷冻材料也很 重要。长期内贮存在液氮内的材料, 需合适的液氮容器。冷冻贮存的茎 尖随保存时间的延长,其生活力可 能下降。

(4)解冻 植物材料在超低温贮存过程中所 发生的冻害是在冷冻和解冻过程中产 生的。 解冻过程中发生的冻害是由细胞 内次生结冰造成的。 解冻过程中水的渗透冲击对细胞 膜体系造成破坏。

解冻方法有快速解冻和慢速解冻两种。 a、快速解冻法 是指将液氮中保存的材料直接 投入到37—40℃温水浴中进行解冻 的方法。解冻的升温速度为500— 750℃/min,大多数植物材料可采用 此种方法。

b、慢速解冻法 将液氮中保存的材料先置于0℃ 低温下解冻,再逐渐升至室温下进 行解冻的方法。适宜细胞含水量较 低的材料。 如木本植物的冬芽。

(5)再培养 指将已解冻的材料重新置于培养 基上使其恢复生长的过程。再培养是 检验冷冻保存效果或确定保存方法是 否合适的最根本方法。

3、影响因素
预处理 ◆冷冻 ◆解冻方法 ◆植物材料的性质 ◆冷冻保护剂的使用


所使用的冷冻保护剂 应具有以下特性:
分子质量较小 ◆易于与溶剂混合 ◆快速渗入细胞 ◆无毒或毒性小 ◆易洗脱


常用的是DMSO。

冷冻保护剂的作用: 冷冻保护剂的作用: ◆降低冰点,促进过冷却和“玻璃化”状态形 降低冰点,促进过冷却和“玻璃化” 成 ◆提高溶液黏滞性,阻止冰晶形成 提高溶液黏滞性, ◆增加细胞膜透性,加速胞内水分向外渗出 增加细胞膜透性, ◆稳定细胞内大分子正常结构,阻止低温对膜 稳定细胞内大分子正常结构, 的伤害

4、超低温保存后细胞或组织活力检测 、
◆根本方法是再培养

染色法: ◆染色法:FDA、伊凡蓝法、TTC等 、伊凡蓝法、 等 存活率公式
重新生长的细胞(组织) 重新生长的细胞(组织)数 解冻的细胞(组织)数 解冻的细胞(组织)

存活率( ) 存活率(%)=

×100%

(三)生长抑制剂保存 主要包括高渗保存法、生长抑制 剂保存法、饥饿法、矿物油覆盖法、 低光照培养法及低压保存法。

1、高渗保存法 、 利用培养基的高渗透压来抑制离体培养材料生长的 种质保存方法。 种质保存方法。 高渗物质:甘露醇、蔗糖、 高渗物质:甘露醇、蔗糖、PEG等 等 高渗保存配合低温效果更明显 如: 6~10℃低温下,培养基中加4%甘露醇,可保存马 ℃低温下,培养基中加 甘露醇 甘露醇, 铃薯1 以上。 铃薯 ~ 2年,存活率最高可达 年 存活率最高可达90%以上。 以上

2、生长抑制剂保存法 、 在培养基中加入生长抑制剂以减缓培养材料的 生长,达到长期保存种质材料的保存方法。 生长,达到长期保存种质材料的保存方法。 生长调节剂: 生长调节剂: ABA、青鲜素、CCC、多效唑、B9等 、青鲜素、 、多效唑、 等 使试管苗生长缓慢,生长健壮、叶色浓绿、 使试管苗生长缓慢,生长健壮、叶色浓绿、移 栽成活率高。 栽成活率高。

3、饥饿法 、 从培养基中减去1~2种营养元素,使植株缺乏相 种营养元素, 从培养基中减去 种营养元素 关营养而处于最小生长量 4、矿物油覆盖法 、 使培养材料与空气隔绝, 使培养材料与空气隔绝,延缓生长 5、 5、低光照培养 适当减弱光照强度,缩短光照时间, 适当减弱光照强度,缩短光照时间,进而减缓试 管苗生长 6、低压保存 、 降低培养材料周围气压, 降低培养材料周围气压,达到抑制生长的目的 分为低气压与低氧压两种, 分为低气压与低氧压两种,保存原理相似


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