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纤维素降解菌筛选的研究进展


《 现代 农业 科技 ) 0 8年 第 2 期  20 1

工作研 究 

纤维素降解 菌筛选 的研 究进展 
贾 丙志 , 范运 梁  程 文静 
( 山 东 师 范 大 学 生 命 科 学 学 院 , 东 济 南 20 1   山 东 交 通职 业 学院 ) ’ 山 50 4;  

摘 要 从

纤 维素 降解 菌种 类 、 变筛选 、 因工程 筛选等 方 面对 纤维 素降 解茵 筛选 的研 究进展 进 行 了概述 , 诱 基 以供 参 考。   关键 词  纤 维素 降解 茵 ; 纤维 素酶 ; 变 ; 因工 程  诱 基   ’ 中图分 类号 S 8  文献 标识 码 A  文章 编号  1 0 —5 3 (0 8 2 一O 1 —0  12 0 7 7 9 20 ) 1 3 5 1

纤 维 素 作 为一 种 可 再 生 资源 , 国农 业 和 工 业 生 产 中  我

维 素 的降 解 能 力1  4 1 。
3 纤维 素降 解菌 基 因工 程筛选 研究 进展  因为 纤 维 素降 解 菌 诱 变 筛选 具 有 一 定 的 局 限性 , 以  所

每年 可 制造数 百万 吨的农 作物 秸秆 和纤 维素 废弃物 , 而 由  然 于 难 以大量 被 动物 分 解 利用 , 当一部 分 被 焚烧 或废 弃 。 相 如 
何 有 效 地 开 发 利 用 纤 维 素 资 源 已成 为 当 今 研 究 的热 门课 

人 们 期望 通 过定 向进 化和 分 子改 造 的基 因 工程方 法 筛选 到  重 组 型高 比活 力 的产 纤 维 素酶 菌株 。 目前 , 已经利 用 基 因工  程 技术 将纤维 素酶 的基 因克隆 到细 菌 、 酵母 、 菌和植 物 中 , 真  
取 得 了一定 的进 展 。  

题 。 维 素 的分解 主 要依 靠 纤维 素降 解 菌 产生 的 纤维 素 酶 , 纤  

因此如 何 筛 选 出 高效 的纤 维 素降 解 菌株 又成 为 关键 环 节 。  
笔者 对纤 维 素降 解菌 的研 究状 况进 行 了概 述 。  
1 纤维 素 降解菌 的 种类 

在 国外 , i 等克 隆了 Aq ifs eoi s F 编 码 E Km uxe arl u  5   c V G的  Ce 8 l Y基 因 , 并在 Ecl 1 Bu . i 一 le中 表达成 功 。 C L Y 有  o XL 酶 E8 很好 的耐热性 , 最适作 用温度为 8 ℃和 p 0 H值 7 。 o d等在  .W o 0
大 肠杆 菌 E. iKol 表达 了 E v i C r a t m 8 0 1 c l l中 o  ni a hy n e i 6 2 的  n  s h P

自2 0世纪 6 代 以来 , 内外共 报道 数 干个 产纤 维 素  0年 国
酶 的菌株 , 隶属 于 5 3个属 。 大致 分 为以 下几 类I  】 I 。
11 细 菌  .

细菌 一 般是 单细 胞 的 , 由于体 积 小 , 菌 具 有较 大 的 比  细 表面 积 。 使 物质 快 速 进 入 细胞 。 要 有 假 单胞 菌属 , 菌  能 主 杆
属中 的芽孢 杆 菌 、 枯草 杆 菌 、 地衣 球 菌 。  
1 . 放 线 菌  2

葡 聚 糖 内 切 酶基 因 , 终得 到 的重 组 纤维 素酶 在 每升 培 养  最 基 中可产 生 高达 32 0u嘲   OI 。 ,   在 国 内 , 永 生等 首 次从 具 有降 解天 然纤 维 素稻 草 粉 、 刘   甘蔗 渣粉 活性 的地 衣芽孢 杆菌 G XN1 1中分离 、 隆 出 8 5 克 个  能够 表达 羧 甲基 纤维 素酶 活基 因 , 中一 个克 隆 p XNL 上  其 G 2
的 clA基 因 12 P 可 编码含 5 2个 氨基酸 的羧 甲基 纤 维  e 5 6 6 b, 4

放 线 菌 能 形成 芽孢 . 真 菌 相 比较 耐 高温 和 各种 酸 碱  与 度 , 在高 温阶段 放线 菌对 分解 木质 素和 纤维 素起 着重要 的  故 作 用 。 要 有 诺 卡 氏 菌 属 、 杆 菌 、 霉 菌属 、 温 放 线 菌  主 节 链 高 属、 小单 胞 菌属 。  
13 真 菌  .

素酶 。 些克 隆都 在 含 CMC 的 L 这 A平板 上 表达 CMC e 活  as
性 , 明 克隆 的 基 因可 以在 大 肠杆 菌 中表 达 且表 达 的 产 物  说

可 以被 大肠杆 菌 的分泌 系 统分 泌到胞 外嘲   。 大 连轻 工 业 学 院在 国家 自然 科学 基 金 的有 力 支 持 下 ,  

真 菌是 自然 界中纤 维素 物质 的主 要降解 者 。 主要 有 绿色  木霉 、 毛 壳 、 白卧 孔 菌 、 色 多孔 菌 、 皮侧 耳 、 霉 、 球 黄 变 粗 青 曲  霉 、 曲霉 、 曲霉 、 枣 曲霉 、 抱 曲霉 等 。 黑 米 海 棘  
2 纤 维素 降解 茵诱 变 筛选 研 究进展 

开展 了纤 维素 的降解 机理及 纤 维素酶 的 系列研究 , 土壤 中 从  
分 离纯 化 出 2株 国际 未 知 的纤 维 素降 解 新 菌 , 株 是 能够  一 将 天然 纤维 素 快速 降解 的 C tp a yo h t a新种 , 这种 菌对 纤 维 素  降 解起 关 键 作 用 的 是纤 维 二 糖 氧化 酶 。 一株 是 能 够 彻底  另
降解 纤 维 素 的 放线 菌 , 系 统 分类 学 鉴定 和 分 子 生物 学 比  经

纤 维 素降 解 菌 的诱变 主 要包 括 物理 诱 变和 化 学诱 变 罔  。 物 理 方 法 效 果 较 好 的 有紫 外线 、 线 、 x射 仅射线 、  射 线 、 快 
中子 。 用 的化 学 诱变 剂 有烷 化 剂 、 常 碱基 类 似物 、 脱氨 剂 ( 如 

较, 被确 定 为新 菌 , 定 名 为 Srpo cs euo ti S相  并 t tmye  U ll gC , e c y U 关 的分 类学 特征 已在 国际 微生 物协 会 新发 现 菌指 定登 录 杂  志《 国际微 生 物进 化 与系 统分 类 学》 上公 布 , 到 国际 承 认 , 得   已被列 入 国际微生 物新 菌 目录 。 对该 菌纤维 素降 解过 程 中  在 的研 究 中 , 发现 有 2种酶 对 纤维 素 降解 起 关键 作 用 。 种是  一 内切 葡聚 糖 s酶 , 酶 同时 具 有纤 维 外切酶 和 纤 维 内切酶 2 该   种 酶 活性 , 是纤 维 素骨 架 结构水 解 过程 中的主 要酶 催化 剂 。   另一 种是纤 维 素液 化酶 ( 定名 为 C2酶 )是 一 种低 分子 量 的  , 蛋 白酶 , 在纤 维素 降解 的起 始 过程 中发挥 关键 作 用 。  

亚硝 酸 ) 。 实 践 中 , 等 在 物理 和 化学 诱 变 剂经 常结 合使 用 , 效 
果 更 好 一 些 。 年 来 , 国学 者采 用 不 同的 理 化 方 法 对 菌  近 我
株 进 行 选 育 , 得 了 不 错 的效 果 。 时 乐 等 采 用紫 外 线 、 取 兰 亚  硝 基 胍 、 酸 二 乙 酯 和 LC1 合 诱 变 能 显 著 提 高 T 0 硫 i 复 P 1纤 

维 素酶 的产 量 , 在最佳 发 酵条件 下 , CMC s 和 F as 出发  ae Pe 是 菌株 的 3 和 6倍 I 毛 培 宏等 通 过低 能 N  倍 引 。 注入 枯 草芽 孢 杆  菌 Hy , 育 出了 C 2选 MCae F A分 别 提 高 25倍 和 41倍  s和 P . . 的纤 维 素酶 组 成 型 突 变株 Hy - 3 1 并 研 究 了 H 2 3 1  2 31, y -31 的酶 系组 成 和 酶 学 性 质 , 现 Hy — 3 1的酶 系发 生 了很  发 2 31 大 的 变化 , 且各酶 纯 组分 的 酶学 性 质也 发 生了 变化 , 仅  并 不 提 高 了对可 溶性 纤维 素 的降 解 能 力 , 提 高 了 对 不 溶 性 纤  也
收 稿 日期  20 - 9 4 08 0 —0 

为获 得 可 用 于秸 秆 还 田 条件 下 接 种 、 进 秸 秆快 速 腐  促
解 的混 合 菌群 , 江苏 省 农 业科 学 院 农 业 资源 与 环 境研 究所 
采 用改 良的 P CS培 养 基 , 改 良 P 在 CS培 养 基 的 基础 上 , 通  ( 转第 3 7页 ) 下 1  
31   5

《 代农 业科 技 》 0 8年 第 2 现 20 1期 

堡盟  
1  3 o 0 ( ) 因此 , 温度 控 制不 充 分 而 产 生 的标  0 x = . 6 mL 。 0 3 因 准 不确 定 度 为 0 0  。 T 终 的体 积 为 1. m , 成  . 63 v 最 0 mL 9 3L合 9 各 不确定 度 分量 得 到体 积 v 的 不确定 度 uV )u V ) 2  T (  。(  = ×
( .1  00 63) 00 9 00 2+ .  2= .1mL。 0  

不确 定 度 可 以 通过 合 成 各组 成 元 素 原 子 量 的 不确 定 度 得 
到 。 原 子量 表 中查得 的 Na 从 2 CO, 中各 元 素 的原 子 量和 不确 

定 度如 表 1 示 。 于每 个 元 素来 说 , 准 不确 定度 是 将 元  所 对 标
素的 不确定 度 作 为矩 形 分布 的极 差 计算 得 到 的。 因此 , 应  相

的标准不确定度等于查得数值除以、   。 / 各元素对摩尔质量 
的贡 献及 其 不确定度 分量 如 表 2 所示 。 2各数值 的 不确 定  表 度 是 由表 1 各元 素 的标 准 不确 定度 数 值乘 以原 子 数 计 算得 
到 的。/  2 12Na CO3 的摩 尔 质量 为 :/   o= / (59 95 + 12 MNc 12 4 .7 4  


5 合 成不 确定 度分 量 的计 算 

CQ H 计算公式 :H: c Q 
—  

!   ! ( LL ,  兰   mo/)表 
1  M N C ,  ̄ OxW  

3 出了 上述 各参数 的 数值 、 准 不确定 度和 相对 标 准不 确  列 标
定度 。   代 入 上述 数 值后 , 到 : H = Q   : 得 cq   Q  
01 7 ( L L   .0  mo / ) 2

1 . 07 0 4 . 8 0 = 2 9   gmo o 2 1   + 7 9   ) 5 . 42 / L . 为各独 立数 值之  0 0 9 2 9 2  ̄式

和, 因此标 准 不确 定度 u M  。 就 等 于各 不确 定 度分 量 平  ( )


:Q   Q QQ

方 和 的平方 根 :  
u M  c ) V o0 00 24+ . 04 00+ . 05 00   ( o  .0  0  2 00  6  2 00  1 。= 0 0


52.   4X1 9   988 4  9.3

6 9 x1  。 . 5  0  

表 3 Ha 标 定 中的数 据 和不 确定度   

表 l 各 元 素 的 原 子 量 和 不 确 定 度 

表 2 各 元素 对摩 尔质 量 的贡 献及 其不 确定 度分 量 
6 标准 不确 定度 合成 

V詈) ) ) ).; -× ( + + + =0co  ( ( ( 010        0u o =
44 体 积 VTB 类 不 确 定 度 ) . (   01 7 = .0  ( L L 。 .0   00 01mo / )  2 7 结 论 


滴 定 过程借 助 于 2mL活塞滴 定 管 。 5 盐酸 溶 液从 活塞 滴  定 管 滴定 的体 积 有 3 不 确 定度 来 源 , 滴 定 管 体 积 的 重  个 即
复性 、 积校 正时 的不确 定度 以及 由实 验室温 度 与活塞 滴定  体

般 来说 , 9%的置信 概 率下 , 含 因子 等 于 2 扩展  在 5 包 ,

不确定度就 等于 0 0 ( o / )用无 水碳酸 钠标 定 0 0  . 0 m LL 。 0 2 .7  1 2
mo /  1 液 的 合 成标 准 不确 定度 为 00 0l L L. L L HC 溶 .  mo / 扩  0 展 不确定 度 为 00 02 L L 用 无水碳 酸钠 标定 盐酸溶 液 的  .  mo / 。 0 不确 定度 为 01 72 00 02 mo / )  .0  ± .0  ( L L 。
8 参 考文 献 
【】 1李慎安 , 昌彦 , 1 施 刘风 . 国家计量技术规范( F 0 9 19 )测量不确  J 15 - 9 9 : J 定度评定与表示【 . : s 北京 中国计量 出版社 ,9 9 】 19 .   【J 2 国家 技 术 监督 局 发 布 . 中华 人 民 共 和 国国 家 标 准 : 品 卫生 检 验 方 法  食 理 化 部 分 【】 京 : 国 标 准 出版 社 ,9 7 S  E 中 19 .   [] 振 字 . 素 相 对 测 量 不 确 定 度 的评 估 Ⅱ. 化 检 验 化 学 分 册 ,0 5 3杨 元 】 理 2 0 
( ):6- 0. 5 3 4  

管校正时温度不一致而带来的不确定度。 ①滴定体积的重复 

性, 已在试验过程通过重复测定考虑 了。 ②校准。 制造商已 
给 定 了滴 定体 积 的准确 性 线 性 范 围 为±( 数值 ) 对 于 2 mL 。 5   活塞 滴定 管 , 型数 值 为± . mL。 典 00 3 假定 为 三 角形 分布 , 标准 

不确定度为 0 3、 6= . 2 L ⑧温度 。 . / / 0 1m 。 0 0 由于对温度缺 乏 
控 制而 产 生 的不确 定 度计 算 。 据 制造 商提 供 的信 息 , 根 该滴  定管 已在 2 ̄ 校准 , 定 实验 室 的温 度 的 波 动范 围 为± ℃  0( 2 标 3
( 置信 水平 为 9 %) 由水 的膨 胀 系 数 21 1 。o 到 :.X 5 。 .X 0 C得 21  
( 接 第 3 5页 ) 上 1  

用 , 人类 造福 。 为   4 参考 文献 
… 1邓强. 蕉秆纤 维素降解菌筛选及酒精 制备研究【 . 香 D】 广州 : 广东工业 
大 学 .0 8 20 .  

过定 期改 变传 代 方法 , 从污 泥 、 林 土 、 酵腐 熟 牛 粪 、 肥  森 发 堆

处理 麦秆 中筛选 出 1 组纤 维 素分 解 能力 强 而稳 定 的纤 维 素 
混合 菌 ( 号 为 Xc ,O mL培 养物 在 3  ̄ 静 置培 养 5 , 代 )lO 7( 2 d 对  滤 纸 纤 维 素 、 脂 棉 、 秆 ( ) 牛 粪 纤 维 素降 解 率 分 别 达  脱 麦 片 、 到 8 %、1 2 %、0 Xc 3 ℃ 、8 分解 滤 纸时 , 1 4 %、5 4 %。 在 7 2 ℃ 分别 在  第 5 第 7天 时 CMC酶 活 性 最 高 , 别 达 到 145U/   、 分 0 .I mL、 9 . U/ 。 初 始 p 值 5 9的培 养 基 上接 种 均 能 表现 出  53 mL 在 I H ~

【 施巧琴 , 松刚. 业微生物育种学【 . 京 : 2 ] 吴 工 M] 北 科学 出版 社 ,0 3 20.   f1 对 乐 , 娴 , 慈 , . 纤 维 素 酶 菌 种 T 1 0 3兰 陈 李 等产 P 22的 选 育 及 产 酶 条件   研 究 田. 技 术 ,0 3 1 ( ) 1-1 . 生物 2 0 ,3 2 :2 3 

【】 4 毛培宏 , 金湘 , 曾宪贤 , 新疆离子柬 生物技 术的研究Ⅱ. 等. ] 生物技 术 ,  
2 0 , 3 4 :0 1 0 3 1 ( ) 5 —5  、  

【jK M   P RK   LM  ,t 1 oigad caat i t n o  5  I JO,A S R,I wJe  . nn  n  hrce zi   f aCl r ao
tem otbe e d gu a ae fo h r s r  n o ic n s  r m te y et em o hlc a h  h p r h r p i  Aq ie   i u fx

较 强分解 能 力 。 采用 变性 梯度 胶 电泳 ( G ) DG E 法比较 来 源 于 
不 同时 期菌群 1SDNA 条带 表 明 , 6r 菌群 结构 稳定 。   总之 , 维素 降解 菌 的 筛选 正在 如 火如 荼 的进 行 着 , 纤 一  旦 取 得 突 破 性 进 展 必 将 使 巨大 的纤 维 素 资 源 得 以 充 分 利 

ao cs 5Ⅱ.ip yi   el u  i VF 】 o hs aR ̄e c  o B c r a h C mmu ct n ,0 0,7 2 : i o n ai s2 0 29( ) 
4 0 2 . 2 -4 6 

【】 永生 , 家勋 , 承 杰 , 能降 解 天然 纤维 素 的地衣 芽孢 杆 菌  6刘 冯 段 等. GX 1 1的分 离 鉴 定 及 其 一 个 纤 维 素 酶 基 因 (e A) 克 隆 和 测 序  N 5 cl 的 S 分 析 卟 广 西 农 业 生 物 科 学 ,03,2 3 :3 - 3 . 20 2 ( )1 2 18 
31   7


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