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考马斯亮蓝法测定蛋白质


考马斯亮蓝法测定蛋白质
考马斯亮蓝法 G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结 合法的一种。在游离状态下呈红色,最大光吸收在 488nm;当它与蛋白质结合后变为青 色,蛋白质-色素结合物在 595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正 比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝 G-250

结合在 2min 左右的时 间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下 1h 内保持稳定。该法是 1976 年 Bradford 建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比 Lowry 法还高 4 倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为 0~1 000μg/mL,最小可测 2.5μg/mL 蛋白质,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程 该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不适用于小分子碱性 多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过 0.2%影响测定结 果。如 TritonX-100、SDS、NP-40 等。 1.Bradford 浓染液的配制:将 100mg 考马斯亮蓝 G-250 溶于 50m1 95% 乙醇,加入 100ml 浓磷酸,然后,用蒸馏水补充至 200ml,此染液放 4℃至少 6 个月保持稳定。 2.标准曲线蛋白质样本的准备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质 作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未 知的,也可用抗体作为标准蛋白。通常在 20ug—150ug/100ul 之间绘制标准 曲线。 3.将待测样本溶于 100~1 缓冲溶液中,该缓冲溶液应与制作标准曲线的 缓冲溶液相同(最好用 PBS)。 4.按 1:5 用蒸馏水稀释浓染料结合溶液,如出现沉淀,过滤除去。 5.每个样本加 5ml 稀释的染料结合溶液,作用 5~30min。染液与蛋白 质结合后,将由红色变为蓝色,在 595nm 波长下测定其吸光度。注意,显色 反应不得超过 30min. 6.根据标准曲线计算待测样本的浓度。 注意: 考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合,反应快速,并且稳 定,无法用普通试剂洗掉。待一两周左右,皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。


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