当前位置:首页 >> 能源/化工 >>

报告基因技术的理论基础及其应用


报告基 因技术 的理 论基础 及 其应 用
刘 志锋







第 一 军 医 大学病理 生 理 学 教 研 室 和 全军 休 克 微 循 环 重 点实 验 室 广 州
,



摘要

报 告 基 因 技 术

广 泛 地 应 用 于 监 测 细 胞 的信 号 转 导 和 基 因 表 达 通 过 把 转 录 控 制 元 件 剪 接 到
, ,

报 告 基 因 可 以 直 观 地 报 道 细 胞 内与 基 因 表 达 有 关 的 信 号 级 联
可 靠 而 且 适 用 于 大 规 模 检 测 等优 点








这 种 检 测 具 有 敏感 性 高 方 便
,





随 着 报 告基 因 技 术 及 其 检 测 方 法 的 不 断 改进 荧 光 素酶 绿 色
, , , ,



荧 光 蛋 白 以 及 新 近 克 隆 出的 红 色 荧 光 蛋 白作 为 无 害 性 的 检 测 工 具 将 在 检 测 活 体 组 织 和 细 胞 基 因
表 达 方 面 得 到 越来 越广 泛 的应 用
,



此 外 在 研 究疾 病 发 生 的分 子 机 制 基 因 治 疗 和 药物 开 发 方 面
。 、 。

报 告 基 因 技 术 也 将 发挥 出重 要 作 用 关键 词

本 文 对 报 告 基 因 技 术 的基 础 理 论 常 用 报 告 基 因 的 种 类 和 特

点 以 及 其 目前 的 主 要 应 用 作 了概 括 性 介 绍 学科分类号

报 告 基 因 荧 光 蛋 白 信 号检 测 基 因表 达

细 胞外 刺 激 如 多 肤 类 固 醇激 素 细 胞 因 子 和





因 的 表 达 必 须 不 改变 受 体 细 胞 或 生 物 的生 理 活 动



神经 递 质 等 与 细 胞 表 面 或 细 胞 内 的 受 体 相 互 作 用
可 引 发 一 过 性 信 号 激 活 一 系 列 转 录 因 子后 最 终 使
,
,

二 报 告 基 因 的 类 型及 特 点



一 氯霉 素 乙 酞 基 转 移 酶

氯霉 素 乙 酞基转
,

基 因 表 达发 生 变 化
,



通 过 将 反 应 元件 连 接 到报告基

移酶
,

作为


因 然后 有 选 择地 检 测 报 告 基 因 表 达 产 物 即 可 检 测

报告基 因 最 早 主 要 用 于 监 测 细 胞 基 因 的 转 录 活 性

到 相 应 信 号 级 联 反 应 的活 性 及 它 们 在 细 胞 内基 因 表

它 是 一 种 原 核 生 物 蛋 白合 酶 的抑 制 剂 可 使 乙 酞 基

达 和 调 控方 面 的 作 用
,




报 告 基 因 的种 类很 多 其 应
,

从 乙 酞辅酶
, ,

转 移 到氯 霉 素 的



轻 基位
,



这种酶


用 也 非 常广 泛 从 基 因 表 达 的 时 间 空 间 控制 到 受体 的 功 能鉴定 药 物 筛 选 以 及 到 基 因 运 送 系 统
,



性 质 稳定 而 且在 哺乳动物 细 胞 中没 有 内源 性 表达
,

但是 其 检 测 必 须依 赖 于 放射 性 化学物质 虽 然 自动




等都 有涉 及



分析 可 使检 测 相 对 容 易 控 制 一 些 但 其 线 性
范 围和 灵 敏 性 仍 然 比 不 上 其它 报 告 基 因


一 报告 基 因 技 术 的 理 论 基础

报告 基 因
,

是指其表达产物易被



,



半乳糖昔 酶



半 乳糖昔 酶是一 种 细
,

检 测 且 易与 内源 性 背 景 蛋 白相 区 别 的 基 因
,

报告

菌酶 在 分 子 生 物学 中被 广 泛 用 于 监 测 和 校 正 转 染 效率 所以


基 因 技 术 是 通 过 把 已 确 定 的 顺 式 调 控序 列 剪接 到 报
告基 因 上来 控 制基 因 的 活 性 这 些 反 应 元 件 可 以 对

因 其分 析 简 单 且 无 需 使 用 放 射 性 同位 元 素


半乳 糖昔 酶相 比

有 更 好 的优 越 性
,





宿 主 细 胞 中基 因 调 控 和 表 达 的 变 化 起 反 应 从 而 就
,

原 有 的 简 单 的 色 谱 分 析 因 敏感 性 低 线 性 动 态 范 围

可 以 直 观地 报 道 细 胞 内与基 因 表 达 有 关 的 信 号





窄 而 被 更 加敏感 可 靠 的 生 物 或者化学 发 光 检测 所代 替


级联



此外 在 哺乳 动 物 细 胞 中 它 虽 然 有 内 源 活 性 表

报告 基 因 的 优 点 是 细 胞 内背景 活 性 低 而 且 可
,

达 但可 通 过提 高


,

值来 降低其 背景 值
,



以 将 细胞 表 面 的 信 号 放大 产 生 一 个 高敏感 易 检 测

,



三 分 泌 性 碱性 磷 酸 酶

分泌性 碱性磷酸酶
是胎 盘 碱性 磷

的反 应



报告 基 因的选择 依 赖 于 所 使 用 的细 胞 系 和
,

实验 的性质 以 及 对 相 应 检 测 方 法 的 可 行 性 报 告 基 因 的准 则 包 括





选择

酸 酶 的一 种 突 变 形 式
, ,



其 最 大 的优 点 是 表 达后 可 以
, ,

报 告分 子 应 不 存 在 于 宿
应 该有一个

从 细 胞 内分 泌 到 细 胞 外 在 培 养 基 中 就 可 以 很 容 易
检 测 到 因此 可 以 保 持 细 胞 完 整 以 便 于 进 一 步 实
国家杰 出青年 科 学 基 金



主 中或 易 于 和 内源 性 基 因 相 区 别

简单 快速 灵 敏 及 经 济 的 分 析 方 法 来 检 测 报 告 分 子
,

报 告分 子 的 分 析 结 果 应 具 有 很 宽 的 线 形 范

国 家 自然 科 学 基 金

围 以 便 于 分 析启动 子 活 性 的幅 度 变 化

报告基

以 〕

资 助课题



通 讯 作者

验使用



廉 价 的 比 色测 定也 已 经 被 自动 的化 学 发 光
, ,

一 种 新 的会 随时 间改变 颜 色 的 蛋 白将 有助 于 研 究 者 们 监 测 完 整 的 有 机 体 中基 因 表 达 的 活 化 或 抑

测定 所 取 代 而 且 更 适 用 于 高 通 量 筛 选


制 白
,



及 其 同事 培 养 出 的 荧 光 计 时 器 蛋
,



四 荧光 素 酶
,

荧 光 素酶是一 类 能够催 化不
,



是 红 色荧光 蛋 白 的 一 个 变 种 它 可 以 从 鲜 绿 色
, , ,

同底物 如荧光 素 或腔 肠 素 发 生 氧化 发 射 出荧光 的 酶


变 成 黄 色 然后 是 橙色 最 后 变成红色
“ ”
,



他们将 这 种
,

作 为报告 基 因 分 析 最 常 用 的 荧 光 素酶 是 细 菌
、 。

蛋 白的基 因插人 到几 种 不 同类 型 的 细 胞 中 使 它 处 在 某 个 启 动 子 控 制之 下 这 个 特殊 的 启 动 子 可 以 通 过加 热 而 被 激 活
,

荧 光 素 酶 萤火虫 荧光 素 酶 和 最 近 发 现 的花 虫 荧 光 素酶



细 菌荧 光 素 酶 是 一 种 耐 热 的 二 聚 体 蛋 白 这
,



加热之后 较短 的时 间 内 细胞
,

,

就 限 制 了 它 作 为 报 告 基 因 在 哺 乳 动 物 细 胞 中 的应 而 萤火 虫 荧 光 素酶 因 为 其 敏感性 高 和 线 性 范 围

,

发 出 绿 色 的 荧 光 然 后 逐 渐转 为红色 从 而 使研 究 者 可 以 方便 快 速 地 了 解 到 基 因 转 录 的适 时 信 息 〔 〕
、 。

宽 现 已 成 为 哺 乳 动 物 细 胞 中最 常 用 的 报 告 基 因
,

随着 报 告 基 因 及 其 检 测 系 统 的 不 断改 进 对 细

,

萤火 虫 荧光 素 酶也 存 在 有 检 测 和 分 析 不 足 就 是 需
要 裂 解 细 胞 而 后 还 要 加 人 荧 光 素作 为 发 光 底 物
, ,

胞 内基 因 活 性 的 观 察 也 变 得 更 加 直 观 和 形 象 发 光
和 荧 光 检测 也 日益 受 到 重 视

,

,









和荧光
,

针 对这些 缺点 目前 使 用 的可 自动 穿透 膜 并 可 被 磷
酸 化 的 萤火 虫 荧 光 素 脂 则 可 以 避 免裂 解 细 胞
, , , ,

素酶等无 害 高 敏 感 的 报 告 基 因 作 为检 测 基 因 转 位
和 表达 的 手段 目前 受 到 众 多 研 究 者 的 青 睐 此 外






外 随 着不 断开 发 出新 的 发光试剂 也 使其 发 光 反 应
变得 更 加 持 久 而 稳 定 以 至 于 可 以 用 发 光 计 数 器来 ’ 〔」 花虫荧 光 素 酶 进行检 测 同时 也 更 适 用 于
,



突 变 体 蛋 白在 光 谱 特 性 和 信 号 强
,

度 上 均有 明显 的 区 别 这 样 就 可 以 通 过 不 同 的 报 告
蛋 白来 同时监 测 细 胞 内多种 蛋 白 的 表 达 和 定 位
三 报 告 基 因 的应 用
、 。



由于 其 可 催 化 可 穿 透 细 胞 膜 的 腔 肠 素 氧 化 所 以 作
,

为 报告 基 因 其 主 要 用 于 检 测 完 整 的 活 细 胞 系 统 而
,

一 启动子 活性 分析

报 告 基 因技 术 最早 主

且 其 在 哺 乳 动 物 细 胞 中没 有 内源 活 性
五 绿色 荧光 蛋 白
, ,



要 被 用 来 分 析 基 因上 游 区 域 顺 式 基 因 元件 如 增 强 子 和 启 动子 的 活 性


从维多利亚 生物发光水

近 年 仍 有 很 多研究 者 利 用 此


母 中分 离 出来 的 绿 色 荧 光 蛋 白 在无 需 任何 辅 助 因 子 或底 物 参 与 的


技术来 开 展 这 方 面 研 究 体基 因 的转 录 元 件 如
管 紧张 素

,

例如 利 用报告基 因技术
,


已 经 鉴 定 了 与组织特 异 性表 达 和 基 础 表达有 关 的受

情 况 下 即可 自动发 射 出荧 光
,

故其最 大 的 优点是 在
自从
,

肾上 腺 素




毒 覃碱 血
受体基 因 以



无 需裂解 细 胞 的 情 况 下 就 能 检 测 活 体 组 织 和 细 胞
的基 因 表 达 而 且 安 全无 害
,

型 白介 素 一 和 白介 素

,




,




及 一 些 与人 类疾病 有 关 的 靶 基 因 如 半 乳 糖 脑 昔 脂

因 克 隆 以来 已 经 有 多 种
,

突变 体 问 世 有 蓝 绿 黄 色荧
,

酶 和 巨 球 蛋 白基 因

此外 利用 这 种技术也 已 经
、 、 十 、

色荧光 蛋 白
光蛋 白
蛋白 优于野生 型
, , ,

鉴 定 了 一 些 与雌 激 素 雄激 素 甲 状 腺 素
,



一氧

和蓝 色荧光

化 氮 反应 有关 的 启 动 子 序 列 和 一 些 与 调 节基 因 表 达
相 关 的转 录 因子 而 且 利 用 此 技 术 还 可 以 有 选 择 地 改 变 不 同 基 因 的 表 达 水平 〔 〕



它 们都 显 现 出

的特 性 闭



六 红色荧 光蛋 白
,

红 色荧 光蛋 白

二 基 因 转 移 分析
可 被 应用 于 监 测 基 因 转 移

报 告 基 因作 为 标 记 物 还


是最 近被 克 隆 出的一 个


例如 荧

,

的荧 光蛋 白 作为一 种 潜 在 的 表 达 示 踪 剂 和 融 合 伴

光激 活 细 胞 分 类 法
,



,

已 经 引起 了 广 泛 关 注

我 们构建 了红 色 荧
,

就是利 用


作 为 标 记 物来 检 测 基 因


光蛋 白融 合 载体 并 在

细 胞 中进 行 表 达 结 果 ‘ 因 有 其 特 有 的优 越 性 〔 〕 表 明红 色 蛋 白作 为 报 告 基
和 以 前 的报 告 蛋 白相 比 其 除 了 具 有 可 自动 发 出 荧
,

在植物 酵母 和 哺乳 动 物 细 胞 中 的 转 移
,

最初 报告



基 因技术 主 要 被 用 于 培 养 的 细胞 而 近 来 则 更 多 的
用 于检测 基 因 在 转 基 因 动 物 和 转 基 因植 物 中 的表 达


光 高 的性 噪 比 易 检 测 等 优 点 外 还 对 极 端
,







如 在 转基 因 小 鼠 中

,

可 被 用 作 标 记 物来 分
,

及 光 漂 白作 用 都 有极 好 的 抗 性
,



但是

,

也存在
,

析 启 动 子 图谱 和 研究 基 因 表 达 的 调 节 而 卜半 乳 糖 昔 酶也 已 经 被 用 于 监 测 神 经 移 植 的 效 果 以 及 体 内

一 些 缺 点 如其 强 的 四 聚 化 作 用 和 成 熟慢 而这 就 使

其在 细 胞 生 物 学 方 面 很 多 潜 在 的 应 用 都 受 到 限 ’ 制


与 衰 老 有 关 的 基 因 突变

在 基 因 治疗领域 报 告 基 因 表 达 系 统也 已 经 被用 于 检测 转 移基 因 表 达 的模 式



,



运送

叮 和定位



而 要 回 答 这些 问题 就需 要 用 简单 敏感 无 害 的 方法





三 信号 转 导 通 路 的 活 性 检 测


信号是如何

来直接观 察 细胞 内 的 活 动 报 告 基 因 技 术 在很 大 程 度 上 初 步 解 决 了 这 些 问 题 尽 管 还 不彻 底 但 其 在 众
, ,

,

从 细 胞 表 面 传递 到 细 胞 内 细 胞 内信 号 机 制 是 如 何
受 到控 制 以 及 不 同信 号 通 路 间是 如 何交互作 用 的 都 是 目前 受 到 众 多 关 注 的 问 题 对
一 。

多 领域 里 的 广 泛 应 用 已 经 证 明 了 这 种 技 术 的 优 越 性


我们构建 了
,



随着 这 种 技 术 的不 断 完 善 其 也 将 会 影 响 到 药

,

,

启 动子 驱 动 的 荧 光 素 酶 报 告 基 因 系 统 来 研 究

物 开 发 基 因 运 送 和 基 因 治疗 以 及 与基 因 表 达 有 关
的细胞 内调 控 机 制 方 面 的 研 究
,

信 号 转 导 通 路 的激 活 作用 与其诱 导 转 录 活性 的作 用 就 是 这 方 面 应 用 的 一 个 很
。 〕
,



此 外 随着 从 深 海
, ,

微 生 物 中不 断发 现 更敏 感 和 更特异性 的 发光报告 基
因 以 及 其 检 测 方法 的不 断改进 报 告 基 因 技 术将 必

好例证

四 受体 功 能 鉴 定
,

报 告 基 因技 术 还 可 被 用


然 会成 为 研 究 细 胞 内信 号 转 导 和 疾病分 子机 制 的 通 用 技术之 一 〔
‘ “

于 膜 受 体 和 细 胞 内受 体 的 克 隆 功 能 表 达 及 其 特 性

」,

同 时 也将 为新 疗法 的 开 发 提 供 一 个


方 面 的研究 尤其是 在 研 究 激 动剂 或 拮 抗 剂 在 改 变
活 细 胞 中受 体 活 性方 面 的 作 用 上 都 是很 有 价 值 的 五 细胞 毒性 检 测


新 的 高 通 量 筛 选 技 术平 台 参




,



半乳糖昔 酶 和荧 光






素 酶报 告基 因 共转 染 细 胞 用 敏感 的 比 色 计 和 发 光

计 检 测 系 统观察 报 告 基 因 的 表 达 可 用 来检 测 细 胞 的
,

,

,



极性和 活力



另外 利 用 稳 定 转染 报告基 因 的细 胞
,




株 进 行 生 物 学 筛 选 可 以 来 研究 药物 的细 胞 毒性
六 生物大分子 的相 互 作 用




,

,



荧 光共振 能 量
,

转移
一 个适 宜 的 相 对位 置 及 相 距






,



,

,


, ,

指 两 个有 重 叠 的激 发 吸 收 光 谱 的不 同发光色 团 在 时所产 生 一 种

,



龚小卫 秦 清 和 王 静珍 姜 勇
, ,

红 色荧光 蛋 白
, ,

可 用 快 速成 像 流 式 细 胞 仪 或 能 量 转移 现 象 激 光共 聚 焦 显 微 镜 来 进 行 检 测 通 过 选 择 两种

融合载 体 的 构 建 及 表 达

, ,

第一 军 医 大学学 报

光 谱 合 适 的荧 光 蛋 白 我 们 就 不 仅 能 在 活 细 胞 内 同
,


,

,

时进 行 不 同蛋 白质 的示 踪 还 可 检 测 蛋 白 分 子 之 间 或 者 蛋 白分 子 内部 的相 互 作 用
,

,

,



,



,

七 药物 开 发 的生 物筛选
,

随着 分子 生 物学
,

的 发展 越 来越 多 的 孤 儿 受 体 已 经被发现并 克隆 其 配 体 和 信号 转 导 机 制 虽 然 未 知 但 却 有 可 能 成 为 药



,, ,

,

,

,



,


,
,

物筛 选 中 的 新 靶 标
,



由于 报 告 基 因 技 术 在
、 、




程 中具 有 较 高 的 可 靠 性 可 重 复 性 敏 感 性 和 适 用 性 使其 更 适 用 于 以 细 胞 为 基 础 的 体 外 生 化 分 析
,



其 优点 是稳定 性 好 而 且 可 以 提 供 受 体
,

,



配体相互
, , ,

,

,



作用 以及 信号 转 导 通 路 方 面 的信 息 而 这 用 传 统 的
受 体 配 体 结 合 实 验 和 第 二 信使 检 测 都 是 无 法 得 到 的



, ,


,






此 外 报 告 基 因 的活 性 可 以 在 培 养 的 活 细 胞 中
, ,




保 持几个 星 期 甚 至 更 长 这 就 使 我 们 可 以 对 药 物 耐
药 性 和 副作 用 的适 应 性 改变做 长 期 观察
四 展望
、 。



,

,



如 何解 释 在 细 胞 和 整 体 水 平 上 所 发 生 的 各 种 反 应 以 及 这些 反 应 是 如 何 在 单 细 胞 水 平 和 器 官水 平
,
,

,



被调 控 的 这 是 我 们 所 面 临 的 一 个 重 大 研 究 课 题

,




相关文章:
转基因技术及其在棉花育种中的应用
基因技术及其在棉花育种中的应用_农学_农林牧渔_专业资料。转基因技术在棉花育种中的应用杨金惠 812031001 作物领域 2012 级 摘要:棉花是一种重要的经济作物,在...
常见的报告基因
这些常用的报告基因也可被联合应用,同时检测 2 个甚至 3 个基因表达。报告基因的选择依赖于其灵敏性、可靠性及监测的动力学范围。稳定性好的报告基因适于基因...
报告基因
筛选出与已知顺式作 用元件相结合的未知因子的 DNA,该项技术正广泛应用于克隆...报告基因技术的理论基础... 3页 免费 双荧光素酶报告基因分析 4页 免费 双荧光...
双报告基因测试技术
报告基因测试技术 在用萤火虫荧光素酶定量基因表达...偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础...另外,PLB 抑制发泡,非常适合高通量应用,可用于自动...
荧光素酶及其报告基因的应用和检测
荧光素酶及其报告基因的应用和检测_生物学_自然科学_专业资料 暂无评价|0人阅读|0次下载|举报文档荧光素酶及其报告基因的应用和检测_生物学_自然科学_专业资料。...
绿色荧光蛋白作为报告基因在分子生物学中的应用
绿色荧光蛋白作为报告基因在分子生物学中的应用_生物学_自然科学_专业资料。今日...报告基因 3页 免费 报告基因技术的理论基础... 3页 免费 荧光蛋白研究进展 11...
转基因食品问题调查报告
转基因食品问题调查报告_调查/报告_表格/模板_应用文书。毛泽东思想和中国特色社会主义...转基因技术的理论基础来自 DNA 双螺旋结构的发现,DNA 分析结果明确地证明了地...
Luciferase 报告基因技术(promega)
自 1986— 1987 年首次被当作报告基因使用以来,荧光素酶基因已成为目前运用 最广泛的报告基因之一。尽管来自不同物种的荧光素酶及底物存在有很大的差异,但有一个...
双荧光素酶报告基因系统的应用研究进展
双荧光素酶报告基因系统的应用研究进展_生物学_自然科学_专业资料。双荧光素酶报告基因系统的应用研究进展 摘要:双报告基因即在一个信号系统内同时表达,但独立测量的...
Gus报告基因在植物功能基因研究中的应用
2 浙江农业科学院病生所,杭州 310021) 摘要:近十年来,植物转基因技术取得了显著的进展,许多转基因植物不断问世,其中报告 基因 GUS 在基因工程和遗传 转化中发挥...
更多相关标签:
基因工程的理论基础 | 基因工程理论基础 | 开题报告 理论基础 | 法学基础理论与应用 | 信息论基础理论与应用 | 应用分支理论基础 | 体育基础理论与应用 | 应用分支理论基础pdf |