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牛胚胎移植


牛胚胎移植技术操作规程 文章来源:青海畜牧兽医杂 2003-1-9 11:58:00 点击数: 更新时间: 志 2278 文 评论本

王统华,张宝文,张国仓,王文奎

(青海省大通县草原站,桥头镇,810100)

摘要:牛胚胎移植技术,已开始应用于牛的改良和品种引进中,是养牛业今后必须采用的一项新技术 之一。

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关键词:牛;胚胎移植;规程

中国分类号:S814.6

文献标识码:C

文章编号:1003-7950(2002)06-0044-02

牛的胚胎移植,在操作过程中技术要求高,通过我县牛胚胎移植技术的推广,现将牛胚胎移植技 术操作规程介绍如下,供参考。

1

主题内容与适用范围

1.1

本规程规定了牛胚胎移植技术操作的基本原则、要求和方法。

1.2

本规程适用于牛胚胎移植技术推广应用的规范化操作。

1.3

本规程应用冻胚进行牛胚胎移植。

2

受体牛的选择标准

2.1

年龄在 3~8 岁,健康,无疾病,体格较大,膘度好。

2.2

繁殖性能正常,产后 60d 以上,并有两次以上的正常自然发情记录。

2.3

泌乳性能好,无难产史,不使用两次人工受精未孕的牛。

3

受体牛的饲养管理

3.1

做到精心管理,合理饲养,环境清洁,饲草、饲料、饮水要新鲜,补充食盐和必要的添加剂。

3.2

组成一定数量的牛群。圈舍内防止过挤,以便于发情观察。

3.3

农户长期舍饲的母牛要注意加强运动。

3.4

防止在移植前后因饲料及环境改善造成的应激反应。

4

受体牛的同期发情

4.1

使用前列腺素(PGF2α)一次肌注,诱导发情。给处于情期 8~15d 且直肠检查黄体的受体牛一

次注射 PGF2α。

4.2

两次 PGF2α 处理。在不考虑发情周期的情况下,可间隔 11d,前后两次肌注 PGF2α。

5

发情观察

原则上根据母牛接受爬跨确认为发情、早、晚各观察 30min 发清情况。对发情牛需做直肠检查, 以确认卵泡,次日上午或晚上做直肠检查确定是否排政若在发情后 36h 以后排卵的牛不能用作受体牛。

6

冷冻胚胎的解冻

6.1

三步平衡法冻胚的解冻

6.1

解冻液的配备:将 10%、6%和 3%甘油的 PBS(培养液)保存液,用 0.22/m 滤器灭菌,分装

在小培养皿内, 1 杯为含 10%甘油的 PBS 保存液, 2 杯为含 6%甘油的 PBS 保存液, 3 杯为含 3% 第 第 第 甘油的 PBS 保存液,第 4 杯为不含甘油的 PBS 保存液。

6.1.2

胚胎的解冻:胚胎从液氮中取出在 3s 内投入 38℃水浴浸 10s。

6.1.3

三步脱甘油:用 70%酒精棉球消毒解冻后塑料吸管和剪刀刀刃,剪去棉塞端,与带有空气的

1ml 注射器连接上。再剪去吸管的另一端,在室温下将胚胎推入 10%甘油和 0.3mol/L 蔗糖 PBS 保存 液中,放置 5min,以后陆续移入 6%和 3%甘油蔗糖的 PBS 保存液中,各放置 5min,最后移至不含甘

油的 PBS 保存液中镜检待用。

6.2

一步吸管法解冻

6.2.1

解冻方法:从液氮中取出装有胚胎的塑料吸管,投入 37~38℃温水中,水浴 10s。

6.2.2

脱甘油:手提塑料吸管、棉塞向下甩 2~3 次,将气泡甩向棉塞端,使蔗糖液和保存液混合。

或者用手指轻弹气泡,使两种液体混合,将棉塞向下直立 10min。

6.2.3

观察胚胎:用特制塑料吸管观察镜或显微镜的目镜,通过塑料管壁从上到下转动观察胚胎的

形态和位置,确定后用 70%酒精棉球消毒并切除吸管上层 Icm,切口要平整,可直接用于移植。

7

胚胎的鉴定

7.1

在 100~200 倍实体解剖显微镜下观察受精卵的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、细胞的密

度、与透明带的间隙以及变性情况等。

7.2

凡卵子的卵黄未形成分裂球及细胞团的,均列为未受精卵。

7.3

胚胎的发育阶段:通常受精后 6~8d 非手术回收的正常受精卵发育情况如下。

7.3.1

桑椹胚一发情后第 5~6d 回收的卵,只能观察到球状的细胞团,分不清分裂球,占据透明带

内腔的大部分。

7.3.2

致密桑椹胚一发情后第 6~7d 回收的卵,细胞团变小,占透明带内腔 60%~70%。

7.3.3

早期囊胚一发情后 7~8d 回收的卵,细胞的一部分出现发亮的胚泡腔。细胞团占透明带内腔

70%~80%,难以分清内细胞团和滋养层。

7.3.4 脏。

囊胚一发情后第 7~8d 回收,内细胞团和滋养层界线清晰,胚泡胜明显,细胞充满透明带内

7.3.5

扩大囊胚一发情后第 8~9d 回收,胚泡腔明显扩大,体积增大到原来的 1.2~1.5 倍,与

透明带之间无空隙,透明带变薄,相当于正常厚度的 1/3。

7.3.6

孵育胚—一般在发情后 9~11d 回收的受精卵,由于胚泡腔继续扩张,致使透明带破裂,卵

细胞脱出。

7.3.7

凡在发情后 6~8d 回收的 16 细胞以下的受精卵均应列为非正常发育卵,不能用于移植。

8

胚胎分级

8.1 A 级一胚胎形态完整,轮廓清晰,呈球形,分裂球大小均匀,结构紧凑,色调和透明带适中,无 附着的细胞和液泡。

8.2 B 级一轮廓清晰,色调和细胞密度良好,可见到一些附着的细胞和液泡,变性细胞约占 10%~ 30%。

8.3 C 级一轮廓不清晰,色调发暗,结构较松散,游离的细胞或液泡较多,变性细胞达 30%~50%。

8.4

胚胎的等级划分还应考虑到受精卵的发育程度。发情后第 7~8d 回收的受精卵在正常发育时应

处于致密桑植胚至囊胚阶段。凡在 16 细胞以下的受精卵及变性细胞超过 1/2 的胚胎均属等外。

9

移植

9.1

待移植受体牛检查 要求受体牛发情时直肠检查的卵泡直径在 10~20mm 左右,发情后 36h 出现

排卵。移植前直检黄体,其直径在 11~15mm 以上,黄体的手感性好,质地软而充实。

9.2

受体牛的准备 将受体牛保定,清除粪便,肌注 2%静松灵 1ml 或用 2%的普鲁卡因 3ml 在 l~2

尾椎间硬膜外麻醉。清洗外阴,用高锰酸钾水冲洗消毒,用灭菌纸擦干,最后经酒精棉球消毒。

9.3

器械准备 仿西德式金属移植器,先将移植枪、抢头及金属保护外套分别用纸包扎好,高压消毒。

塑料卡苏式移植枪需经气体灭菌。 移植时先用 70%酒精棉球消毒装有胚胎的塑料吸管, 然后剪掉封口一 端,装入移植枪内,套上保护外套。

9.4

移植前胚胎装管

胚胎移植时可用 0.25ml 吸管分三段吸入 PBS 保存液,中间由两个气泡隔开,

中段含有胚胎。也可用小汽泡分成多段装管,胚胎在中段。一步吸管法解冻脱甘油后,用酒精棉球多 次消毒吸管,剪去封口即可用于移植。

9.5

移植

术者用左手扒开外阴,右手持移植器插入阴道,然后左手伸进直肠,移植器到达子宫颈

口时,右手用力将移植枪捅破外套填片,插入子宫颈。左手在直肠内诱导使枪头轻轻稳妥地插入黄体 例子宫角至大弯处,持移植器的右手推出胚胎,缓慢旋转地抽出移植枪。

10

妊娠诊断

10.1

直肠检查法

通常在移植后 3 个月开始检查。妊娠 90d 时,子宫继续增大,落入腹腔,可感

觉到胎儿的浮动,孕角出现孕脉,子宫壁可触到子叶。

10.2

超声波诊断(B 超)对妊娠 25d 以上的受体牛可用 B 超检查。


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