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豆豉中黄曲霉毒素B1测定方法研究---科标化工分析


豆豉中黄曲霉毒素 B1 测定方法研究---科标化工分析
摘要 用间接竞争性 ELISA 法测定豆豉中黄曲霉毒素 B1(AFB1),结果为阳性,用荧光检测器测 定的 HPLC 方法验证,结果为假阳性。ELISA 法测定 AFB1 步骤简便、快速、操作安全,但对豆 豉样品容易产生假阳性,需要通过 HPLC 方法确认。建议豆豉样品不宜采用 ELISA 测定黄曲霉毒 素 B1。

关键词 黄曲霉毒素 B1 酶联免疫吸附法 高效液相色谱 豆豉 黄曲霉毒素(Aflatoxin,AF)是真菌毒素中毒性最大的一种,是世界上公认的最强化学致癌 物质,危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用,严重时,可导致肝癌甚至死亡.,1993 年被 WHO 癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物。在天然污染的食品中存在的黄曲霉毒素以 B1(AFB1,结构 如图 1)污染最多见,其毒性和致癌性也最强。要严格控制食品中黄曲霉毒素的含量,必须要有 快速、灵敏、准确、有效的分析测定方法作保证。
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图 1 黄曲霉毒素 B1 分子结构式 (Fig1. structure of aflatoxin B1 AFB1) 目前检测 AFB1 的方法主要有酶联免疫吸附法,薄层色谱和高效液相色谱法。酶联免疫吸附 法[1-3]是目前测定黄曲霉毒素 B1 的快速方法,灵敏度高、检验速度快、操作安全,成本低, 由于该方法是生物化学法,具有对酸对盐敏感的特点,易出现假阳性结果, 需要结合其他分析 方法进行确认如同位素稀释质谱[4]、薄层色谱[5]、HPLC/MS[6]和免疫亲和净化法[7]等。高效 液相色谱法[8, 9]测定黄曲霉毒素具有准确度高、 精密度好的特点, 主要用于测定粮谷[10-12], 玉米[13]、花生[14]、中药[15]中黄曲霉毒素 B1。在进行无公害食品-豆豉的认证过程中,按 国家标准[16]利用酶联免疫方法对豆豉样品中 AFB1 残留的测定,结果为阳性,通过选择最佳色 谱条件,在 HPLC 上把干扰物质和 AFB1 完全分离,可以确认豆豉中 AFB1 为假阳性,对于其他豆 豉样品也有类似情况存在, 建议豆制品不宜采用 ELISA 方法进行测定, 有条件实验室宜采用 HPLC 方法直接进行测定。 1.实验部分 1.1 仪器及试剂 Model 680 酶标仪(Bio-Rad 公司) ,酶标微孔板(96 孔) ,恒温水浴锅,恒温培养箱, 微 量加样器及配套吸头, Alliance 2695 高效液相色谱仪(Waters 公司),配置四元泵溶剂淋洗 系统,自动进样系统,2475 荧光检测器, Sartorius 纯水器(Germany 公司)。试剂:三氯甲烷 (分析纯) ,甲醇(分析纯) ,乙酸(优级纯) ,甲醇和乙腈(Fisher, HPLC 级) 。黄曲霉毒素 B1 试剂盒(北京百林康源生物有限公司)包含:PBS-T 洗液,抗体,酶标二抗,阴性对照液,底 物,底物液 A,底物液 B,终止液。
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1.2 样品溶液制备及测定 准确称取 20g 粉碎样品于 250mL 具塞锥形瓶中,准确加入 60 m L 三氯甲烷,盖塞后滴水封 严。150r/min 振荡 30min.。静置后,用快速定性滤纸过滤于 50m L 烧杯中。立即取 12m L 滤液 (相当 4.0g 试样) 75m L 蒸发皿中, 于 60℃水浴通风挥干。 2.0mL20%甲醇—PBS 分三次( 用 0.8m L、0.7m L、0. 5 m L)溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物,移至小试管,加盖振荡后静置分别用 ELISA 和 HPLC 进行测定。 1.3 ELISA 测定方法 抗体抗原反应:将稀释过的抗体与等量样品提起液在玻璃管内混合震荡后室温静止 15min。 此液用于测定试样中黄曲霉毒素 B1 含量。 封闭:已包被的酶标板用洗液洗 3 次 X2 min 洗板后在吸水纸上拍干,分别在适当孔位加入 样品的抗体抗原反应液及空白对照液和阴性对照液,130?L /孔,置 37℃湿盒中孵育 2h 后,倒 掉反应液,用 PBS-T 洗液 3 次 X3min 洗板后拍干。 酶标记反应:加入经稀释后的酶标二抗,100?L/孔,置 37℃湿盒中孵育 1h 后,倒掉反应 液,用 PBS-T 洗液 5 次 X3 min 洗板后拍干。 显色反应:待底物充分溶解后加入酶标板,100?L/孔,置 37℃反应 15min 后,加入终止液, 40?L /孔。 测定:酶标仪设置 490 nm 测出 OD 值。根据标准竞争抑制曲线图(ELISA 试剂盒中带有) 求出待测样品 AFB1 含量。 最低检测限为:0.01 ?g/kg。 通过该法测定豆豉中黄曲霉毒素 B1 结果为 57?g/kg。 1.4 HPLC 确认 待测液经 0.45?m 滤膜过滤,取 10uL 进样,测定峰面积,按外标法定量。色谱条件:色谱 柱 Symmetry Shield (4.6×250 mm,5?m),流动相:甲醇+0.1%醋酸+乙腈(20:65:15,V:V)为 流动相, 柱温 30℃, 流速 1.2mL/min, 2475 荧光检测器, 激发波长和发射波长分别为 336 nm, 445 nm,进样 10?L。 2.结果与讨论 2.1 ELISA 试剂盒优点 检测灵敏,最低检测限为 0.01 ?g/kg,是 HPLC 方法的 100 倍,而且该方法不需要使用黄曲 霉毒素 B1 标准品,从而保证操作者的人身安全,安全性能高,检测样品数量大,一次能测 定 92 个样品。 2.2 HPLC 分离条件选择 通过对比 symmetry shield (4.6×250 mm,5?m)和 Novapak (3.9×150 mm,5?m)在不同流 动相比率和不同流速条件下 AFB1 和豆豉样品的分离条件,寻找豆豉样品和 AFB1 的最佳分离条 件。由于 AFB1 含有二羰基化合物,有活泼氢,拖尾严重,为改善峰形,需在流动相中加入少量 酸。在短柱 Novapak (3.9×150 mm,5?m),流动性为甲醇+0.1% 醋酸(65%:35%,V/V)中,AFB1 和杂质出峰时间相邻很近;在 symmetry shield (4.6×250 mm,5?m),流动相为甲醇+0.1% 醋 酸+乙腈(20%:65%:15%,V/V) ,AFB1 和干扰物质能完全分离,如图 2,AFB1 在 14.926min 出峰, 杂质在 10.657min 出峰,证明该物质为豆豉中本底干扰物质。
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8.00

6.00 F luorescence

AFB1 - 1 4 .9 2 6

50.00

40.00 F luorescence

20.00 2.00

12.233

10.00

10.675

4.00

30.00

0.00

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00

13.181
14.00

16.00

图 2,AFB1 标样和豆豉样品色谱图(Fig 1 the chromatography of standard solution of AFB1 and lobster sauce) 2.3 定量标准曲线、检出限及日内稳定性实验, 配置浓度为 3, 30, 60, 300, 600?g/L 的 AFB1 标准溶液,取 10?L 进样,测定峰面积,以峰 面积对浓度作曲线。计算出回归方程,AFB1 在 0~600 ?g/L 线性关系良好。在所选条件下,回 归方程分别为 Y=5.59e+004X (相关系数 r=0.9941) 。根据信燥比 S/N=3,测得 AFB1 的仪器最 低检出限 LOD 为 1.0 ?g/L。分别测定 AFB1 的精密度和日内稳定性,7 次测定峰面积的相对偏差 小于 1.5%,每 1 小时进 1 次,8 小时内峰面积的相对偏差小于 1.97%。说明 AFB1 在常温下较稳 定,不容易分解(注避光条件下) 。 2.4 样品的测定 在其他三个无公害认证产品豆豉样品中通过 ELISA 方法测定结果都出现假阳性,结果 从 0.3-80 ?g/kg 含量高低不一。 通过市场买到的豆豉样品中, 也有同样问题存在, 都需要通过 HPLC 进行确认。 3 小结 由于荧光检测器只对带荧光基团的物质有响应,在 HPLC 上干扰很小(有一个干扰物质) , 很容易分离,结果准确、可靠。在豆豉中有某种物质在 ELISA 中会发生显色反应,出现假阳性 结果。所以豆豉不适宜使用 ELISA 方法进行测定,建议直接使用 HPLC 进行测定。

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