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D半乳糖诱导生物体衰老与细胞衰老模型的实验研究


四川大学 硕士学位论文 D-半乳糖诱导生物体衰老与细胞衰老模型的实验研究 姓名:邢玉芝 申请学位级别:硕士 专业:细胞生物学 指导教师:胡火珍 20060501

四川大学硕士学位论文

D一半乳糖诱导生物体衰老与细胞衰老模型的实验 研究
细胞生物学专业 研究生 邢玉芝 指导教师

胡火珍


研究目的本研究拟通过对自由基的检测及细胞、生物体的衰老生物学改 变相关性的研究,探讨D一半乳糖(D.galatose,D.gal)诱导后的自由基损
伤,骨髓间充质干细胞(mesenchymal
stem

cells,MSCs)衰老、生物体衰

老三者之间的相互关系,以期能够揭示在衰老过程中,自由基引起生物体
衰老的细胞学机理,试图在生物体及细胞水平上建立一个良好的老化模 型,为认识衰老和最终找到推迟衰老的方法提供实验平台。 研究方法 1.小鼠衰老模型的建立:取昆明种小鼠40只,称重,随机分成2组,每组20 只.分对照组、造模组;对照组每天给予生理盐水0.3 ml颈背部皮下 注射,造模组给予5%D.gal
0.3

ml颈背部皮下注射。连续给药60 d。

2.小鼠衰老指标的检测:观察两组小鼠的体征及行为学变化,检测大脑
组织内、血清内SOD及MDA含量的变化,检测皮肤SOD、MDA及 羟脯氨酸含量变化。 3.MSCs衰老模型的建立:取2月龄SD大鼠MSCs分离培养至第3代,

置于含89几O-gal的培养液中再传至第3代作为诱导组,而在原培
养液中继续培养至第6代的为对照组。 4.MSCs衰老指标的检测:通过光镜、透射电镜观察两组MSCs形态和 结构变化,绘制两组细胞的生长曲线,进行B一半乳糖苷酶染色,流 式细胞仪检测细胞周期分布变化和单细胞凝胶电泳检测DNA损伤方 法检测其衰老后的生物学行为变化,检测两组细胞内SOD及MDA的



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含量变化。
研究结果

1.小鼠衰老:(1)体征及行为的变化:造模前两组动物反应良好,毛发 光滑,饮食正常,行动敏捷。造模组小鼠颈背部皮下注射D.gal后4
周后部分小鼠体重开始减轻,行动缓慢,反应迟钝,毛发干枯发黄、 缺乏光泽,双颊脱毛明显,尾部出现色素斑点沉着并逐渐加重,嗜睡。

(2)皮肤改变:造模组较之对照组皮肤弹性降低。MDA明显升
高。SOD、羟脯氨酸含量减少。(3)对自由基的作用的影响:造模组小 鼠脑组织内、血清内SOD含量降低及MDA含量升高。

2.MSCs衰老:(1)诱导组MSCs镜下呈典型的衰老细胞形态,增殖速 度减慢;对照组MSCs形态均匀,长势良好。(2)流式细胞仪检测表
明加入D-gal诱导后90%MSCs停留在Go/Gl期,而S期和G2/M期 MSCs近于消失,并随诱导时间延长趋势越明显;对照组MSCs各期

比例正常。(3)诱导组约80%呈B.半乳糖苷酶活性阳性染色,对照
组染色为阴性。(4)单细胞凝胶电泳示诱导组MSCs DNA有拖尾现

象,对照组MSCs无DNA损伤。(5)对自由基的作用的:诱导组MSCs
内SOD含量降低、MDA含量升高.

研究结论D’:al'能够诱导实验动物小鼠衰老,对sD大鼠MSCs的老化具有

诱导作用,初步推断8∥白最适浓度,为研究衰老的机制及抗衰老提供了
研究提供了一个较为理想的研究平台. 关键词D.半乳糖:自由基;生物体衰老;骨髓问充质干细胞;细胞衰老



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STUDIES ON

ANI蚣L

AGING AND CELL SENESCENCE

MODEL

INDUCED BY D—GAI。ACTOSE

Mayor.Ceil-biology
Cn"adtlate Student:Xing Yu—zhi Supervisor:.Prof.Hu Huo-zhen

Abstract
Objective
Our study focused
on

research

the

correlation among the

oxidative damage.stem cell

senescene

and animal aging.by me越u砖the

quantity of free radical,morphological and biological ceil

changes of

animal

and

model.We

want tO explains that D-galaetose inducing subacuw aging
cause

moIlse model is related tO provides


the oxidative

stress

damages.,and

want to

good model

of

animal

aging and

stem cells

senesceneive?and

references for flll-ther research in aging.

Methods
1.D-gal induced aging animal model:The 3-wcek-old mice wefe divided into two groups WaS given
at

random,twenty in each group.Normal control group
group WaS given 5

saline(0.3m1)every day,D—gal
water

%D-galaetose(0.3ha)every day.Saline
by intraperitoned water

and D?galactose

w雠given

injection,and

they wefc fed with feed stuff.Saline
one

and D—gaIacto辩wem given

for 8 weeks.After

week蛐)pped the
and

injecti∞.We couected
2.the detection of changes of each serum


all tissues. the constitutional aetioa

aging signs:We observed group。and

measured the activities

of

SOD and MDA in

skin and tissues with biochemisⅡy methods.

3.D—gal induced

cellur senescence model:MSCs

indentified

wei'e fell into



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two teams:comparison Were thc 3 rd generation in DMEM-F12 medium without D-galactose,and the inducement Were cultured in DMEM-F12 medium

containing

8 g/L D—galatose after 3 generation.

4.the detection of senescencive signs:Optical and

electronic

蛔ing

microscope,

growth curve,flow cytometer,singal cell gel electrophoresis
to

and

fl-galactose dye Were used
morphological inducted by

identify the influences of characteristic markers of mesenchymal stem cells

and

biological

DMEM?F12 medium containing 89/L D-galatose.We

measured the activities of SOD biochemistry methods. Results 1. animal aging:The normal the model group in

and MDA

of each group cell with

control

had

many

significant

differences

from group

constitutional and and

action.eg:The model
scoch

became,action slack

lagging,less of the wcight'hair

and less of

luster and had more sleeps.The results showed that MDA normal control group,decreased more

contents

significantly

than that in

D-gal
that in

group,and the activity
D-gal group.

of SOD

increased

more significantly

than

2.Cell Senesoence:After treatment with D-galatose,mesenchymal stem

cells displayed morphological and biological changes of cell senescence
with the senescenctive characteristic

morphological cell

markers;80 percents

of cells are X-Gal dye masculine,singal

gel electrophoresis show in Go,G1,but
not

DNA damnification.flow cytometer shows 90 S

per cells stay

and Ge/M disapperd almost.While

the

comparison

has

these

senescencive phenomena.The results also showed that MDA contents of
normal

control group,decreased

more significantly

than

that in

D—gnl

group,and
D—gal group. gonc l
us

the activity of SOD increased more significantly than that in



ons

D--galatose

can

inducted mice and mesenchymal stem cells



婴型奎兰塑主兰竺堡苎
senescence,and 89n was the best.Thus this study provides aging


good model of rat
to

and

stem

cells

senescencive.These

studies will do much

the

manufacture of the

drugs and evaluation of measures to resist aging,

Key words:D-galactose;mesenchymal stem animal aging

cells:Cell Senescence;



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1引言
近年来,我国逐步进入老龄化社会“1,有效地维护老年人的健康,防

治衰老相关性疾病成为人们普遍关注的社会问题。因此,研究衰老发生机
制及延缓衰老圆进程,也成为当今学术界倍受重视的领域。在衰老的研究 中,合适的衰老动物模型对于深入研究衰老机制,筛选、研制抗衰老药物 具有重要意义。


研究发现“”连续给动物注射胪半乳糖能诱导出许多衰老生物学改
变,甚至是衰老的特异性酶的改变。在体内D.半乳糖受半乳糖合成酶的作
用,可氧化产生大量自由基,如02‘和H 20z.等活性氧,从而引起脂质过

氧化作用的链式反应,导致细胞膜损伤跚;同时过氧化脂质(1eo)的分解
终产物如MDA可与DNA.或RNA及蛋白质和磷脂的有关物质结合,使细胞 膜成分改变、功能障碍,促进衰老旧; 细胞作为生命活动的基本单位,细胞老化是机体衰老的核心,通过细 胞衰老的研究可了解衰老的某些规律,以往的研究多是对二倍体成纤维细

胞的研究基础上进行的。近年来的研究发现干/祖细胞是介导组织修复和 更新的主要细胞群体,在生物体内,干,祖细胞数量和功能随龄下降,这是生 物体衰老的原因之一.目前的研究显示,MSC的终末分化有可能跨越胚层界
限,超越传统意义上的分化为中胚层来源的间质细胞,而向实质细胞转化, 如分化为心肌细胞、神经细胞等,有着广泛的l临床应用前景。而且体外扩 增实验发现MSCs生长性状稳定,1、3、5代细胞的形态、生长曲线和贴壁 率无显著差异;体外扩增容易、接种存活率高、适应能力强及增殖速度快, 所以利用Dr半乳糖诱导MSCs作为体外实验模型更具有l临床研究意义和 稳定性。

所以本研究拟通过对自由基的检测与观察体内外衰老生物学特性改
变,探讨自由基损伤、D一半乳糖致衰老小鼠模型、D卜一半乳耱致MSCs衰老 模型三者的相互关系,以期能够揭示衰老过程中,自由基引起生物体衰老 的细胞学机理,并试图在生物体及于细胞水平建立一个良好的老化模型, 为认识衰老和最终找到推迟衰老的方法提供实验平台。


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2材料与方法
2.1材料
2.1.1实验动物 2-3周昆明小鼠40只,雌雄各半 2月龄雄性SD大鼠3只

均购自四川大学华西校区实验动物中心

2.1.2主要试剂

DM跚/F12培养基、MTT、胰酶均购自美国GIBCO公司,
小牛血清购自成都生物制品有限公司,

DMsO分析纯购自成都化学试剂厂,
X-Gal(Sigma,美国), Percoll分离液(L
073

g/mL,Phamaeia,美国),

D-半乳糖购自上海伯奥生物技术有限公司),

低熔点琼脂糖和正常熔点琼脂糖购自英国Oxoid公司,
超氧化物歧化酶(sOD)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所, 丙二醛(MOA)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所

2.1.3主要实验溶液和缓冲液的配置

绁照堡差旦巫抗的配置方法:
一般市售青霉素80万u/瓶,溶于4mL,每1000mL培养液加0.5mL,终浓 度为100 U/mE;一般市售链霉素100万U/瓶,溶于5mL,每1000mL培养 液加0.5mL,终浓度为100 U/lnL

!墼垒拯缓往透
10×贮存液组分为;1089 Tris碱,559硼酸,40mL 加水至1L 1×工作液浓度为:89mM Iris碱,89mM硼酸,2IIlM EDTA;使用前将贮存 液稀释10倍即可
0.5M EDTA pH8.0,



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湟化乙锭【坠墼2溶液
10X贮存液浓度为10mg/mL,在20mL水中溶解o.29 EtBr,混匀后4℃避 光保存,由于EtBr是诱变剂,要小心操作 1Xl作液浓度为1pg/肛L,使用前将贮存液稀释10倍即可

薹=鲤!鎏色违厘醋酸=里醛固定潼配制
①X-Gal染色液:100 retool/【,磷酸钠(pH 7.3),1.3 nⅡnol/L氯化镁。3 mmol/L 铁氰化钾,3.砸Ilol/L亚铁氰化钾,1 滤。
mg/ml

X-Gal;以上经0.45 m的膜过


②固定液:甲醛10lIll,冰醋酸3Ⅱd,生理盐水加至100ml。

2.i.4主要仪器设备

细胞培养箱(MCO 15AC)为Sanyo/z§司产品 倒置显微镜为重庆光学仪器厂产品 酶联免疫酶标仪惠普公司 UV-7504紫外可见分光光度计上海欣茂仪器有限公司 恒温水浴箱深圳天南海北实业有限公司 普通离心机上海手术器械厂 匀浆器上海医疗器械厂

2.2技术路线
2.2.1

D一半乳糖致昆明小鼠衰老的模型的构建及检测

实验动物分组一造模一自由基检测—生物体衰老生物学特征
2.2.2

D-半乳糖I变MSCs拟衰老模型的构建及检测

细胞的分离培养一造模一自由基检澍—细胞衰老生物学特征观察

2.3实验方法
2.3.1

D一半乳糖诱导昆明小鼠衰老模型的构建15.7期

2.3.1.1实验动物分组及给药

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①取昆明种小940只,称重,随机分成2组,每组20只.分空白对照组、造模
组。

②空白对照组每天给予生理盐水0.3 ml颈背部皮下注射,造模组给予5
%D-半乳糖0.3 ml颈背部皮下注射。连续给药60d。

③自由取食,饮用自来水。室温保持在(20±1)℃,自然光照下饲养。 2.3.1.2衰老指标检测


2.3.1.2.1血清SOD.及MDA的测定 ①于末次注射药物2 h后,从眶下及心脏采血2.0ml。 ②血液立即离心(3500r/min)10 min,吸取上清液作SOD及MDA含"量检测
(SOD检测试剂盒、MDA检测试剂盒)。

③紫外分光光度仪测定造模组和对照组小鼠血清的吸光度值。

2.3.1.2.2大脑SOD活性测定

①采血后迅速断头,取出双侧皮层,用冰冷生理盐水漂洗,除去血液, 滤纸吸干,称重,放入小烧杯,冰浴。 ②生理盐水:组织按9:1的比例,先加总量的2,3生理盐水于小烧杯、剪碎、
倒入匀浆器,另1/3生理盐水冲洗小烧杯后倒入匀浆器,手工匀浆。

③取匀浆液,普通离心机3000rlmin离心15

mill。

④取10%的组织匀浆上清再用生理盐水按l:9稀释成l%组织匀浆。 ⑤采用黄嘌呤氧化酶法(SOD检测试剂盒),予波长550rim处分别测定造模
组和对照组小鼠大脑组织匀浆液的吸光度值。

2.3.1.2.3大脑MDA含量测定

①小鼠大脑组织蛋白匀浆和定量方法同上. ②采用113A比色法(MDA检测试剂盒),于波长532nm处分别测定造模组和 对照组小鼠大脑组织匀浆液的吸光度值。

2.3.1.2.4皮肤衰老的观察

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①取背部皮肤,去除皮下脂肪及结缔组织.分两部分, ②第一部分取皮肤组织块100 mg经预冷的生理盐水漂洗。拟作皮肤组织 匀浆用,测定匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化脂质代谢产物丙二醛

D囝A)’
③第二部分取皮肤组织后,l:I丙酮一乙醚脱脂。切碎晾干,精密称取200 mE,作羟脯氨酸含量的测定。 D-半乳糖诱导MSCs拟衰老模型的构建”” MSCs的体外分离培养

2.3.2 2.3.2.1

①sD大鼠断颈处死后无菌操作,取双侧殷骨和胫骨,剔除周围肌肉组织, 剪去两骺端; ②抽取5 ml无血清冷DMEM—F12培养基(含青霉素、链霉素各100 冲洗骨髓腔,吹打制成单细胞悬液,注入含有5 心管中,离心半径8
cm,2 000
ml

U/m1)

Percoll分离液离

r/min离心20

min;

③收集离心液界面上乳白色云雾状的细胞层,先后以PBs和DMEM漂洗; ④用含15%d、牛血清DMEM—F12培养基重悬细胞; ⑤计数3—5×105个/ml后即接种于培养瓶中,置于37℃、5%C0:饱和湿 度的细胞培养箱中进行原代培养; ⑥分别于24、72 h半换液,以后每3天全量换液1次。倒置相差显微镜 下观察细胞培养全过程; ⑦13 d后细胞长满瓶底80%时进行传代培养,以I)<10。个/ml终浓度传 代,取传至第6代细胞为对照组。

2.3.2.2

Mn检测细胞活力

①取第三代MSCs按l X 105个/ml接种于96孔板,在37℃5%CO:的饱和
水汽二氧化碳培养箱中培养。 ②培养接近融合状态时,换含不同浓度D-gal为0、4、8、12、16 斗l培养液, ③等体积PBS作空白对照组,每组做5个平行样品,
glL 100

12

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④72 h后吸去培养液,PBs洗涤2次,每孔加入MTur(5 mg/m1)20Il ⑤继续培养4 h,弃上清,加入150 p


l,

DMSO振荡10

min,

⑥用酶联免疫检测仪测定570舢的吸光度(彳)值. ⑦根据细胞存活率=实验组细胞一空白对照/对照组细胞一空白对照×100%
计算细胞活力。

2.3.2.3

MSCs衰老模型的建立

①取第三代MSCs改换在含8 g/L D-galDMI!M-F12培养液培养, ②继续培养再传至第3代,即为D-gal诱导的大鼠MSCs衰老模型,作为诱
导组。

2.3.2.4.细胞周期分析 ①将对照组改换于含8 g/L D-galDMEM-F12培养液中培养, ②分别用0.25%胰酶消化对照组及培养I、2、3及4 d的MSCs,每个样本收
集约l×10‘个MSCs,PBS洗2次后悬浮于O.5
ml

PBS中,充分吹散混匀。

③将细胞悬液加/ks ④离心半径8
0.5 cm,l

mL 200

70%冷乙醇中,4"C固定过夜。 r/rain离一blO min,弃乙醇,冷PBS洗2次后悬浮于
min.

mlPBShb,加入碘化丙啶I ml(终浓度为50 mg/m1)室温避光反应30

流式细胞仪检测。

2.3.2.5绘制细胞生长曲线

①取对照组和诱导组MSCs,分别以1×10‘个/ml细胞悬液接种于24孔培
养板:

②当单层细胞生长达80%融合时,每24 h消化收集细胞,制成细胞悬液。苔
盼蓝染色计数,每组计数3孔,计算均值:

③共记数7 d,实验重复3次。

2.3.2.6

X.Gal染色

①将对照组和诱导组Mscs分别接种于6孔扳,调整细胞密度为2.5×10‘个

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/ml;

②待长成单层后,吸净培养液,加入l ml醋酸.甲醛固定液:
③室温固定30
rain; min;

④吸净固定液,PBS洗涤3次,每次3 ⑤吸净PBS,每孔加入l
ml

X-Gal染色液;

⑥37℃孵育4~6 h,保鲜膜封住6孔板防止蒸发; ⑦直至大部分MSCs变蓝,普通光学显微镜下观察。

2.3.2.7单细胞凝胶电泳观察【lll ①用细玻璃条在普通载玻片上自制约1.5×1.5cm2的微电泳槽; ②铺胶:1层为正常熔点的琼脂糖凝胶层,作为底层;2层分别为对照组和 诱导组MSCs悬液与低熔点的琼脂糖凝胶混合后的凝胶层;3层为低熔点的
琼脂糖凝胶覆盖层;

③裂解:将微电泳槽置于新鲜配制的中性裂解液中,4℃冰箱中裂解1.5h: ④解旋:取出微电泳槽,用双蒸水漂洗去掉多余的盐分,置于提前加入0.5
%TBE电泳液的水平电泳仪中解旋20rain;

⑤电泳:在20V,200mA电泳条件下电泳20mira ⑥染色和观察:2地g/ml溴化乙锭(EB)染色。双蒸水漂洗,去掉多余染液,
在荧光显微镜下观察,并用数码相机摄取图像。

23.2.8透射电镜观察 ①分别取两组MSCs培养液4 ml以离心半径8
cm,1 200 min:

r/min离,hi0

min:

②弃上清,加入0.3%戊二醛固定液,4"C静置30 ③再以离心半径3cm,12
000

r/min离一015

min:

④弃上清,加入3%戊二醛固定液,固定60

min;

⑤经脱水、包埋、超薄切片后透射电镜下观察。

2.3.2.9自由基测定

①采用黄嘌呤氧化酶法(sOD检测试剂盒),于波长5501lm处分别测定各实
14

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验组和对照组MSCs内的吸光度值;

②采用TBA比色法(MDA检测试剂盒),于波长532nm处分别测定各实验组
和对照组MsCs内的吸光度值。 2.3.3统计学方法 采用SPSSl0.0软件统计进行统计学分析,数据以均数±标准差表示。组问 比较t检验,以,值<0.05为有统计学意义。

3结果 3.1 D一半乳糖诱导生物体衰老模型的实验结果
3.1.1

D-半乳糖对造模组小鼠的体征及行为学变化 造模前两组动物反应良好,毛发光滑,饮食正常,行动敏捷。造模组

小鼠颈背皮下注射D一半乳糖后1月余部分小鼠体重开始减轻,行动缓慢, 反应迟钝,毛发于枯发黄、缺乏光泽,双颊脱毛明显,尾部出现色素斑点 沉着并逐渐加重,嗜睡。对照组无明显变化。

3.1.2

D-半乳糖对造模组小鼠血清及大脑组织自由基含量变化

造模组与空白对照组比,大脑及血清中MDA明显升高,而SOD含量降低 (P<o.05),提示造模成功。(见表1)

衰l大脑组织及血清中SOD和MDA的含量变化

注:与对照组比较。P《o.05脚O
3.1.3

D一半乳糖对造模组小鼠皮肤组织中抗氧化指标的影响 造模组与对照组比。皮肤dPMDA明显升高(P<0.05)。SOD、羟脯氨酸

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含量减少(P<0.05),提示造模成功。(见表2)

衰2皮肤组织中SOD.MDA及羟脯氨酸含量的含量变化

注:与对照组比较,P<o.05,,I---'2.0

3.2
3.2.1

D一半乳糖诱导MSCS拟衰老模型制作
MSCs体外分离培养

原代培养的MSCs于24 h后开始贴壁,细胞伸展成梭形、椭圆形或多角
形;48 h有细胞集落形成,贴壁细胞增多;4 d呈典型的成纤维细胞形态;
10

d细胞集落不断扩大而融合成单层(图1)。传代MSCs生长较原代快,7d

即铺满培养瓶底,传代细胞保持原代细胞的形态特征,随代数增加MSCs 得到纯化,梭形细胞占90%以上(图2)。诱导组.MSCs形态及排列不规则, 体积较大,胞浆区域增大,浆核的比例增加,胞浆中可见较多颗粒或空泡
(图3)。

图1①原代培养的MSCs

i0

d×100

图1②原代培养的MSCs

13

d X 100

16

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图2传至第5代的MSCs×100

图3诱导组Msc8

X200

3.2.2肼检测细胞活力
0、4、8、12和16 g/L各组吸光度(A)值分别为:0.241、0.230、0.201、

0.136、0.092,空白对照组为0.039;各组存活率分别为:96.70%±o.04%、 84.40%±0.02%、47.80%±0.04%、26.40%±0.03%及21.20%±0.02 %,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。根据存活率选用89/r,D-gal 建立MSCs的衰老模型。
表3 MTT检测各组吸光度A值结果ln=5,x-+8)

竺!生望垦室皂塾曼
光度值0.039

!芝!
0.241

!芝!
0.230

!芝!
0.20 1

!!兰!
0。136

!!!!
0.092

与对照组比较P值<0.05

n=5

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细胞存活率=(给药组一空白组/细胞对照一空白对照)×10嘣

3.2.3流式细胞仪分析细胞周期
D-gal加入后大部分MSCs停滞于Go/Gl期,S期及G2/II期趋于消失; 对照组各期比例正常。培养l~4 dMSCs,S期依次为11.锅、8.0%、7.1% 及6.4%,也明显低于对照组(S期38.8%),见图4。

加药后24

h 615=71.5Y,

加药后48

h GI%=73.3%

18

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围4 D-gal培养MSCs不同时间细胞周期图

3.2.4绘制MSCs生长曲线

从细胞生长曲线可见,诱导组MSCs生长速度较对照组明显减慢。对照 组最大增殖数约为4.9×105,对数生长期在3—6 d之间;诱导组最大 增殖数约为7.8×10。,对数生长期在4—7 d之间(图5)。

p柏

量∞

对擘掀-
爵导姐■虻?

蔷勰
曩lO
O I















培葬天羲(daT)
图5对照组与诱导组细胞生长曲线

3.2.5

p一半乳糖苷酶染色 在pH 6光镜下可见诱导组80%的MSCs质内为均匀蓝色,而对照组

胞质内仍为无色均匀雾状(图6和图7)o

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圈6诱导组-scs卜即I染色染色阳性×100

田7对照组-s“X-pI染色染色明性×100

3.2.6单细胞凝胶电泳观察 在经溴化乙锭染色的图像分析后可见,对照组MScs无DNA损伤,其 荧光在细胞内;i秀导组MSCs DNA的断裂迁移出产生带有荧光的尾部(图8
和图外。

豳8对照组MS(:s单细胞凝胶电泳田X400

田9诱导组RSOs单细胞凝胶电泳图x4∞

3.2.7透射电镜观察

诱导组MsCs呈典型的衰老形态和结构变化,核膜内折,核染色质浓 缩,形成不同形状的块状;浆内存在大量空泡,线粒体的数量减少,体积 增大或肿胀,内质网扩张,但细胞膜保持完整(图lO)。对照组Mscs核膜 平整光滑,染色质分布均匀,胞浆内可见丰富的线粒体(图11)。

——.一..

坚型查兰堡主兰丝丝苎

图10对照组IIISC¥超微结构6XIo'

围¨诱导组M¥Cs超微结构(①核膜内折1×1矿②胞浆内大量空泡1×1矿③脂核素 颗粒6X1 o|).

3.2.8细胞内自由基含量的变化 诱导组细胞内MDA含量较对照组明显升高,而sOD活性则降低(P.c 05),提示诱导成功。(见表4)
0.

.墨!竺兰墨堡型至墨塑燮!生塑!塑!坠鱼量塑墅堕!竺!!圭!!
S01)(U/rag~pro.h1) 对照组 诱导组
7.23+0.86 5.68+0.74

MDA(nmol/mg prot)
8.33+0.07 13.55+1.62



21

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洼:与诱导组比较.P‘0.∞.r商

4讨论 4.1亚急性衰老小鼠模型及MSCs衰老模型的构建
研究表明,机体在衰老的过程中会发生酶的合成障碍和活力改变、抗 氧化能力下降、免疫功能下降和糖、脂代谢紊乱等“‘””。可靠的衰老模 型应能较全面地模拟以上衰老过程中发生的变化。目前常用的制备衰老模 型的方法有D-半乳糖皮下注射、低剂量辐射诱导“”、吸入臭氧“”、去胸腺 衰老啪’、选择性近交延代,培育成快速老化模型小白鼠(S蛳)等动物模
型.辐射致衰老模型和臭氧致衰老模型的老化表现各有局限性,而D-半乳

糖模型因全面影响细胞的代谢功能和一些重要的酶的功能,此种代谢失调 造成亚急性衰老模型,其病理变化过程己被国内外学者证实符合自然衰老
时出现的症状嘲,是较常用的一种人工催老模型。

本研究通过对小鼠体征外观变化的观察,以及氧化应激相关指标的测 定,参考了大量有关衰老动物模型的相关文献溉4…。经过比较,认为本 实验中亚急性衰老小鼠模型制作是成功的。我们的实验亦证实,含89/LD- 半乳糖的培养基可诱导MsCs出现明显的衰老细胞生物学变化,认为实验中
WSCs衰老模型结果稳定可靠。

4.2

D--gal诱导衰老的机理及氧化损伤及抗氧化能力的观察
1956年Ham]an提出了自由基伤害衰老假说“2】。他认为衰老很可能是

由于以氧自由基为主的种种生物化学自由基给生物组织带来的伤害性影 响的积累。维持体内足量的自由基清除剂水平就可以有效的阻止伤害、防 止衰老、甚至大大延长寿命。 D.半乳糖致衰老模型是徐澈基于衰老的代谢学说而复制成功的。D. 半乳糖在代谢过程中形成的过量超氧阴离子自由基的过氧化反应可能是 导致拟衰老的根本原因,它致衰老的机制是,在一定时间内。给动物连续 注射大剂量的D.半乳糖,使机体细胞内半乳糖浓度增高,在醛糖还原酶的 催化下,还原成半乳糖,这种物质不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内,

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影响细胞的正常渗透压,导致细胞肿胀、功能障碍、代谢紊乱。由于自由 基堆积,就会导致细胞膜受损,过氧化脂质、脂褐素增高。 分子水平的研究还表明噙蚓,氧化过程中产生的自由基损伤线粒体是

导致细胞和机体衰老的基础,线粒体的变化与细胞衰老有密切的关系c”,.
线粒体是细胞的氧化中心和功能基地,为细胞提供细胞的生物合成、运输

活动、信息传递等生理活动所需的能量.线粒体损伤、酶功能的不足可使
A D

P转化为A



P的过程受限,造成能量的生成不足,严重影响细胞的各


种生命活动,降低细胞的活力。线粒体的损伤和A

P供应不足等因素可

使钙泵失活,大量释放细胞内结合钙,钙离子增加,加重细胞内钙的超载o”。

细胞内钙超载可引起一系列该依赖性酶的失控,如一氧化氮合成酶,进一步
加剧自由基反应,抑制细胞的能量代谢,加重细胞的损伤【篮捌。 本实验通过对体内及细胞内自由基含量的检测,发现生物体内注射

D-gal以后,导致体内SOD活性下降,MDA和脂褐质(UP)水平升高;在体
外1)-gal诱导培养条件下,诱导组MSCs内丙二醛浓度随细胞培养时间的延 长而上升,超氧化物歧化酶的活性却随细胞培养时间的延长而下降。丙二 醛的含量反映了细胞内脂质过氧化程度,体现出细胞受自由基攻击后氧化 应激受到的损害,超氧化物歧化酶能清除自由基,抵抗膜脂质过氧化作用 保护细胞免受氧化损害。细胞衰老是机体整体衰老的物质基础,D一半乳 糖能引起生物体内及细胞内自由基活性的改变及氧化应激损伤,是导致动 物亚急性衰老及干细胞衰老的共同机制。

4.3

D-半乳糖致生物体衰老的行为及外观变化
在用D.半乳糖诱导昆明小鼠的实验中发现,当造模4周后,我们观察到:

造模组小鼠开始行动迟缓,皮毛松散、无光泽。自由基学说认为啸“41,皮肤 衰老是由于随着年龄增加,体内如SOD、的抗氧化酶活性降低,清除自由基 能力下降,自由基在体内大量堆积,引起脂质过氧化终产物丙二醛(MDA)增 多l川。MDA是活泼的交联剂,可迅速与磷脂酰乙醇胺生成荧光色素,然后与

蛋白质、肽类,脂类结合形成板层状脂褐质(LD沉积在细胞,组织,能使
机体内多种生物大分子变性、断裂,引起细胞结构和功能的破坏,而导致机

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体的衰老.脂褐质(Lt9大量堆积于皮肤细胞内,可出现黄褐色老年斑。因 此,MDA含量的高低间接反映细胞衰老程度伽1.皮肤是否保持光滑细嫩主 要取决于真皮下的胶原蛋白.羟脯氨酸是胶原蛋白的特有氨基酸之一,约

占胶原蛋白全部氨基酸残基的13.4%。自由基大量增加可引起胶原蛋白交

联,老化,失去弹性.所以D_gal致衰老模型的衰老接近于自然衰老酮.
4.4

D-半乳糖致MSCs衰老的研究
MSCs是骨髓中的非造血干细胞,近年来,因其在不同的诱导条件下

4.4.1骨髓间充质干细胞与千细胞衰老的研究进展

能分化成成熟的间质细胞,如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细
胞,网状细胞、血管内皮细胞等,又称其为“间充质干细胞”或“间充质 祖细胞”。研究MSCs的细胞周期发现【321,MSCs中有90%处于Gd6l期,说明

.MSCs具有高分化潜能。有人认为骨髓中可能存在着具有多系分化能力的
亚全能干细胞群,目前的资料证明多种组织的成体干细胞来源于骨髓,在 某些情况下,特别是组织损伤时,居住在骨髓池内或循环于外周血的骨髓

干细胞在多种细胞因子的趋化下,不断通过毛细血管网进入各种组织,迁
移进入损伤部位,并在局部定居、增殖、分化为特异性前体干细胞或祖细 胞、组织特异性细胞以补充衰老损伤的细胞,修复组织损伤,维持正常组

织代谢,保持组织细胞的平衡。
Gfl等对癌细胞和胚胎干细胞进行比较发现,人类最初的胚胎干细胞 的寿命是有一定限度的,当其增殖的群体达到一定限度时,便进入一个不 可逆的生长阻滞阶段,他们认为这就称为干细胞衰老,MSCs等成体干细

胞也不例外。干细胞的衰老表现在细胞数量上减少,质量(增殖、自我更
新能力。分化潜能)降低。而质量上的变化更重要,这涉及自我更新潜能, 发育分化潜能以及与细胞外信号之间的相互作用等。研究者们对干细胞的 再生能力与衰老的关系近年来作了一系列的研究㈨。衰老的干细胞在确定 衰老器官的表现效应和功能,并最后决定哺乳类动物的寿命方面起了关键 作用。很多试验证明机体中的干细胞包括MSC会随着年龄的增长发生衰 老.体外扩增实验发现MSCs生长性状稳定,1、3、5代细胞的形态、生长

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曲线和贴壁率无显著差异;体外扩增容易,接种存活率高、适应能力强及 增殖速度快,所以作为研究干细胞衰老是一个很好的模型嘲.

4.4.2骨髓间充质干细胞的分离,培养

骨髓中间充质干细胞的数量极少,成人骨髓平均10万个有核细胞中含 有1个,且随着年龄的增加,细胞数量逐渐减少,因此,如何获取高纯度的 Mscs相当重要.目前主要通过3种特征鉴定M¥Cs:①体外培养贴壁生长里 梭形;②一定条件下可向成骨、软骨、脂肪和成纤维细胞等细胞谱系分化, 对上述成熟细胞进行功能鉴定;③用特异结合MSCs细胞膜抗原的单克隆抗
体直接鉴定啪1。但目前仍没有用于鉴定的理想标志性分子或方法,有学者

p6l通过其表面分子的表达及多向分化潜能进行鉴定。
常用的分离MSCs的方法有全骨髓法和离心法.全骨髓法即根据干细胞 贴壁特性,定期换液除去不贴壁细胞,如造血系细胞等,达到分离纯化MSCs

的目的.离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同,提取单核细胞进行贴 壁培养。我们采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,再利用MSCs易贴 壁生长的特性,通过连续传代获得了较纯的MSCs。为了获得更高纯度的 MSCs,有人利用流式细胞仪法、免疫磁珠法等对MSCs进行分离纯化,结果令
人满意.

4.4.3

MSCs衰老模型的建立依据 唑 蓝(3.(4,5-dimcthylthiazo[-2-y|)-2,5.diphenyl
tetzazolium



bromide,M1m的四唑环能被活细胞线粒体中的各种脱氢酶还原,生成深蓝

色的水不溶性物质——甲睽(fo珊az觚)。Mosmann[盯’利用这种特性成功地
测定细胞存活率.MTI'法具有简便、快速,测量仪器化,处理数据量大等
优点,得到广泛应用。在MTI"的检测实验中,可见中等浓度(8 g/L)D.gal

处理MSCs,活力降低;而高浓度(16 g/L)的D—gal处理呈负增长,表明
D-gal能使MSCs增殖速度减慢,但D.gal浓度过高,会使细胞受到损伤,引起 细胞的凋亡或死亡,所以我们选择8 g/L的浓度进行诱导衰老。诱导传代3 次后即建立了MSCs衰老的研究模型。

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4.4.4

MSCs衰老模型的鉴定

根据细胞衰老特有的生物学特征及生理现象,实验对模型进行了几个
衰老生物学标志的鉴定.光镜下诱导组较对照组的形态及排列不规则,体 积较大,胞浆区域增大,胞浆中可见较多颗粒或空泡,有衰老表现;透射电 镜观察D.gaI组细胞膜被破坏,部分细胞核不规则,染色质固化,核膜膜褶增 多、加深;各种细胞器均有减少;粗面内质网扩张,脱颗粒;线粒体肿胀,嵴断

裂,溶酶体多;胞质内可见大量多泡体,与细胞衰老的生理行为相一致;同 时胞浆内深色的圆形或椭圆形即为脂褐素,脂褐素是在胞浆中沉积随老年
化过程而增加,也是细胞衰老的特征性标志.而正常组MSCs细胞膜完整,

细胞核规则,核膜清晰;可见粗面内质网和高尔基体,微管与微丝;线粒体结
构正常,可见少数细胞线粒体体积增大,嵴增多;本试验结果提示D.gal引起 的自由基变化,损伤了线粒体最终导致了MSCs衰老。 衰老另一特征就是对MSCs活力和增殖速度的影响,通过绘制两组

MSCs的生长曲线可以看出,细胞从年轻向老化发展的进程中生长速度逐 渐变缓,提示细胞老化是各种因素的作用积累到一定程度,才发生增殖休止 生长趋势的改变,诱导组的MSCs生长速度较对照组的明显减慢。 Dinliri和PendefgroSs等【帅1发现了细胞衰老的另一个特征,体外培养人
二倍体成纤维细胞在pH 6时,B一半乳塘苷酶染色的阳性率随代龄增加 而增加,他们将这种中性B一半乳糖苷酶定义为衰老相关的B一半乳糖苷 酶。在报道中提出体内或体外的衰老成纤维细胞和角质细胞均表达此酶,

而休眠细胞和终末分化细胞则缺乏,永生化细胞中也无表达。因而此酶可
以作为检测衰老细胞的重要标志。研究中通过原位染色,在普通的光学显 微镜下就可以用于检测到B.半乳糖苷酶的表达.诱导衰老的细胞中有80% 细胞D.半乳糖苷酶染色阳性,表明该酶活性明显升商,是与衰老相关的。 衰老是细胞脱离细胞周期并不可逆丧失增殖能力后进入的一种相对 稳定的状态,是正常细胞的必然归宿1391。细胞周期变化可反映细胞的增殖 能力。在流式细胞术检测细胞周期分白情况发现,正常的MSCs中仅有20 %的静止细胞(GdGl细胞),这表明MSCs具有强大的自我更新能力:而诱

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导组大多数的Mscs则停滞于GdOl期,s期及G2,M期MSCs趋于消失,表 明MSCs分裂缓慢,增殖能力逐渐丧失。这与Haynick发现人二倍体成纤维
细胞在体外随传代次数的增加,逐渐丧失增殖能力而得到复制衰老的结果

相似例.随着D.gal作用时间的延长,细胞周期中Go/Gl比例增高,但非二倍
体比例也显著升高,细胞周期中非二倍体比例的升高提示我们,D.gal对

MSCs的作用可能不仅是诱导衰老,更进一步是诱导细胞的凋亡.但细胞的
复制衰老是一种累积性的变化,我们也观察到个别13.半乳糖苷酶活性检

测阳性细胞仍然可以出现分裂像,但明显出现胞体变大、失去多角形态、
长的细胞突起明显增多等改变。这些细胞可能在继续培养的过程中完全进 入Gl期,并停滞在Gl期,失去有丝分裂能力,但细胞仍然是存活的,具有 一定的生物学活性。 单细胞凝胶电泳能提供单个细胞中DNA损伤的情况,并可通过彗星 尾长的程度估计DNA损伤程度【1ll。有核细胞的DNA分子量很大,DNA

超螺旋结构附着在核基质中,用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载波片上,在细
胞裂解液作用下,细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏,使细胞内的RNA、 蛋白质及其它成分进入凝胶,继而扩散到裂解液中,但核DNA仍保持缠 绕的环区附着在剩余的核骨架上,并留在原位。如果细胞未受损伤,电泳

时,核DNA因其分子量大停留在核基质中,荧光染色后呈现圆形的荧光 团,无脱尾现象.若细胞受损,在中性电泳液中,核DNA仍保持双螺旋

结构,虽偶有单链断裂,但并不影响DNⅣ叹螺旋大分子的连续性。只有
当DNA双链断裂时,其断片进入凝胶中,电泳时断片向阳极迁移,形成
荧光拖尾现象,形似彗星。本实验在pH8的条件下诱导组细胞电泳结果有 拖尾现象,而对照组没有;提示衰老细胞的DNA受损。 综合诱导组MSCs形态学及生物学特征的改变,可以看出D.gal致干 细胞衰老模型的衰老接近于细胞的自然衰老。

4.5本实验的评价
本实验根据D—gal致衰老的学说立论,验证了它在体内外诱导衰老的 作用及其相关性,并分别在体内外检测自由基指标的变化,来判断对D-gal

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致衰老模型体内外机理,结合实验条件及实验经费,选择了较为经典的实 验室指标作为评价依据.从实验结果观察,基本达到本实验设计的目的.

4.6今后的研究设想
目前的实验结果,为研究抗衰老及研究衰老及衰老机制提供了很好的 实验平台.此外,本研究中,电镜下可见线粒体的严重破坏,说明在衰老 ?自rh基?于细胞间的相关性,有待进一步研究,为研究衰老机制奠定基础。

另外,D-gaI诱导干细胞的衰老的剂量及检洳指标还有待进一步改善和摸
索.由于影响衰老因素众多,本实验只是从某几个方面进行了观察研究, 因此有关实验需要进一步的深入.

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结论
1大剂量颈背皮下注射D.半乳糖制作的亚急性小鼠衰老模型是成功
的。 2小鼠衰老模型发生了衰老的特异性酶的改变,如SOD下降,MDA 水平升高。 3成功构建了D一半乳糖MSCs衰老模型,实验结果提示诱导的合适浓 度是89n,。


MsCs衰老模型发生了衰老的特异性酶的改变,SOD下降,MDA
D一半乳糖能引起生物体内及细胞内自由基活性的改变及氧化应

水平升高.


激损伤,是导致动物亚急性衰老及干细胞衰老的共同机制。 6为进一步研究干细胞衰老和抗细胞衰老奠定了实验平台.

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文献综述
细胞衰老的研究进展
2l世纪,人类将面临“人口老龄化”的巨大挑战,世界各国将进入“人
口老龄化”时代m.加强抗衰老科学研究,是时代赋予我们的要求。而衰

老机制是一个复杂的过程,要揭开衰老之谜,有待于不断加强衰老基础理 论的研究。本文就有关细胞衰老各方面的研究进展作一综述。

1细胞衰老的发现
体外连续培养的细胞在有限次数的细胞分裂后,丧失合成DNA和分

裂能力,最后导致增殖能力的丧失,但基本代谢过程仍能维持,这种现象 称为细胞的复制衰老瑚。这一现象是由Haynick及其同事01在x961年研究
人类二倍体成纤维细胞时最早报道的。这种增殖停滞状态细胞,可保持代

谢活力的稳定状态,并能够维持数月甚至数年。衰老是由细胞所经历的传
代次数决定的。而与时间无关。我们将这种现象称为细胞衰老,或者叫做 复制衰老。那么衰老的细胞就是指不能对生长因子做出增殖反应的细胞

群,也就是丧失了DNA合成能力,不能增值,但仍能保持代谢活性,并
获得了新性状的细胞。

2生物体衰老与细胞衰老的关系
衰老是细胞和生物体生命周期中的一个自然过程,其中细胞衰老是机 体整体衰老的物质基础。通常所讲的衰老是指生物体衰老,即生物体在生 命过程中,随着年龄增长,机体在形态结构、生理功能等方面出现的一系 列缓慢的,退行性变化,这些变化导致机体适应力、储备力日趋下降的现 象【4I:细胞衰老是指细胞从一个活性的生长状态转变为不可逆转的生长停 滞状态.细胞衰老可分为两类。由细胞基因的原因引起的分裂停止称为复

制衰老,复制衰老是一种复杂的、多因素参与的过程,其复杂性表现为,

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不同类型的细胞的衰老机制不同.绝大多数细胞都会出现复制衰老的现 象.如果原代细胞受到某些外界因素的影响而造成永久的、不可逆转的增
殖停滞,则称为早衰”. 自1907年Harrison首次提倡组织体外培养法以来,体外细胞培养很快 用于衰老的研究.现有的研究虽然还不完全,但都提示复制衰老是生物体

衰老在细胞水平的反映,并且可以充分肯定了复制衰老是一个较好的研究
机体衰老模型嘞。生物衰老是一个复杂、具有不同器官和系统的数不清的

一系列特定变化的过程嘲.生物体作为整体衰老过程的研究有一些难以克 服的障碍,这不仅包括衰老本身的复杂性而且也包括与不同个体相联系的 广泛异质性.此外,要将正常的衰老与生命过程中的疾病效应相区别确实 存在很大困难。因此,体外培养传代的人类细胞是一个简化的,在控制条 件下具有吸引力的机体衰老研究模型嘲。

3细胞的类型与寿命
有人根据细胞特化的程度和分裂能力的有无,把有机体的细胞分为三

大类m”。(1)没有分化而能进行有丝分裂的细胞这类细胞如表皮的基细 胞、精原细胞和原始血细胞等本身没有什么分化,能继续分裂出与自身相
同的细胞,因此,这类细胞的寿命很短,不发生什么衰老或活力减弱等现 象;(2)已分化而尚能进行有丝分裂的细胞在分化过程中仍能进行分裂的 细胞,如介于精原细胞和精予之间的一系列细胞f包括初级精母细胞、次 级精母细胞和精细胞等1。虽然发生分化,但寿命很短,因而也没有明显 的衰老变化;(3)己分化而不能进行有丝分裂的细胞这类细胞又根据不能 分裂的程度,分为可逆的和不可逆的两种。可逆的是指在正常情况下,不 能进行有丝分裂的,但如在异常情况下又能分裂。如肝被割除一部分后能 再生,恢复有丝分裂。这类细胞最后是要发生衰老和死亡的,但关于它们 的衰老变化情况的研究还不很多.不可逆的不能分裂的细胞是高度特化 的,在任何情况下都不增殖的细胞,如红细胞、心肌、骨骼肌纤维和神经 细胞(近年来发现神经细胞也能进行无丝分裂和有丝分裂,周围神经能再 生)等。一般讲,这种细胞的寿命较长,并可明显地看出衰老变化现象.

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它们是研究细胞年龄变化的主要对象。 根据许多实验证实嘲,各种细胞如果能保持它的正常分裂能力,那么 这类细胞就不会衰老.例如单细胞生物变形虫、草履虫和单细胞藻类就是 这样.又如分化很高的神经细胞,它的分裂能力已丧失,必然要死亡“””. 由此可见,细胞的分化和保持分裂能力,与寿命和衰老有关系。

4干细胞衰老学说
还有一类特殊的细胞—干细胞,一直以来人们将其归为具有不受限制 的分裂潜能的细胞【121。伴随着衰老,人体的组织和器官的功能逐渐下降,

因此年龄大的人在疾病后,组织的修复会比较慢“““嘲.而组织器官的修
复功能是由干/祖细胞介导,这就很容易使我们想到,衰老是与干,祖细胞 数目,功能、及其生存的微环境随龄改变紧密相关.很多的研究证据都支 持于细胞在衰老的过程中是一个关键因素的假说“”。许多实验的证据表明

干细胞总体的变化是与生物体的衰老显著相关的“”(图1.)。

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图1.伴随着生物体衰老,干细胞的功能潜能下降.年轻的千细胞总体细胞很少具有凋亡细咆 的特点,它由大量的静止细胞和活动细胞组成,这些细胞具有很强的自我更新能力和分化潜能. 这些年轻的干细胞分化为淋巴和髓样系统(a).由于细胞损伤的积累,衰老的干细胞总体会表现出 很高的捅亡率,在这些千细胞内.只有少量的静止细胞,而且活动的干细胞的分化能力也是受到 限制的(”.当机体育遗血的需求.老的干细胞总体,它们的凋亡宰增加。静止期的细胞也不能成 功的完成激活的过程,导致静止期干细胞的不足.活动的干细胞分化受到限制,分化的细胞数目 也是减少的,这就导致机体的修复变得缓慢(c).

比如研究者们认为““…,骨髓间充质干细胞并不具有永生性“干”细 胞的特征,表现出最终的寿命。骨髓间充质干细胞能够终生存在,随着年 龄地增加,细胞的数量和增值,分化能力下降。所以这类细胞是要衰老的,

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只是衰老进程缓慢例. 5细胞衰老的研究模型


在衰老的研究中,合适的衰老动物模型对于深入研究衰老机制,筛选、 研制抗衰老药物具有重要意义。国内外学者设计衰老动物模型有很多 种,Christopher等人在1979年首先提出了半乳糖性白内障发生机理,是新

陈代谢异常在晶体方面产生的病理变化。随后,国内学者利用大剂量D_ 半乳糖造成动物的糖代谢障碍,进而影响蛋白质代谢和脂类代谢,致使动 物不仅出现老年性白内障,而且还出现晶体病变以外的其它组织、细胞一
系列退行性变化,也符合人类自然衰老时所出现的症状.D.半乳糖所致的

体外衰老模型是我国学者基于衰老的代谢学说而复制成功的,该模型是在
一定的时间内给动物连续注射D_半乳耱,使其细胞内半乳糖浓度增高,在

醛糖还原酶催化下,还原成半乳糖醇,后者不能被细胞进一步代谢而堆积 在细胞内,影响正常渗透压,导致细胞肿胀,功能障碍,代谢紊乱,最终
机体衰老嘲. 自由基引起的细胞损伤主要表现在细胞膜和内膜系统中.生物膜的主

要成分是极性脂质和膜蛋白质。由于极性脂质中的不饱和脂肪酸具有易与 FR结合的分子结构,脂质极易发生过氧化反应呻1。线粒体是细胞的氧化中
心和功能基地,为细胞提供细胞的生物合成、运输活动、信息传递等生理

活动所需的能量。线粒体损伤、酶功能的不足可使ADP转化为ATP的过程受
限,造成能量的生成不足,严重影响细胞的各种生命活动,降低细胞的活 力.线粒体除了进行氧化反应以外,还有摄取和积聚Ca2",调节胞浆内游离

Ca2+浓度的作用呻1。线粒体的损伤和ATP供应不足等因素可使钙泵失活,
大量释放细胞内结合钙,钙离子增加,加重细胞内钙的超载。细胞内钙超载 可引起一系列该依赖性酶的失控。如一氧化氮合成酶,进一步加剧自由基 反应,抑制细胞的能量代谢‰”1,加重细胞的损伤,引起细胞的衰老。这一

造模机理己在体内外实验中被广泛应用,并得到了证实.
由上面的细胞类型介绍。可知干细胞是具有增殖、自我更新,多分化

潜能的一类特殊细胞,在个体发育中,起着维持成体组织器官的完整性方

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面起着关键的作用。干细胞的功能和数量是维持人体器官生长和新陈代谢
的源泉动力,也是机体修复衰老退行性病变最重要,是决定生命衰老的关

键因素。近年来的研究发现干细胞的寿命是有一定限度的,当其增殖的群 体达到一定限度时,便进入一个不可逆的生长阻滞阶段,他们认为这就称
为干细胞衰老,MSCs等成体干细胞也不例外.干细胞的衰老表现在细胞数

量上减少,质量(增殖、自我更新能力,分化潜能)降低。而质量上的变 化更重要,这涉及自我更新潜能,发育分化潜能以及与细胞外信号之间的
相互作用等。体外培养条件下的干细胞仍可以继续分裂增殖,所以在细胞 水平上。通过外界刺激干细胞导致的衰老作衰老模型,便具有增殖稳定性、

指标检铡明确性,所以干细胞是较好的细胞衰老模型。

6细胞衰老的机理

..

随着老年医学引入分子生物学与细胞生物学理论与技术,衰老机理的 研究开始从整体水平发展到了分子水平胁。捌.近半个世纪以来,已经提出
了一系列衰老学说,印大中等随剐总结重要的衰老学说主要有:整体水平的

衰老学说、器官水平的衰老学说、细胞水平的衰老学说和分子水平的衰老
学说等。 其中细胞水平的衰老学说有:细胞膜衰老学说、体细胞突变衰老学说、 线粒体损伤衰老学说慨“、溶酶体(脂褐素)衰老学说、细胞分裂极限学说 (程控学说)口钉;分子水平的衰老学说有:端粒缩短学说汹。’制、基因修饰衰 老学说m“1、DNA修复缺陷衰老学说慨”、自由基衰老学说啪’“研、氧化

衰老学说汹1,非酶糖基化衰老学说【州、羰基毒化衰老学说Ⅲ“”和微量元素 衰老学说等等。近几十年来,先后提出过多种假说,试图来解释衰老的本
质和机理,有不少的学说和假说已被普遍公认和接受。未来人们对衰老的 分子机制的研究将进一步深入。我们下面就目前的研究介绍如下:

6.1错误成灾学说
197390rgele提 了细胞大分子合成错误成灾说f421.意思是说,细

胞里的核酸和蛋白质在生物合成中如果由于某些原因而发生差错,这差

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错会得到累积而迅速扩大,引起代谢功能大幅度降低,造成衰老。对这 个假说可以进一步说明如下:在细胞里核酸造出蛋白质(酶),因为蛋白 质是用核酸分子傲样板合成的;蛋白质造出核酸,因为核酸的合成需要 酶,例如聚合酶的协助。酶是蛋白质,所以核酸和蛋白质在合成中形成 一种循环,相互联系,相互协作,相互制约.如果在一次循环中,出现 一个错误,这错误会在下一次循环中得到扩大。这样,错误在几次循环
中会很快扩大而成灾,使细胞功能大大降低,造成衰老。最近,在人工 培养的人的成纤维细胞工作的基础上,从上述细胞中提取DNA聚合酶, 利用这种酶进行DNA复制实验,结果发现上述成纤维细胞经过40次到56 次的继续培养,其DNA聚合酶的活性显著地降低了,大约降低到只有正

常细胞的1/5活性。从此以后,这些细胞就迅速衰老而死亡了…’。
研究者还做了另一个实验,他们从年老的(即经过很多次继代培养

的)和年轻的(只经过若干次继代培养的)上述成纤维细胞分别提I黜DNA
聚合酶,用人工合成DNA参J"子作样板,进行离体DNA复制实验,得到一
些有趣的结果,人工合成的DNA分子有意搞成只含碱基腺嘌呤(A)和胸腺

嘧啶CI),而不含有胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G),按照核酸分子碱基配对的原理,
在DNA合成中,A只能和T配对,T只能和A配对.因此在上述离体实验中,

如果DNA聚合酶能忠实执行任务,那么所含成的DNA分子中就不能含有c
或G的碱基.如果所提出的DNA聚合酶在帮助合成DNA分子中,用了一个 C或一个G去合成DNA,就算是一次错误。实验结果发现,从经过56次继 代培养的上述衰老细胞中提取出来的DNA聚合酶,在合成DNA分子中, 比从年轻细胞中取出来的DNA聚合酶要多犯好几次错误。这表示衰老细 胞中的DNA聚合酶大概在成分上有一些改变,不能忠实地进行工作,累 积的错误多。

6.2外部干扰学说 此说认为细胞衰老既不是细胞内出现差错,也不是由蛋白质异常引 起,而是由外源性干扰造成的Ⅲ1.例如,自由基受外源性干扰,就会引起 衰老。自由基是失去电子的分子。在体内,它是由空气污染、辐射以及正

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常代谢过程中产生的㈣.它们对许多生物功能非常重要,认为没有自由基
的生物就不能生存.自由基与其它分子作用得到电子,其中一些随机作用, 对细胞和机体组织十分有害。这些效应的积累便导致了人体的衰老.自由 基是衰老的根源。衰老的原因99%是由此造成的.自由基造成的变化或作 用的积累不断增加,引起了衰老,这种自由基可能专门破坏细胞合成和修

复DNA的能力,尤其是在线粒体内。

6.3发育程序衰老学说 某一物种的衰老表征的共同性表明,衰老受到潜在的基因控制。一个 典型的与衰老相关的基因途径的例子来自于线虫。线虫孵化后,幼虫经过4 个阶段直接发育为成虫,或者进入一个称为持久态(dauer)的休眠状态。处

于这种状态的幼虫在环境适宜的情况下可继续发育为成虫。持久态的幼虫 能生存6个月之久,而正常发育的成虫寿命仅有数周。参与这种发育决定的 许多基因已被克隆。根据持久态形成基因(dauer fomation gene。dafgene) 突变产生的效果可分为两类:(1)缺陷性持久基因(dauer defective gene),如 daf-16;(2)组成性持久基因(dauer constitutive gcne),如daf-2和age-1。

d小2编码一种类胰岛素受体№I,与age.1编码的3.磷酸肌醇激酶相互作用,
构成了线虫持久态发育信号通路的上游。daf-16编码3种(属于复制叉头

部家族转录激活因子),负责调控线虫主要代谢和发育控制基因的转录【47l;
它位于信号通路的下游,受到3-磷酸肌醇激酶途径的负调控。在正常发育过 程中,daf-2与其配体相结合,激活age.1,使daf-16的活性受到抑制,幼虫发育 为成虫,寿命较短;而在饥饿或拥挤状态下,daf-16的抑制状态被解除,线虫 进入持久态,寿命较长。线虫与发育途径相关的寿命控制现象表明,遗传程 序可能在更广泛的水平上调节着衰老的进程。 所谓的衰老基因的功能,与在胚胎发育过程中大规模发生的细胞正常 功能的衰退和死亡相类似。例如,人在胚胎发育过程中,手指之间最初是 由蹼状皮肤连接的,随着发育,皮肤细胞逐步死亡,手指就分开了1481。可 以想象得到,相同的过程在生命的全部过程中不断地进行.在不同的组织 中有不同的速度,最后引起正常的衰老变化,从而使身体易于患病。

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7细胞衰老的生物学特征
通过细胞衰老的概念,可知衰老细胞的最主要的生物学特征就是不可 逆的丧失增殖能力不可逆地,稳定的阻滞于G1期不能进行DNA。2d-成。
其次细胞衰老的过程是细胞内生理和生化发生复杂变化的过程,最终

反映在细胞的形态、结构和功能上发生了变化,首先形态结构的改变【49l: (1)在衰老的细胞内水分减少,细胞新陈代谢的速度减慢。(2)衰老的细胞
内,有些酶的活性降低。例如,由于人的头发基部的黑色素细胞衰老时, 细胞中的酪氨酸酶活性降低,就会导致头发变白。(3)细胞内的色素会随 着细胞衰老而逐渐积累。由于细胞内脂褐素占有的面积增大,阻碍了细胞 内物质的交流和信息的传递,影响到细胞正常生理功能的进行,最后导致 细胞的衰老和死亡。(4)衰老的细胞内呼吸速度减慢,细胞核体积增大,

染色质固缩、染色加深.(5)细胞膜通透性功能改变,使物质运输功能降
低。其次会发生有选择性地、特异性的改变功能改变。同时还具备了抗凋 亡的特性。

8衰老的生物学指标的检测
目前,在细胞水平,分子水平发现一些指标,可作为衰老生物学标志,但
尚不能满足上述所有判断标准㈨。童坦君教授4”曾提出如果把各种指标综 合考虑,构建一衰老网络,然后将网络各点精确量化,这样,不仅可以建立测 定衰老程度的量化公式,还有助于阐明衰老的分子机制。现将以研究较多 的几个衰老生物学标志为例介绍如下。

8.1

DNA损伤修复能力 多种DNA损伤如:染色体移位、DNA单双链断裂、片段缺失,都随龄

积累。这一现象除与衰老过程中自由基生成率升高及抗氧化剂水平降低有 关外,与DNA修复能力降低密切相关。Hart及Sctslow研究7种哺乳动物 的最高寿限与细胞DNA修复能力的关系,发现其皮肤成纤维细胞对紫外 线诱导的DNA修复合成效率与动物的最高寿限有良好的线性关系。为了

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排除DNA修复能力的种间差异,Hart研究了两种寿限相差2.5倍的小鼠 细胞DNA修复合成能力,发现长寿自足小鼠的DNA修复合成较短寿家鼠 高2.2倍。人体的血细胞、淋巴细胞、皮肤成纤维细胞DNA修复能力随
龄降低,一些早老症如Wcmer综合症和Cockayne综合症都具有某种DNA

修复的缺陷,限食可提高啮齿类DNA修复能力,以上实验说明DNA损伤修
复能力可作为衰老的生物学标志嘲。嘲.

8.2端粒的长度

端粒是染色体末端的重复DNA序列。由于它不能被DNA聚合酶完
全复制,所以在细胞分裂的过程中会不断缩短,除非借助于端粒酶,一种可 将端粒重复序列添加到染色体末端的核糖核蛋白酶。研究发现。在许多体 外原代培养细胞(它们与体内组织相似,缺乏端粒酶活性)的传代增殖过程 中,端粒长度确实缩短【删。因此,端粒缩短被假设为在生长抑制最终导致复 制衰老(replicative SCIIeSCfnC,e)的过程中起到了分子钟的作用,这一现象在 所有人的原代培养细胞中均观察到。

1991年,Harley等发现人体内成纤维细胞端粒每年缩短14~18bp(碱
基对),而外周血淋巴细胞则每年缩短33bp,我国测得值与此相近,为每年缩 短35bp嘟1.体外培养二倍体成纤维细胞,每增加一代龄,端粒长度减少约 50bp。对人体不同的组织进行端粒长度检测,发现端粒长度与细胞的寿限 相关,精子、胚胎的端粒最长,而小肠粘膜细胞的端粒最短.因此,端粒长度 不单是细胞分裂次数的“计数器”,而是一项细胞衰老的标志。

8.3线粒体DNA片段缺失 核基因组之外基因的不稳定性也在衰老的进程中发挥作用”1. mtDNA的突变率是核基因的10~20倍,已证实mtDNA的改变,包括点突 变、缺失和氧化修饰随着年龄的增长而积累,在有丝分裂后期组织中尤为 明显。线粒体与衰老密切相关且在衰老过程中起着关键作用。线粒体DNA 突变使线粒体呼吸链及氧化磷酸化功能受损,导致ATP水平及NAD与 NADH比率的下降,受损的电子传递链使线粒体自由基的产生增多。从而

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加速线粒体DNA突变速率,ATP生成减少,细胞一切生理、生化活动所需 能量供应不足,导致组织、器官功能的衰退油’W.Jo有关检测线粒体DNA突 变的大多数实验结果显示:在停止分裂的组织细胞中,线粒体DNA的多种 突变随龄呈指数增加。线粒体DNA突变以片段缺失最普遍,帕金森病、糖
尿病、冠状动脉粥样硬化心脏病、阿尔采末病等老年常见病都与线粒体 DNA片段缺失有关蛳一.线粒体DNA片段缺失的检测可以毛发为材料。应 用甚为便利,是一项很好的衰老生物学标志.

8.4

DNA甲基化水平 DNAI甲基化是真核生物基因表达渐成性调节的重要机制,主要发生在

对称CpO序列中的C碱基上,通过改变染色体的结构,影响DNA与蛋白质的 相互作用,抑制基因表达。20世纪80年代,Wilsson等测定了体外培养的人、 田鼠及小鼠成纤维细胞DNA的5.甲基胞嘧啶含量,发现均随细胞分裂次

数的增加而降低,且下降速度以人、田鼠、小鼠的次序递减,而永生化细胞
系的5.甲基胞嘧啶含量则保持相对稳定。以DNA甲基化酶抑制剂5.氮杂胞 苷或5.氮脱氧胞苷处理人二倍体成纤维细胞或某些肿瘤细胞,可使其增殖 能力下降,体外培养寿限缩短。因此,DNA甲基化水平也可以作为细胞分裂 的。计时器”嘲。体内实验同样发现基因组整体甲基化水平有随龄降低的

趋势咖.在基因组整体甲基化水平降低的同时,衰老过程中也伴有个别基
因甲基化水平增高的现象。最早证明与年龄相关启动子CpG岛的甲基化 是人结肠组织雌激素受体(est rogen receptor,ER)基因,年轻个体中,几乎 检测不至lJEg基因的甲基化,以后,随龄逐渐升高。另外,胰岛素样生长因子2 (insulin—likegrowthfactor,IGF2)、肌原调节蛋白MYODl、体觉诱发电位 组份N33基因启动子CpG岛的甲基化水平在正常的结肠组织中同样随龄 升高嘲。也许,这些特定基因的甲基化是更好的衰老生物学标志。

8.5衰老相关B.半乳糖苷酶活性 1995年,Dimiri等汹?州发现了细胞衰老的另一个特征。即体外培养人 二倍体成纤维细胞在pH;为6时,其B?半乳糖苷酶染色的阳性率随代龄增加

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而增加,他们把这种中性B.半乳糖苷酶定义为衰老相关的B.半乳糖苷酶。 正常皮肤成纤维细胞体外培养时随着增殖能力的丧失,sA-B-Gal阳性细

胞的积累速度也加快。永生化细胞检测不到sA.B-Gal的活性,转基因技术 诱导永生化细胞衰老的同时,也诱导衰老相关B.半乳糖苷酶的活性;当然, 寿命延长的细胞也呈现出与年轻的细胞相似的正常的表型及基因型。而且, 老年皮肤组织切片衰老相关B.半乳糖苷酶染色的阳性率高于年轻个体,提
示这种中性B.半乳糖苷酶是一种很好的可用于体内外衰老研究的生物学 标志。

8.6晚期糖基化终产物(advanced glycosylation

end

product,AGE)水平

生物体内的非酶促糖基化反应(nonenzymatic glacation,NEG),,是葡 萄糖等还原糖与蛋白质、脂类、核酸大分子中的游离氨基发生的加成反应, 该反应的早期产物是不稳定的氨基酮糖类(Schiff碱),经重排后形成果塘 胺类糖基化蛋白质(Amadori产物);其中的糖类部分经氧化裂解形成带荧

光的棕色化合物,即AGE.AGE在340nm~360rim波长的光激发下,在 420rim~480nm波长闻有一个发光高峰。AGE的形成是一个不可逆的过
程.随个体的增龄在体内逐渐积累,对半寿期长的蛋白质影响尤大呻’伽. 组织中AGE的积累,影响蛋白质,脂类、核酸的结构,造成这些物质生物学 功能的改变,是临床上老年性疾病的病理基础之一.目前,研究最广泛、常 作为AGE代表的是戊糖素f Pentosidine)和羧甲基赖氨酸 (Carboxymethyllysine,CIVIL)。在人晶状体等富含胶原的组织中,其生理水 平都随龄逐渐积累,CML是迄今已知含量最高的AGE产物形式,戊糖素 的含量只占总AGE的1%,但普遍存在于人体蛋白质半衰期长的组织中, 在体外培养的人成纤维细胞中,其水平随代龄的增加而升高,在人血液T淋 巴细胞中,亦随龄积累”。”1.限制热卡摄入可降低啮齿类动物戊糖素的生

成率。Sell等检测八种哺乳动物皮肤戊糖素水平发现,其生成率与物种的最
大寿限负相关.有学者提出AGE,尤其戊糖素可作为衰老的生物学标志。

8.7基因表达谱

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很早就有学者提议以基因的变化可作为衰老细胞的永久的生物学标 志.基因芯片技术是建立在杂交理论基础上的全新技术,它利用固定在芯 片上的几千至几万条探针与样品进行杂交,在一步实验中获取大量信息. 1999年,lee等首次将基因芯片技术应用于衰老体系。他们以Affymetfix公 司含有6347种鼠基因(约占鼠基因组的10%)的cDNA芯片分析青年鼠, 老年鼠及限食老年鼠骨骼肌的转录情况发现,衰老过程中介导压力反应基
因、DNA损伤诱导以及神经元生长因子基因明显上调,而参与能量代谢及 生物合成等基因则明显下调。限制热卡摄入使老年鼠的基因表达谱移向青 年鼠基因表达谱口羽。以包含人类所有基因的DNA芯片检测细胞的基因表 达情况无疑是该细胞最好的衰老生物学标志,但目前还不能获得包含人类 全基因组的DNA芯片,另一个制约DNA芯片技术广泛应用的原因是其高额 的耗费.

9细胞周期与细胞衰老
细胞周期是细胞生命活动的基本过程,细胞在周期时相的变迁中进入

增殖、分化、衰老和死亡等生理状态㈨。细胞周期运转是十分有序的,沿 着Gl期一s期吒2期一晰期的顺序进行。G1期是启动细胞周期循环的关键,其 中存在两个关键的细胞周期检验点。一个是存在于酵母中DNA合成开始前 的启动点和高等真核生物Gl/s期交界处的R点(又称限制点)。衰老细胞的
细胞周期常阻滞于Gl/S期或62/s期,尤其是Gl末期的限制性调控点。R”点 的阻滞。参与细胞周期调控的分子有:细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周 期蛋白依赖激酶(CDK)磷酸化酶和细胞周期蛋白依赖激酶抑制蛋白 (CDI)Ⅲ一.细胞周期与细胞衰老之间的关系,就体现在这些蛋白的信号 转导上,但是衰老对细胞信号传递系统的影响迄今还没有一个全面的认识, 其原因一方面是因为衰老本身的分子机理尚未完全明确,另一方面,信号 传递系统本身的复杂性也增加了这一研究领域的难度。下面就一些已经研 究清楚地举例说明.

9.I

Rb蛋白与衰老的关系

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Rb蛋白有活性的低磷酸化和失活的高磷酸化两种形式存在.低磷酸 化的Rb蛋白阻滞细胞于G1期。磷酸化的Rb蛋白减轻它的抑制作用。从Gl 期到S期的过程需要磷酸化的pRb,而磷酸化的pRb主要受cyclinD-CDK复 合物CDK4和CDK6,及cyclinE-CDK2复合物的调节。cyclinD-CDK复合物是 Gl期Rb蛋白的磷酸激酶。也就是说Rb蛋白是cyclinD-CDK复合物作用的底 物。在整个G。期,Rb蛋白去磷酸化;Rb与E2E形成复合物,抑制转录因子 E2F的活性。在S期前Rb在cyclinD-CDK复合物作用下磷酸化后,E2F被释 放出来,从而细胞由G1期进入S期㈨.其后岛蛋白保持磷酸化状态直到有 丝分裂后期。Rb在年轻的细胞中大部分为磷酸化状态;在衰老细胞中主要 为低磷酸化状态,是衰老细胞阻滞于Gt期的一个原因。 磷酸化

RB======?pRB



?

CDK2/cyclinE,CDK4/cyclinD,CDK6/c:yclinD

RB—E2F不能释放E2F,使细胞处于G1期。正常情况下,由M到Gl时, pRB转变为RB;RB突变或与EIA、E7、SV40大T抗原结合时,RB失活,造成 细胞周期失控及细胞恶性增殖啪。

9.2 cyc I.n-CDK复合物与衰老的关系

cyclin分A、B、C、D、E5种。其中C、D、E为Gl期蛋白,在Gl期和 G1/S期交界处发挥作用:A、B为M期周期蛋白,在Gz/M期交界处发挥功 能,诱导细胞分裂旧。大量证据表明,细胞周期蛋白与细胞衰老关系密切, 如cyclinB降解受阻,则抑¥IJcdc2(CDKl)失活,细胞不能退出M期:细胞 周期蛋白D和CDK4--CDK6形成复合体可催化Rb蛋白磷酸化,推动细胞周期 进程m1。衰老人成纤维细胞中非活性细胞周期蛋白E/cDK2和细胞周期蛋 白D/CDK4聚集,CDKI因子增多,对蛋白激酶C的激活能力及c—fos的 诱导性下降,Rb蛋白不能磷酸化,则使细胞不能通过。R”限制点丽阻滞于

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Gl期㈣。Bringold将与衰老有关雕3CDKI途径归纳为p16‘“/Rb、pl旷f/ p53/p21““及FrrEN/p27“”.p16‘“选择性的抑制cyclinD-CDK4-CDK6,因
此进而抑¥IJpRb磷酸化。

9.3

Ras信号通路 有关实验证明,Ras可促进细胞分化和周期阻滞,Ras突变可诱导

PCI2细胞周期进程和细胞永生化趋势侧。MAPK的量影响Ras对细胞周期 的调控,低水平的活性MAPK可诱导永生化NtH3T3细胞Dl表达,促进细胞
周期:而高水平的活性MAPK则诱导p21““表达,导致细胞周期阻滞。活性 MAPK持续的作用可调控CCl39细胞中cyclinDl的表达嗍.即MAPK的作用 机制有细胞类型的特异性。体外培养的鼠和人成纤维细胞中导入Ras蛋白 Raf-I、ER或活性MEK,则细胞表现出衰老特征,p21”f'和p16““表达水平

上升:如药物抑¥|JRaf/MEK/MAPK活性则Raf对p16‘“及对衰老的诱导性
下降叫1.显微注射p38、MKK6阻滞细胞于G1期,而JNK则无此作用哪!。 体外培养大鼠肝细胞不论是年轻或衰老,其EGFR量几乎一样,而ERK和Ras 对EGF的诱导反应性却不同,可能是衰老细胞的调节蛋白Shc不能和EGFR 形成稳定的复合体啪1。

9.4端粒/端粒酶相关信号 前面已阐述了端粒与衰老的关系,知道细胞每分裂1次,端粒即丢失 若干个碱基对,当端粒缩短到一定长度时,通过激活pRb和p53等途径,细 胞出现复制性衰老特征,停止增殖。但端粒的长度随增龄而缩短的机制还 不清楚,目前的假说认为端粒的T--loop环结构阻抑了修复蛋白对DNA损 伤的修复,导致单链损伤,阻抑复制,当损伤积累到一定程度时即导致T— loop环松散,使富含G的单链游离于核浆中,失去正常T-loop环的保护 作用,该游离的G单链诱导p53的高表达。因此认为T-loop单链断裂形成 的G单链是复制性衰老的启动信号嘲。端粒酶的调控是多因素的,包括端 粒酶基因的表达、转录后蛋白间的相互作用及蛋白磷酸化。~些原癌基因 及肿瘤抑制因子直接或间接参与端粒酶活性的调控。包括细胞周期蛋白酶

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C、Bel—2、p21wafl、Rb、p53、PKC、^kt/PKB及蛋白磷酸酶2A嘲,利用

反义核酸技术抑制端粒酶活性,可见入乳腺癌细胞端区长度缩短嘲.端粒
酶活性和端区长度的维持对于延缓衰老具有一定意义,揭示与此相关的信

号传导机理也将是一个重要的课题.

10细胞衰老与肿瘤
不同物种的比较发现,增殖潜能与动物预期寿命直接相关。老年动物
皮肤纤维母细胞的增殖能力低于年轻动物。.campisimJ指出,与永生细胞或 增殖寿命延长的细胞相比,正常增殖衰老的细胞发展为癌的可能性极小。。 虽然癌症发生的多步骤理论足以独立解释与年龄相关的发病率增加,但衰

老仍然影响机体对癌易感性的某些因素。因此,年老与年轻动物在同样的
实验条件下发癌的机率不尽相同。例如用二甲苯诱导鼠皮肤癌时年老者较 年轻者更易患癌。但也有作者认为,种属差异、重要脏器功能异常及致癌

物的剂量较宿主的年龄更重要。癌症易感性的遗传倾向是由于个体对遗传 物质的监控和损伤修复能力的差异所致。已证明DNA修复机制与年龄相
关。 衰老使得细胞进入不可逆转的增殖抑制状态,但仍然具有代谢活性,

这被称为终末增殖停滞(termal

proliferative life span

arrest);而

肿瘤发生早期事件是逃脱衰老进入永生化嘲。虽然细胞衰老与肿瘤的发生 在分子和细胞水平是两个截然不同的生命现象,但是细胞增殖衰老的紊乱
则最终导致细胞生长失控,细胞衰老的停滞主要发生在G1期,Gl期也是人 类肿瘤突变最常见的。因此确定衰老相关基因,对于认识肿瘤发生及肿瘤 抑制都将是非常有意义。 根据国外学者推测,细胞衰老基因可分两种,一是细胞增殖相关基因, 如p53、Rb、p16等;二是端粒酶相关基因。前者有部分被克隆。并被认为 是肿瘤抑制因子。后者的克隆研究正在开展。因此理论上讲细胞衰老基因 可能有助于肿瘤的早期诊断。而且如果能确定大量的衰老基因,那么通过 采用抑青4端粒酶活性或诱导肿瘤细胞重新获得衰老的方法,束抑制肿瘤生

长可能成为现实。目前仍有很多基因未被克隆,已发现的基因也很难用于

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肿瘤的早期诊断.如果能将大量衰老基因克隆,并将它们制成基因芯片, 进而结合常规诊断。这必将大大提高早期肿瘤诊断的特异性和敏感性?另
外,抑制端粒酶活性,重新诱导肿瘤细胞衰老也有着诱人的应用前景,但 目前仍存在着许多困难。

综上所述,细胞衰老是一个很复杂的涉及到内外因素的分子事件,其 形态和功能的变化受到基因的影响。我们己经对线粒体在衰老过程中生物

学性状的改变有了一些认识,但要彻底揭示其本质,还有待于进一步的研
究和探索。这些研究将对衰老指标的测定,抗衰老药物研究及措施的评估
有重要意义。

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附:公开发表的学术论文
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2杨玲麟,邢玉芝,胡火珍.体外分离与培养SD乳鼠神经干细胞实验过程
中部分方法的改进‘中国临床恢复》2005,vol9(17):38—40 3林洪、王有为、邢玉芝、杨玲麟、胡火珍.刺五加对大鼠脑缺血损伤修 复作用的研究《四川大学学报》(自然科学版),2006,43(1):217—221.(核 心期刊收录)

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本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的
研究工作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标

注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果,也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或
证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。

本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导 下取得的,论文成果归四川大学所有,特此声明。

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首先衷心感谢三年来导师胡火珍教授对我的谆谆教诲和悉心关怀,导 师严谨、精益求精的治学态度给我留下了难以磨灭的印象,激励我在学习 中刻苦钻研,这也将是未来人生道路中不断进取的的动力源泉。本论文也 是在导师胡火珍教授严密的学术指导和科学的技术训练下得以完成的。在 此对我的导师胡火珍教授表示由衷的敬意和感谢! 感谢本教研室内杨抚华老师、李虹老师、杨春蕾老师、刘全胜老师、 孔祥丽老师对我的关心、指导和帮助。感谢已经毕业的三位师兄在分子实 验技术方面给予我的帮助和指导。还要感谢黄淑华博士、杨玲麟博士和陈 玉师妹的大力协助。同时,也要感谢和我一起战斗的林洪硕士、王有为硕
士给予的帮助。

再次衷心感谢所有关心和帮助过我的同学和朋友,感谢我的家人给予 的全力支持。正是他们的关照和鼓励,使我勇敢地克服了一个个困难,同 学情谊,永铭记在心。滴水之恩,当以涌泉相报。谨以此文作为一份特别 的礼物,献给为我引路,助我成长的师长,献给所有关心帮助我的同学朋 友,献给养育并期望我成才的家人。

邢玉芝 2006年5月

D-半乳糖诱导生物体衰老与细胞衰老模型的实验研究
作者: 学位授予单位: 邢玉芝 四川大学

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目的:探讨研究菟丝子醇提液对衰老大鼠体内非酶糖基化和自由基的抑制作用及机制.方法:大鼠随机分为青年对照组、衰老模型组和模型给药组,用 D-半乳糖制造衰老模型,同时模型给药组灌服菟丝子醇提液并在不同时间杀鼠,测定糖化血红蛋白(GHb)、糖化血清蛋白(GSP),丙二醛(MDA)水平及超氧化 物歧化酶(SOD)活性.结果: 菟丝子醇提液使大鼠GHb、GSP、MDA水平明显减低(P<0.05,P<0.01),SOD活性显著升高(P<0.01).结论: 菟丝子抑制非酶糖基化 反应,减少自由基生成,具有一定的抗衰老作用.

2.学位论文 肖政华 益气升阳法对D-半乳糖衰老小鼠免疫功能的影响及抗自由基作用的实验研究 2007
目的:通过观测益气升阳法的代表方益气聪明汤对D-半乳糖衰老小鼠免疫功能的影响及抗自由基的作用,探讨其延缓衰老的可能机理,为益气升阳 法延缓衰老在临床上的应用提供新的理论和实验依据。 方法:60只健康昆明种小鼠随机分为正常对照组,模型组,益气聪明汤大剂量组(27g/kg/d)、中剂量组(13.5g/kg/d)、小剂量组(6.75g/kg/d),维 生素E对照组(VitE50mg/kg/d),除正常对照组外,其余各组采用D-半乳糖皮下注射建立衰老模型。在造模的同时,模型给药组分别灌胃相应浓度药物 0.2ml/10g/d;正常对照组、D-半乳糖模型组灌胃0.2ml/10g/d的生理盐水。6周后,测定血清超氧化物歧化酶(SOD)的活性、丙二醛(MDA)、白细胞介 素-2(IL-2)的含量,计算胸腺指数、脾脏指数,MTT法测定脾T、B淋巴细胞增值活性。 结果:模型组与正常组比较血清SOD活性显著降低,而血清MDA含量显著升高,表明D-半乳糖亚急性衰老模型复制成功。益气聪明汤三个治疗组均能不 同程度升高血清SOD的活性、降低血清MDA含量,且升高与降低的幅度与其剂量呈正相关,提示益气聪明汤有良好的抗自由基作用。与正常组比较,模型 组脾脏指数、胸腺指数;血清IL-2含量;脾淋巴细胞增值活性均显著降低,提示D-半乳糖致亚急性衰老模型小鼠可导致免疫衰老,亦可反证衰老的免疫 学说。同时益气聪明汤三个治疗组均能不同程度升高小鼠免疫器官指数、血清IL-2含量、脾淋巴细胞增值活性,且升高幅度与其剂量基本呈正相关,益 气聪明汤大剂量组与正常组相比已经没有明显差异,提示益气聪明汤有良好的增强衰老模型小鼠免疫功能的作用。 结论: 1. D-半乳糖可成功诱导亚急性衰老小鼠模型,表现为机体抗氧化能力下降,血清SOD活性下降,MDA含量升高。D-半乳糖衰老模型稳定、可靠,可 用于抗衰老药物的筛选。 2.益气聪明汤代表的益气升阳法有良好的延缓衰老的作用,其机理可能与该方能够增强机体的免疫功能、提高超氧化物歧化酶活性、减轻自由基损 伤有关。

3.期刊论文 朱云超.ZHU Yun-chao 参七汤对D-半乳糖致衰老大鼠模型自由基代谢的影响 -湖北民族学院学报(医 学版)2007,24(3)
目的 探讨参七汤对D-半乳糖致衰老大鼠模型自由基代谢的影响.方法 雄性健康sD成年大鼠40只,随机分为正常空白对照组、单纯模型组、维生素E组 、参七汤组.各组大鼠末次给药后,测定其脑组织中的SOD(超氧化物歧化酶)、MDA(丙二醛)、NO(一氧化氮)、NOS(一氧化氮合酶)含量.结果 模型组大鼠脑 组织中SOD含量显著降低,MDA、NO、NOS的含量显著增高,与空白对照组比较,均有显著性差异(P<0.01);参七汤组、维生素E组大鼠脑组织中SOD的含量明 显增高,MDA的含量显著减少,与模型组比较,均有显著性差异(P<0.01),参七汤组、维生素E组之间无统计学意义;参七汤组NO、NOS的含量显著减少,与模 型组比较,均有显著性差异(P<0.01);而维生素E组大鼠脑组织中No、NOS的含量无明显变化.结论 参七汤能减轻D-半乳糖致衰老模型大鼠脑组织自由基对 机体的损伤,具有良好的抗自由基作用.

4.期刊论文 崔旭.李文彬.张炳烈.蔡雨顺.孙晶波 自由基损伤与D-半乳糖所致细胞老化关系 -基础医学与临床 2000,20(1)
实验观察了D-半乳糖(D-galactose),超氧阴离子自由基和H2O2对培养人胚肺二倍体成纤维细胞(Human fetal lung fibroblast,HBS)的促老化作用 .结果表明,D-半乳糖和均使细胞增殖速度减慢,分裂周期中G2-M期细胞比例减少、G0-G1期细胞比例增加、DNA含量下降,此外,细胞中SOD含量降低,丙二醛 (Malondildehyde,MDA)水平升高.H2O2上述作用不明显.提示,在D-半乳糖的代谢过程中可能产生了等活性氧自由基,本身和/或其与H2O2进一步反应生成的 羟自由基(.OH)过量引起的组织细胞损伤及抗氧化酶活力下降、过氧化产物增多可能是D-半乳糖诱发细胞老化的主要原因.

5.期刊论文 艾秀峰.陈民利.潘永明.朱科燕.肖慧.余佳.谢日青.冷晓霞.陶涛.AI Xiu-feng.CHEN Min-li.PAN Yong-ming.ZHU Ke-yan.XIAO Hui.YU Jia.XIE Ri-qing.LENG Xiao-xia.TAO Tao D-半乳糖致衰老模型大鼠肝肾功 能和自由基代谢与中药的干预作用 -中国比较医学杂志2010,20(5)
目的 观察D-半乳糖致衰老模型大鼠血糖血脂、肝肾功能和自由基代谢的变化,探讨中药的干预作用及其抗衰老的机制.方法 大鼠每日皮下注射D-半 乳糖,连续造模7周,建立大鼠衰老模型,造模同时,用抗衰老片和首乌延寿片进行干预,测定试验大鼠的血糖血脂、肝肾功能和SOD、MDA、Na+-K+-ATPase和 Ca+ + -Mg+ +-ATPase等自由基代谢指标.结果 造模7周后,模型对照组衰老大鼠TG、BUN明显升高(P<0.05,P<0.01),AST、ALP、CREA呈上升趋势 (P>0.05),肝、肾组织SOD活性明显降低(P<0.05),肾组织MDA含量明显升高(P<0.05),肝组织Na+-K+-ATPase和Ca+ + -Mg+ +-ATPase活性均显著降低 (P<0.05,P<0.01);给予抗衰老片和首乌延寿片后,衰老大鼠TG、AST、BUN、CREA和UA均显著降低(P<0.05,P<0.01),肝、肾组织MDA含量显著降低 (P<0.05),SOD活性显著升高(P<0.05,P<0.01),肝组织Na+-K+-ATPase和Ca+ +-Mg+ +-ATPase活性均显著升高(P<0.01).结论 D-半乳糖致衰老大鼠模型的血 脂上升、肝肾功能异常和抗脂质过氧化的能力下降;给予抗衰老片和首乌延寿片后,可有效改善衰老大鼠的糖脂代谢和肝肾功能,提高肝肾组织的抗脂质过 氧化的能力,提示中药的抗衰老作用可能与其抗氧化作用有关.

6.期刊论文 刘晓秋.李卫东.唐惠琼.连至诚 D-半乳糖衰老大鼠自由基代谢状况分析 -中国老年学杂志2001,21(6)
目的建立大鼠D-半乳糖衰老模型,检测其脑、胃、肝、大肠、小肠细胞浆及线粒体自由基代谢相关指标(SOD、CAT、XOD、MDA、ONOO-).方法引用模糊 综合分析的数理统计方法,与对照组比较,对以上脏器细胞浆及线粒体自由基代谢相关指标进行模糊综合分析.结果发现线粒体SOD、CAT、XOD、MDA、 ONOO-的综合作用对衰老有影响,影响程度为45%;而细胞浆SOD、CAT、XOD、MDA、ONOO-的综合作用对衰老影响较小,影响程度为40%.通过检测脑细胞蛋白 质羰基含量,发现该模型脑细胞蛋白质羰基含量显著升高,经中药复方治疗后其脑细胞浆蛋白质的羰基含量明显降低.结论自由基代谢变化可能仅是D-半乳 糖衰老大鼠的表现或机理之一,说明自由基衰老理论不能完美解释该模型.初步认为该模型可能包含羰基毒化机制.自由基代谢的改变可能是脑细胞蛋白质 羰基化的主要原因,此外D-半乳糖衰本身亦可能致该模型大鼠脑细胞蛋白质羰基化.

7.期刊论文 蔡大勇.黄启福.陈金星.张伟.王雪.孙丽萍.张家俊 丹栀逍遥散防治D-半乳糖拟阿尔茨海默病的抗自由 基损伤机制 -中国药师2004,7(1)
目的:探讨丹栀逍遥散(DZXYS)防治D-半乳糖(D-galactose,D-gal)致拟阿尔茨海默病(AD)模型的作用机制.方法:大鼠皮下注射D-gal 150

mg/(kg·d)×49 d造模,以0.54 mg/(kg·d)盐酸多奈哌齐为阳性对照药物,用12.64 g/(kg·d)DZXYS同步灌胃给药防治模型损伤.第42~46天进行水迷宫 实验和跳台实验;第50天处死大鼠取脑组织,生物化学方法检测脑组织超氧化歧化酶(SOD)活性和脂质过氧化物(MDA)含量.结果:①DZXYS提高AD大鼠主动学 习记忆成绩的疗效优于盐酸多奈哌齐.②DZXYS恢复AD大鼠被动学习记忆成绩的疗效相当于盐酸多奈哌齐.③DZXYS使造模大鼠大脑SOD活性从352.67±37 71回升到(380.73±14.85)u/mg-pr(P<0.05).④DZXYS使造模大鼠大脑MDA含量从7.88±0.70回降到(6.64±0.80)ng/mg-pr(P<0.01).结论:减轻自由基损 害是DZXYS防治拟AD模型动物的主要机制之一.

8.学位论文 孙秀兰 适宜应激延缓衰老机理的研究--自由基机制 1999
该工作采用D-半乳糖衰老小鼠模型(D-半乳糖0.12mg/g/d×6周,腹腔注射),以在18℃水温中每天游泳15min作为适宜应激、连续给予应激六周后,观察 适宜应激过程中氧化和抗氧化系统的变化,探讨自由基在适宜应激抗衰老机制中的作用.该研究表明:适宜游泳应激延缓小鼠的衰老进程与自由基有关.其 机制可能是:通过增强小鼠衰老过程中SOD的活性,调节氧化和抗氧化系统之间的平衡,减少自由基的毒性产物如MDA、脂褐素等的堆积,降低线粒体膜脂的 粘滞度,保证膜脂合适的流动性,提高Na<'+>-K<'+>-ATP酶的活性,从而改善衰老小鼠的学习记忆能力,延缓衰老进程.

9.期刊论文 潘光辉.陈国华.孟祥凤.沈守祥.PAN Guanghui.CHEN Guohua.MENG Xiangfeng.SHEN Shouxiang 平脉通 颗粒对D-半乳糖所致亚急性衰老模型自由基代谢的影响 -中国现代医生2009,47(27)
目的 探讨平脉通颗粒对D-半乳糖所致亚急性衰老模型自由基代谢的影响.方法 Wistar大鼠60只,随机分为模型对照组、平脉通组.选用昆明种小鼠 60只,随机分为模型对照组、平脉通组.实验结束后将大鼠处死,断头取脑,制成10%的组织匀浆,测定一氧化氮(NO)、脂褐素(LP)、丙二醛含量(MDA)及超氧 化物歧化酶活力(SOD);收集小鼠血液测定SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、MDA含量.结果 平脉通组与模型对照组比较,均有显著性差异 (P<0.05,P<0.01),平脉通组中大鼠脑组织中NO含量显著增加,LP和MDA显著减少(P<0.01),小鼠血清中SOD、GSH-Px的含量(P<0.05,P<0.01)明显提高 .结论 平脉通颗粒使D-半乳糖所致亚急性衰老模型NO含量增加,调整自由基代谢,提高抗氧化酶的活力,抑制自由基对机体的损伤,改善机体衰老导致的各 种病理变化.

10.学位论文 刘金双 天然牛磺酸抗衰老作用的研究 2006
本文以衰老的自由基理论为主要依据,通过牛磺酸的体外自由基清除实验和对果蝇、小鼠的抗衰老实验等四部分内容,研究了牛磺酸的抗衰老作用 。 1、牛磺酸对果蝇的抗衰老实验中采用不同浓度的牛磺酸喂养果蝇,通过牛磺酸对果蝇寿命及果蝇体内脂褐素含量影响,研究牛磺酸对果蝇的抗衰老 作用。结果表明(1)各剂量牛磺酸组果蝇的平均寿命指标都较空白对照组有所提高。其中以中剂量组(50mg/100g)的延寿作用最为显著;且中剂量组果蝇 体内的脂褐素含量最低,与空白对照组比较具有统计学意义(P<0.05),且中剂量组与VE组果蝇的寿命、脂褐素含量指标接近。(2)高剂量牛磺酸对果蝇 的延寿作用强于低剂量组,但还稍弱于中剂量组;高剂量牛磺酸组果蝇的脂褐素含量与中剂量组果蝇的脂褐素含量接近,与空白对照组比较具有显著性 差异(P<0.05)。 2、牛磺酸的体外自由基清除部分研究了牛磺酸对AP-TEMED体系产生的超氧阴离子(O2-)和Fenton体系所产生的羟自由基(·OH)的清除作用,以及对 卵黄脂蛋白PUFA体系LPO反应的抑制作用。实验结果表明,(1)体外牛磺酸对超氧阴离子和羟自由基具有较强的清除作用,且同等浓度的牛磺酸对超氧阴 离子的清除作用较对羟自由基的清除作用强;而对卵黄脂蛋白PUFA体系LOP反应的抑制作用较弱,始终维持在10%左右。(2)牛磺酸对超氧阴离子和羟自 由基的清除作用都随着剂量增加逐渐增强,但随着牛磺酸浓度的增大,对自由基的清除率(抑制率)的增加幅度逐渐减小;牛磺酸对卵黄脂蛋白PUFA体系 LPO反应的抑制作用与剂量无关。 3、通过连续42天给小鼠颈背部皮下注射100mg/kgdD-半乳糖,建立亚急性小鼠衰老模型,以模拟机体自然衰老所出现的一些症状,并测定正常对照 组、模型对照组(生理盐水)、低(D一半乳糖+0.5%牛磺酸)、中(D-半乳糖+1%牛磺酸)、高(D-半乳糖+2%牛磺酸)剂量牛磺酸组及阳性对照VE组(D-半乳 糖+0.5%VE)小鼠的各种衰老生化指标,研究牛磺酸对小鼠的抗衰老作用。实验结果表明:(1)与模型对照组相比,各剂量牛磺酸能不同程度地促进小鼠 生长发育、增强免疫器官系数,延长小鼠的负重游泳时间以提高其抗疲劳能力;此外,各剂量牛磺酸还能不同程度地增强衰老模型组小鼠肝脏组织中的 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力,血清中的过氧化氢酶(CAT)、超氧化物岐化酶(SOD)的活力,降低小鼠肝脏中过氧化脂质降解产物MDA的含量,提高 皮肤组织中羟辅氨(Hyp)酸含量。这些结果证明牛磺酸具有拮抗机体衰老的作用,并能延缓皮肤的衰老。(2)值得注意的是:中剂量牛磺酸组(1%)、高剂 量牛磺酸组(2%)的抗衰老能力显著优于低剂量牛磺酸组(0.5%);且中剂量牛磺酸组的抗衰老指标与高剂量牛磺酸组的抗衰老指标相当接近,这表明牛 磺酸的抗衰老作用并不随剂量的增加呈现出直线的剂量增加-效应增强关系。(3)通过与公认的抗衰老物质VE比较,发现中、高剂量组牛磺酸对小鼠的抗 衰老功效接近于VE接近,且个别指标(负重游泳能力)还优于VE组。 4、采用H2O2致小鼠外周血淋巴细胞DNA造成损伤的体外实验模型来模拟体内由羟自由基堆积对机体造成的损害,并结合单细胞凝胶电泳实验 (SCEG)从分子细胞水平上研究牛磺酸对小鼠淋巴细胞DNA的保护作用,结果表明适当剂量(1%和2%)的牛磺酸可以拮抗H2O2对淋巴细胞造成的损伤,降低 H2O2造成的拖尾细胞的百分率和拖尾细胞尾长,起到保护淋巴细胞的作用。而4%牛磺酸不但不能对DNA起保护作用,反而还能增加拖尾细胞百分率和拖 尾细胞尾长,加重了对DNA的损伤。 结论:在一定的剂量范围内牛磺酸具有抗衰老作用。推测其作用机理可能是于牛磺酸具有较强的抗氧化作用有关:牛磺酸分子中含有的共轭双烯键 是自由基的有效的淬灭剂和捕捉剂,这些双键可与自由基结合,清除体内过量的自由基,特别是对超氧阴离子和羟自由基的清除;并能通过提高抗氧化 酶的活性,阻断组织内脂质过氧化链式反应,以降低脂质过氧化物对机体的损害,达到延寿抑衰的功效。

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