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DNA指纹图谱在农作物品种鉴定中的应用


   DNA ( 脱氧核糖核酸) 是细胞染 色体中的遗传基因 , 其分子各个片 段就 代 表 各 个 遗 传 信 息 。由 于
DNA 指纹图谱直接反映 DNA 水平

量是 相 对 而 言 的 , 在 一 些 作 物 上
RFLP 探针可进行品种间及种间的

条件的影响很大 , 在小麦等较大基 因组作物的研究中重复性低

, 严重 影响实验结果的可靠性 。
3. 小卫星 DNA 方法

鉴别 ,而在小麦 、 马铃薯 、 大豆等作 物上的多态性较低 。特别是小麦 , 它是严格的自花授粉作物 , 基因组 较大 , 多态性很低 ( 即使在相当分 散 的 品 种 间 也 是 如 此 ) 。因 而 ,
RFLP 方法在指纹图谱中的应用受

上的差异 , 它成为当今最先进的遗 传标记系统 。DNA 指纹图谱技术 主要 有 : 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性
phism ,简称 RFLP) 、 随机扩增多态 ( Restriction fragment length polymor2 ( Mini2satellite DNA ) 、 卫 星 DNA 微 (Microsatellite DNA) 、 内部简单重复

小 卫 星 DNA 方 法 是 1980 ~
1984 年间由人类遗传学家相继在

人体基因组中发现的 。它是由长 度为 11~60 bp 的核心序列串联重 复形成的可达 25 Kb 的串联重复序 列 ,主 要 存 在 于 染 色 体 的 近 端 粒 处 ,在不同个体之间存在着串联数 目的差异 , 因而可产生多态性 。多 态性的产生 ,可能是在 DNA 复制或 不等交换过程中发生的串联数目 的变化引起的 (Jeffereys ,1985 年 ) 。 小卫星 DNA 在真核基因组中具有 多等位性 、 高丰富性和极强的保守 性。 Jeffereys 等人 1985 年发现人源 小卫星探针可以同时与众多的基 因组 DNA 酶切片段杂交 ,得到具有 个体特异性的指纹图谱 。目前 , 已 发现了一些十分有用的小卫星探 针 。Vassart1987 年 发 现 M13 噬 菌 体可以识别人 、 动物 、 植物的品种 间多态性 。 等人 1992 年在小麦 Liu 基因组文库中筛选到的 pTag546 能

到限制 。
21 RAPD 方法 RAPD 方法是 Willams 等人于

性 ( Random amplified polymorphic

DNA , 简 称 RAPD ) 、 卫 星 DNA 小

1990 年 发 明 的 。它 是 利 用 扩 增 DNA 片段长度差异来检测生物个

序列 ( ISSR) 、 扩增片段长度多态性
phism ,简称 AFLP) 等等 。 11 RFLP 方法

体的分子标记技术 。它可在对物 种没有任何分子生物学研究的情 况下 ,对其进行基因组指纹图谱的 构建 。其 相 对 于 RFLP 方 法 较 简 便 ,DNA 用量也较少 , 且省去了使 用放射性同位素 , 受到了许多学者 的重视 。Welth 1991 年曾用 RAPD 分析玉米杂交种的品种纯度 ,He 等 人 1992 年曾用 RAPD 识别小麦品 种 ,在花生 、 小麦 、 水稻等作物上也 曾进行过深入研究 。但 RAPD 是显 性标 记 , 不 能 区 分 杂 合 型 和 纯 合 型 ,更重要的是 ,RAPD 检测受反应

1974 年发明的 。它是一种利用限

制性酶切片段长度差异来检测生
RFLP 方法于上个世纪 80 年代开始

物个体之间差异的分子标记技术 。 应用于植物 , 在水稻 、 小麦 、 玉米 、 蕃茄和马铃薯等作物上的研究都 已有报道 。但 RFLP 的多态信息含

( Amplified fragment length polymor2

一、 DNA 指纹图谱的方法

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RFLP 方法是 Grodzicker 等人于

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ζ ο  

区分出全部参试的 56 个普通小麦 品种 ,是绘制小麦指纹图谱非常有 用的探针 。
41 微卫星 DNA 方法 5. AFLP 方法

微卫星 DNA 方法 ( 又称 Simple

sequence repeat ,简称 SSR) 是一类由

几个核苷酸 ( 一般为 1 ~ 5) 为重复 单位组成的长达几十个核苷酸的 串联重复序列 。同一类的微卫星 可分布于整个基因组的不同位置 上 。每个座位上重复单位的数目 及重复单位的序列都有可能不完 全相 同 , 造 成 每 个 座 位 上 的 多 态 性 。这种多态性的信息量是比较 高的 。由于每个微卫星 DNA 两端 的序列多是相对保守的单拷贝序 列 ,可根据其两端的序列设计一对 特异的引物 , 通过扩增而产生多态 性 。微 卫 星 DNA 具 有 所 有 RFLP 的遗传学优点 , 且避免了 RFLP 方 法中使用放射性同位素的缺点 , 又 比 RAPD 重复率和可信度高 , 因而 成了遗传标记中的热点 。微卫星
DNA 已应用于蕃茄 、 大豆 、 水稻 、 玉

米、 芸薹属和拟南芥属等许多作物 中 。通过对微卫星 DNA 序列的研 究 ,相应产生了使用人工合成的寡 核苷酸作探针的方法 , 这种方法也 可检测到大量的多态性 。微卫星
DNA 是目前极受欢迎的指纹图谱

技术 ,但这种方法必须针对每个染 色体座位的微卫星 , 发现其两端的 单拷贝序列才能设计引物 , 这给微 卫星标记的开发带来一定的困难 。 这项技术在商业上还没有完全应 用 , 仅 发 现 了 一 些 有 用 的 SSR 引 物 ,其巨大的利用价值等待研究者 的开发 。

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过选择性扩增基因组 DNA 的酶切 片段而产生多态性 , 选择性扩增是 通过在引物的 3′ 末端加上选择性 核苷酸而实现的 。通过改变选择 性核苷酸的数目 , 就可预先决定所 要扩增的片段的数目 。AFLP 方法 可以分析基因组 100 ~ 150 个扩增 物 。因而非常适合于绘制品种的 指纹图谱及进行分类研究等工作 。
AFLP 虽产生不久 ,却受到了广泛的

种及育种家的权益 。因此 , 作物品 种的鉴别技术需具备 4 个基本准 则 : 即环境的稳定性 、 品种间变异 的可识别性 、 最小的品种内变异及 实验结果的可靠性 。在品种的鉴 别上 , 随着育种进程的加快 , 作物 品种急剧增加 , 仅就小麦而言 , 其 品种就多达 1 万余种以上 , 这对品 种的 鉴 别 就 提 出 了 更 高 的 要 求 。 指纹图谱技术 , 不仅完全符合作用 品种鉴别中的 4 个基本准则 , 而且 在相对于早期的形学标记 , 又具有 简便 、 迅速等优点 。因而 , 是作物 品种评价鉴定中较好的遗传标记 。 在我国建立主要作物品种的标准 指纹图谱 , 对保护我国名 、 、 优 特种 质及育成品种的知识产权和育种 家们的权益均有重要意义 。
21 品种纯度和真实性检验

重视 , 已 应 用 于 拟 南 芥 、 豆 、 大 水 稻、 玉米 、 棉花等作物上 。研究表 明 ,AFLP 产生的多态性远远超过了
RFLP 、 RAPD 等技术 ,被认为是指纹

图谱技术中多态性最丰富的一项 技术 。由于 AFLP 已申请专利 , 在 生产及商业上的应用受到了限制 。
61 ISSR 方法 ISSR 方法创建于 1994 年 , 是

在 PCR 技术基础上发展起来的一 种检测方法 ,它继承了 PCR 技术的 高效率 、 DNA 样品用量少 、 特异性 强和检测方便等优点 , 更比 RAPD 技术有明确的针对性 , 因为其扩增 位点 是 基 因 组 内 的 微 卫 星 DNA 。 同时 ,由于 PCR 扩增条件中的退火 温度较高 ( 一般为 50 度左右) ,其稳 定性和重复性也好于 RAPD 技术 。 与 SSR 相比 , ISSR 标记无需预先知 道微卫星的侧翼顺序 , 且一次扩增 的位点在 3 — 个左右或更多 ,多态 8 检出率高 , 信息量明显高于 SSR 。 但 ISSR 与 RAPD 相似 ,不能提供检 测位点的纯合与杂合状态 。

许多原因可能导致作物品种、

品系或自交系的杂化 , 即遗传变异 的增 加 , 对 此 需 要 进 行 有 效 的 监 测 。在育种上 , 也需要知道新育成 的品种品系的遗传纯度 。遗传纯 度的测定需要对基因组具有代表 性的遗传标记 , 指纹图谱由于其高 度的个体特异性 , 甚至可以监测到 基因组中一些微小的变异 , 因而是 十分理想的遗传纯度的检测技术 。 在种子生产和贸易中 , 对种子质量 最主要的要求之一 , 就是种子的纯 度和真实性 。种子公司检测种子 纯度和真实性的传统方法是生长 测验 , 就 是 把 有 代 表 性 的 种 子 播 种 ,通过成株的表型来判断真伪及 纯度 。这种检测方法费工 、 费时 , 且检测结果易出偏差 。指纹图谱 简便 、 、 快速 准确等特点 , 远远优于 传统的生长测验 。采用指纹图谱 技术 ,建立一套主要作物的标准指 纹图谱 ,对于防止伪劣种子流入市 场 , 提高种子市场的种子质量 , 意 义十分重大 。

二、 DNA 指纹图谱在农作

物品种鉴定中的应用
11 新品种登记和品种鉴定

新品种审定前 , 需要确定该品

gene 公司发明的 。AFLP 以 PCR 为

基础 , 实际上是 RFLP 和 PCR 相结

合的一种方法 。其基本原理是通

{ ο  

AFLP 技术是 1992 年荷兰 Key2

种的遗传特性 、 一致性和稳定性 , 找到该品种区别其他已有品种的 特征 , 在新品种登记时 , 作为该品 种的专有 “代号”保护新育成的品 ,

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程度可以判断品种间亲缘关系的 远近 , 测量品种间的遗传距离 , 进 行系谱分析 。Halward 1992 年利用
10 个 RAPD 随机引物对花生的 29

个野生种基因组分别进行了检测 , 并根据 10 个引物在 29 个野生种基 因组扩增产物 DNA 条带的统计 ,利

用计算机对这些数据进行分析 , 建

立了这 29 个野生种的亲缘关系图 及它们的相对遗传距离 。结果表 明 ,利用 RAPD 获得的 29 个花生野 生种的分类与经典方法得到的结 果基本一致 。确定亲本间的亲缘 关系并据此对其进行分类 , 对科学 地配制杂交组合等方面具有重要 作用 。如玉米传统鉴定自交系的 方法是靠配制大量的杂交组合 , 根 据 F1 的表现来评价自交系和确定

杂交组合 , 十分繁琐 , 而利用指纹 图谱技术就可以简便 、 快速 、 准确 地鉴 定 自 交 系 , 指 导 配 制 杂 交 组 合 。目前 ,蛋白质指纹图谱在国际 些初步的研究 ;DNA 指纹图谱在国 面的报道极少 。因此 , 迅速开展我

上已较广泛应用 , 而在国内只有一 际上也只是刚刚起步 , 国内在这方

国主要作物品种指纹图谱的研究 工作 ,建立我国主要作物品种指纹 图谱数据库 , 是十分必要和切实可 行的 。

业的应用
专利权

种只需要提供一些表型数据 , 但当 品种间的差异较小时 , 人们对传统 的表型检验方法普遍感到不足 , 有

31 品种的亲缘关系和分类研

时还会因品种的发明权而发生争 议 ; 同时由于基因工程的发展 , 生 物工程专家可对一个优良品种进 行极小的改变 ( 如改变一个基因) 。 那么 ,被改变的品种又可能以一个 新的面貌出现 , 若这种改变不是表 型可见的 , 传统差别方法对差别新 品种就无能为力 。随着国际社会 对知识产权的更加重视和不断强 调 ,人们迫切希望保护自己的发明 权 ,但前提是发明人必须拿出证据 以证明自己的品种在哪些方面与 众不同 。针对以上问题 , 分子标记 可作为判别植物新品种的新手段 。 因为分子标记的指纹图是根据每 个品种的 DNA 组成 ,用可见的条码 式的谱带图谱进行检测的一种方 法 。它提供的证据是新品种的基 因型 , 是稳定的 DNA 带谱 , 不受栽 培条件影响 , 并可通过计算机进行 系统管理 。如对某作物新品种作 出的 DNA 指纹图谱等信息 ,通过输 入计算机与其他品种进行比较 , 鉴 定其在 DNA 水平的异同和特点 ,以 达到认定和保护的目的 。 是杂交品种的纯度鉴定
21 分析和检验种子纯度 , 尤其

由于其为基因表达加工后产物 , 仅 是 DNA 全部多态性的一部分 ,而且 其特异性易受环境条件和发育阶 段的影响 , 这对遗传变异的检测就 远不 及 分 子 标 记 分 析 得 快 速 、 准 确 、 。分子标记可从植物体任 可靠 何部位提取 DNA , 尤其是从幼苗或 种子中提取 DNA 进行种苗品质的 早期鉴定分析 , 克服了其他遗传标 记随环境条件或组织发育阶段而 异的 缺 陷 。同 时 , 其 可 供 检 测 的
DNA 标记的数量从理论上是无限

根据各品种指纹图谱的差异

的 ,这是形态 、 细胞 、 生化等遗传标 记所无法比拟的 , 从而 , 为进行各 种物种多态性分析和种子纯度鉴 定 ,奠 定 了 坚 实 、 靠 、 定 的 基 可 稳 础。

四 、 NA 指纹图谱在应用 D 中存在的问题和要解决 的 关 键环节
DNA 指纹图谱虽然在植物系

统学研究中得到广泛应用 , 但大多 数的研究仍停留在实验室阶段 , 以 及探索性地进行辅助育种工作 , 将 这一技术用于大规模的辅助育种 和种子鉴定还需一定的过程 。而 最重要的是要解决两个方面的关 键技 术 : 一 是 确 立 高 效 、 确 、 准 经 济、 简便的基因检测系统 , 包括基 因鉴定 、 标记及作图技术 ; 二是广 泛挖掘 、 鉴定 、 利用与作物高产 、 优 质、 抗病虫 、 抗逆性有关的新基因 , 进行各种基因的标记和定位 。毋 庸置疑 , 在不久的将来 , 随着我国 科学技术的发展 , 该技术必将广泛 应用于农业科研 、 生产等方面 , 为 我国农业的发展发挥重大的作用 。
( 作者单位 : 国家农业标准化监测

随着一些重要的农作物 , 如玉

米、 、 水稻 油菜 、 大白菜 、 西红柿 、 向 日葵 等 , 已 在 生 产 中 推 广 了 杂 交 种 , 为了保证种植者的利益 , 种子 纯度测验已成为育种单位 、 制种单 位、 种子经营部门的日常业务和控 制种子质量的关键环节之一 。近 几年来 ,为了克服常规形态鉴别技 术的局限性 , 在农业上曾使用同工 酶和种子蛋白电泳技术进行种子 鉴别 。种子蛋白和同工酶作为基 因的产物 , 其结构的多样性在一定 程度上能反映生物 DNA 组成上的 差异和生物体的遗传多样性 。但

三、 DNA 指纹图谱在种子

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11 绘制新品种的指纹图 , 保护

长期以来 , 判别一个作物新品

与研究中心)

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