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应用气味指纹技术检测猪肉假单胞菌


※分析检测

食品科学

2009, Vol. 30, No. 18

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应用气味指纹技术检测猪肉假单胞菌
胡惠平,潘迎捷,刘 源,孙晓红,赵 勇 *
(上海海洋大学食品学院,上海 201306)

摘   要 研究从猪肉中分离的假单胞菌在胰酪胨大豆肉汤

(TSB)纯培养条件下产生的挥发性代谢产物(MVOCs)及其气 : 味指纹,以为将来气味指纹技术应用于食品中微生物的快速无损检测提供理论依据。利用电子鼻(E-nose)和顶空 -固 相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)对3株从猪肉中分离的假单胞菌在TSB中产生的挥发性代谢产 物进行检测分析。结果显示:通过主成分分析(PCA)和判别因子分析(DFA),E-nose 能明显区分 3 株假单胞菌。进 一步用 HS-SPME-GC-MS 对挥发性物质进行分析,2- 丁酮、氯二溴甲烷、异戊酸、2- 甲基丁酸、2- 甲基 -5-(甲 基硫)呋喃是铜绿假单胞菌(Pa)所产生的;3,5- 二甲基辛烷、6- 甲基 -5- 庚烯 -2- 酮、2- 乙基己醇、十二烷烃、2,6, 10- 三甲基十二烷、 (1E)-1- 乙缩醛 -1H- 茚、1,5- 二甲基萘是恶臭假单胞菌(Pp)所产生的;2- 戊酮、甲硫醚、乙酸 丁酯、硫代丁酸甲酯、1- 环十二烷烯、戊基环丙烷、3- 丙酰吡啶、3- 苯基呋喃是荧光假单胞菌(Pf)所产生的; 3 株假单胞菌之间存在着差异。通过检测假单胞菌的挥发性代谢产物,E-nose 和 HS-SPME-GC-MS 气味指纹技术能 快速的将假单胞菌进行区分鉴别,表明该技术可以应用于假单胞菌等食品中微生物的快速无损检测。 关键词:电子鼻;顶空 - 固相微萃取 - 气相色谱 - 质谱联用技术;假单胞菌;微生物挥发性代谢产物

Application of Odor Fingerprint for the Detection of Pseudomonas spp. Isolated from Pork
HU Hui-ping,PAN Ying-jie,LIU Yuan,SUN Xiao-hong,ZHAO Yong* (College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Abstract:Microbial volatile metabolites (MVOCs) of three Pseudomonas species isolated from pork during pure culture fermentation in tryptic soy broth (TSB) were analyzed for chemical composition using headspace solid-phase micro extraction/gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME/GC-MS) and odor fingerprint using electronic nose (E-nose) for laying a theoretical basis for the rapid and non-destructive detection of microorganisms in foods using odor fingerprint technique. E-nose could clearly distinguish the three Pseudomonas species through principal component analysis (PCA) and discriminant function analysis (DFA). HS-SPME/GC-MS analysis indicated that the MVOCs of Pseudomonas aeruginosa consisted of 2-butanone, dibromochloromethane, isovaleric acid, 2-methylbutanoic acid, 2-methyl-5-(methylthio)furan, Pseudomonas aeruginosa 3,5dimethyloctane, 6-methyl-5-heptene-2-one, 2-ethylhexanol, dodecane, 2,6,10-trimethyldodecane, (1E)-1-ethylidene-1H-indene, and 1,5-dimethylnaphthalene, and Pseudomonas putida 2-pentanone, methylthioacetate, butyl acetate, S-methyl butanethioate, 1-cycloundecene, pentylcyclopropane, 3-propionylpyridine, and 3-phenylfuran. The combination of E-nose and HS-SPME/GCMS provides a rapid and non-destructive detection method of Pseudomonas spp. and other microorganisms in foods. Key words :electronic nose (E-nose); headspace solid-phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry (HSSPME-GC-MS); Pseudomonas spp.; microbial volatile metabolites (MVOCs) 中图分类号:TS201.3  文献标识码:A 文章编号:1002-6630(2009)18-0327-06

微生物挥发性代谢产物(microbial volatile organic compounds,MVOCs)是微生物代谢产物的重要组成部 分,携带有丰富的生化信息,是人类了解微生物生命
收稿日期:2009-06-16

活动本质规律的重要窗口[1]。有些 MVOCs 具有微生物种 属特异性[2-3] ,因此,通过分析这些 MVOCs 及其它们所 形成的气味指纹图谱,可以对微生物进行鉴别和检测[4-5] 。

基金项目:上海市青年科技启明星计划项目(07QA14047);上海市科技兴农重点攻关项目(沪农科攻字 2005 第 4-2 号; 沪农科攻字 2006 第 10-5 号);上海市创新行动计划项目(08390513900) 作者简介:胡惠平(1982 -),女,硕士研究生,研究方向为食品安全。E-mail:huhuiping0223112@126.com * 通讯作者:赵勇(1975 -),男,副教授,博士,研究方向为食品生物技术、食品安全。E-mail:yzhao@shou.edu.cn

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1.3 1.3.1 方法 菌液的制备

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常见的检测 M V O C s 气味指纹技术主要有气相色谱法 (GC)、气质联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、 液质联用法(LC-MS)和电子鼻法(E-nose)等。 Tracey 等[6] 较早用 GC-MS 分析 MVOCs 区分 3 个属 的 18 株乳酸菌。Alugupalli 等[7] 用 GC-MS 通过检测 Mycobacterium xenopi 的特征性代谢产物 2-docosanol,来 做饮用水中 Mycobacterium xenopi 的检测。为了快速诊 断菌血症,Allardyce 等[8] 通过 MVOCs 检测了血平板上 的 铜 绿 假 单 胞 菌 、肺 炎 双 球 菌 、 大 肠 杆 菌 、金 黄 色 酿脓葡萄球菌、脑膜炎奈瑟氏菌。最近,Siripatrawan 等[9] 用固相微萃取 - 气相色谱 - 质谱联用技术(SPME-GCMS)检测了新鲜包装蔬菜中污染的鼠李沙门氏菌。这些 研究结果表明,通过 M VO Cs 可以对微生物进行检测、 区分。 随着气味指纹技术的发展,电子鼻技术在这个领域 逐渐成为研究热点。电子鼻技术是以样品的整体气味物 质作为研究对象,这就减少了样品的前处理过程。 Dutta 等[10]应用 Cyranose 320 电子鼻技术区分 6 株引起眼 部感染的细菌。同样,Pavlou 等[ 1 1 ] 运用电子鼻技术区 分了 14 株梭菌属(Clostridium spp.)细菌和 12 株 Bacteroides fragilis 细菌的气味指纹。可见,电子鼻技术能快速 无损检测微生物。电子鼻的检测对像是样品的整体气味 信息,不能对气味成分的单个物质进行检测,因此, 把 GC-MS 联用技术和电子鼻技术结合起来能更全面更详 细检测样品的挥发性物质成分。 假单胞菌是一种引起猪肉腐败的常见微生物,为了 确保食品品质,快速检测假单胞菌很有必要。本研究 利用顶空 - 固相微萃取 - 气相色谱 - 质谱联用技术(H SSPME-GC-MS)结合电子鼻技术分析从猪肉中分离的假单 胞菌纯培养后的挥发性代谢产物气味指纹,为气味指纹 技术用于微生物快速无损检测提供参考。 1 1.1 材料与方法 菌种与培养基

将斜面保藏的菌种副溶血性弧菌接种到10ml TSB液 体培养基中,然后于 30℃、180r/min 的条件下摇床过夜 培养备用。对备用的副溶血性弧菌菌液进行一系列的 10 倍梯度稀释,取某一稀释度的稀释液 0.5ml 于装有 4.5ml 液体培养基的 15ml 顶空样品瓶中,置于 30℃、180r/min 的条件下摇床培养 18h,用于 HS-SPME-GC-MS 和 E-nose 对其气味的检测。每个样品做 3 个平行。 1.3.2 E-nose 实验 样品制备:用分析天平称取菌液(2.0000 ± 0.0001)g 于 10ml 小瓶中,用于电子鼻顶空直接分析。顶空样品 制备( 由进样器自动完成): 加热箱温度 3 7 ℃,振荡速 度 500r/min,每个样品加热 600s。 分析条件:以合成的干燥空气为载气,流速 150ml/min, 注射体积 2500μl,注射针温度 47℃,注射针总体积 2.5ml, 注射速度 2500μl/s,获取时间 120s,延滞时间 600s。每 个待检测的菌样在上述条件下重复分析 6 次。 1.3.3 HS-SPME-GC-MS实验 顶空固相萃取操作条件:把 15ml 装有 5ml 菌液的样 品瓶于 37℃磁力搅拌器上加热平衡 15min后, 使用SPME 萃取头进行萃取。顶空吸附 30min 后,将萃取头插入 GC 进样口,解析 5 m i n 。 气相色谱条件:DB-35 MS 弹性毛细管柱(30m × 0.25mm,0.25μm); 载气:氦气;柱流量:1ml/min; 不分流进样;柱初温 30℃,保持 3min,以 5℃/min 升 至 160℃,以 13℃/min 升至 250℃;进样口温度 250℃。 质谱条件:传输线温度 280℃;离子源温度 230℃; 四极杆温度 150℃;电子能量 70eV;质量扫描范围 m/z 30~400。 1.3.4 数据分析方法

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)、恶 臭假单胞菌(Pseudomonas putida,Pp)、荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens,Pf)、由本实验室从猪肉中 分离。 胰酪胨大豆肉汤(TSB) 美国 BD 公司。 1.2 仪器与设备 GC6890-MS5975气相色谱质谱联用仪 美国Agilent Technologies 公司;手动 SPM E 进样器;DVB-CARPDMS(二乙烯苯 - 聚乙二醇二万 -聚二甲基硅氧烷)高度交 联萃取头(50μm × 30μm) 美国 Supelco 公司;Fox-

1.3.4.1 电子鼻数据分析 将电子鼻获得的样品数据信息用 Alpha soft 11.0 软 件进行统计学分析,包括主成分分析(PCA)、判别因子 分析(D FA )。 1.3.4.2 相似度计算 利用中南大学和香港理工大学研制开发的计算机辅 助相似性评价系统软件(1.315 版),计算样品色谱图之间 的全谱相似性。 1.3.4.3 色谱图解谱 GC-MS 检测的化合物经计算机检索同时与 NIST05 Libra ry 相匹配,仅报道匹配度大于 80% 的鉴定结果。 定量方法采用面积归一化法,计算每种物质的相对百分 含量。

4000 气味指纹分析仪(电子鼻)、HS100 电子鼻配套设备 自动进样器 法国 Alpha MOS 公司。

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2 2.1 2.1.1 结果与分析 电子鼻结果分析

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D FA 经过一系列数学变化,在充分保存现有信息的前 提下,使同类数据间的差异性尽量缩小,不同类数据 间的差异尽量扩大 [ 1 3 ] 。图 2 中横、纵坐标的含义与图 1 一样。
% 103 0 67. 2 F1 D 0
-2
0 .02 2 0.0 2 0.0 2 0.0 20
-5 -1 0

主成分分析(PCA) PCA 是将所提取的传感器多元指标信息进行线性转

换和数据降维。它是一种重要的特征提取与无教师的模 式识别方法。在分析过程中,将前 2 个或 3 个主成分在 2 维或 3 维图上表示出来,便可以直观地进行分析 [ 1 2 ] 。
4% 6.39 D F3 -

20

DF 210

26

.50
1

4%
-1 0
5 0

0

20

时第 1 主成分、第 2 主成分和第 3 主成分的贡献率。贡 献率越大,越能反应原来多元指标的信息。一般主成 分相加大于 70%~85% 即能采用 PCA。
PC 2
4

0

DF 2

20

-2 10 6.5 04 1 - % 10

1DF

2% .44 - 8 1 0 0.05 PC 0.05
1

0.0

-12
0

A.胰酪胨大豆肉汤(TSB);B. 铜绿假单胞菌(Pa);

.45

.1 - -0
2

-0

4%
.04

C . 恶 臭 假 单 胞 菌 ( P p );D . 荧 光 假 单 胞 菌 ( P f ) 。 图 2   3 株假单胞菌的 DFA 图 Fig. 2 DFA three dimension scattering diagram of the three
1 2

% 3.655 P C3 -

1 0.0 0 1 0.0 - 02 0 . 0.0 - 4

0.0

PC 2

-1

0

2.

45



4%

0.

04



1- 0.

0.

05

0

0.

0 - - 00.02 . 05 0 1

3.6

55%

0.0

0.0

PC 3 -

A B C D

Pseudomonas species

本实验对样品重新进行了 DFA,结果如图 2 所示。 与图 1 相比,4 个样品有着很好的区分度,把原本重叠 的样品进行了很好的区分,拉大了不重叠样品间的距 离,还缩小了平行样间的距离,可见,电子鼻技术不 仅能对气味差别大的样品进行很好的区分,而且也能很 好的区分气味相似的样品,该结果表明电子鼻技术能将 铜绿假单胞菌(Pa)、恶臭假单胞菌(Pp)、荧光假单胞菌 (Pf)和空白 TSB 培养液的气味指纹图谱完全区分开来, 可以用于微生物的区分与鉴定。 2.2 2.2.1 HS-SPME-GC-MS结果分析 样品间总离子图的相似性分析

PC

81 1-

.4

42

%

A.胰酪胨大豆肉汤(TSB); B.铜绿假单胞菌(Pa); C . 恶 臭 假 单 胞 菌 ( P p );D . 荧 光 假 单 胞 菌 ( P f ) 。 图 1   3 株假单胞菌的 PCA 图 Fig.1 PCA three dimension scattering diagram of the three Pseudomonas species

图 1 是 3 株假单胞菌的 PCA 图。传感器阵列进行主 成分分析得到前 3 个主成分的贡献率分别为:81.442%、 12.454%、3.655%,累积贡献率为:97.551%(> 70%~ 85%),已经包含了很大的信息量,因此样品 PCA 分析 结果图能够反映样品的整体信息。图 1 中,3 株假单胞 菌菌液与空白 TSB 培养液有着明显的区分度,说明 3 株 假单胞菌经纯培养后都产生了明显不同于空白培养液的 气味,而铜绿假单胞菌(Pa)菌液与恶臭假单胞菌(Pp)菌 液有一定的重叠,表明铜绿假单胞菌(Pa)和恶臭假单胞 菌(Pp)两者培养后产生了相似的气味,还有荧光假单胞 菌(Pf)菌液与恶臭假单胞菌(Pp)菌液挨得很近,说明荧光 假单胞菌(Pf)经培养后产生了与恶臭假单胞菌(Pp)相近的 气味,可见 PC A 分析并不能把所有样品区分开来,这 就需要对样品进行进一步的分析。 2.1.2 判别因子分析(DFA) DFA 是一种通过重新组合传感器数据来优化区分性 的分类技术,它的目的是使各个组间的重心距离最大同 时保证组内差异最小,改变组的划分会改变其分布。

利用计算机辅助相似性评价系统软件比较 4 个样品 的总离子图,样品的总离子图如图 3 所示。各取 4 个样 品的 2 个平行样进行比较分析。结果显示,空白 TSB 培 养液的 2 个平行间的相似度为 0.9907,铜绿假单胞菌(Pa) 的 2 个平行间的相似度为 0.9803,恶臭假单胞菌(Pp)的 2 个平行间的相似度为 0.9862,荧光假单胞菌(Pf)的 2 个平 行间的相似度为 0.9899,表明各样品的平行样具有很好 的重复性。 同时,软件也对 4 个样品间的相似度进行了分析, 结果见表 1 。从表 1 可以得出,3 株假单胞菌菌液与空 白培养液的相似度相差很大,可见假单胞菌经培养后产 生了明显不同于空白培养液的气味。铜绿假单胞菌(Pa) 和恶臭假单胞菌(Pp)相似度达到了 0.9886,产生的气味 较为相似。荧光假单胞菌(Pf)和恶臭假单胞菌(Pp)相似度 为 0. 8433,产生的气味相近。分析结果与电子鼻 PC A 分析结果相一致。



. 67

10

3%

DF 3- 6

.39

本实验采取前 3 个主成分 PCA1、PCA2 和 PCA3 作 3 维散 点图进行分析。PCA 1 、PCA 2 和 PCA 3 显示了 PCA 分析

A B C D

4%

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3500000 A 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 -500000 -5 0

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液 TSB 中检测到 20 种挥发性成分物质,醛类 10 种,酮 类 3 种,酯类 1 种及其他类化合物 6 种。主要的成分是 醛类,占挥发性物质总量的 7 4 . 7 0 % ,其中异戊醛和 苯甲醛是两种主要的物质,分别占挥发性物质总量的 26.70% 和 30.04%。
5 10 15 20 25 30 35 40 Table 2 编号 1 2 3 4 5 时间(min) 表 2   空白 TSB 培养液挥发性成分及相对百分含量 Volatile compounds and their relative contents in TSB 保留时间(min) 1.73 2.047 2.428 2.533 2.593 3.287 3.438 10.778 12.001 13.904 14.099 14.264 14.498 16.752 17.225 17.428 19.535 20.168 27.222 28.605 化合物名称 2- 丙酮 异丁醛 丁醛 乙酸乙酯 三氯甲烷 异戊醛 2-甲基丁醛 庚醛 2,5-二甲基吡嗪 6- 甲基 -5- 庚烯 -2- 酮 辛醛 桉树脑 苯甲醛 2-乙酰基噻唑 壬醛 苯乙醛 L- 樟脑 癸醛 2,4-二叔丁基苯酚 相对含量(%) 5.80 1.59 2.04 4.78 0.86 26.70 5.58 0.45 2.22 1.40 1.27 2.45 30.04 0.39 4.01 2.48 0.86 3.02 1.42

丰度

800000 600000 丰度 400000 200000 0 -5

B

0

5

10 15

20

25

30

35

40

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

时间(min) 10000000 8000000 丰度 6000000 4000000 2000000 0 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 时间(min) 8000000 6000000 丰度 4000000 2000000 0 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 D C

(5Z)-6,10- 二甲基 -5,9- 十一双烯 -2- 酮 0.80

表 3 中,铜绿假单胞菌(Pa)菌液中检测到 31 种挥发 性物质,醛类 3 种,酮类 6 种,醇类 3 种,其他类化
时间(min)

合物 19 种,其中 2- 壬酮是主要的成分物质,占挥发性 物质总量的 18.78%。恶臭假单胞菌(Pp)菌液中检测到 34 种挥发性物质,醛类 4 种,酮类 6 种,醇类 4 种,酯 类 2 种,其他类物质 18 种,其中异戊乙醇是主要的挥 发性物质,占挥发性物质总量的 49.87%。荧光假单胞 菌(Pf)菌液中检测到了 33 种物质,醛类 2 种,酮类 7 种, 醇类 5 种,酯类 3 种,其他类挥发性物质 1 6 种,其 中异戊乙醇、二甲基二硫和 1- 十一碳烯是主要的挥发 性物质,分别占挥发性物质总量的 38.34%、15.95% 和 24.03%。与空白培养液相比,3 株假单胞菌菌液中产生 了大量不同的挥发性物质,主要的物质成分也发生了改 变,只有 2- 丙酮和 2,5- 二甲基吡嗪两种物质成分是空白 培养液和 3 株假单胞菌菌液都含有的。初步判断,空白 培养液中的挥发性物质成分在假单胞菌生长过程中被吸 收代谢,转化成了大量不同的挥发性物质。 3 株假单胞菌菌液的挥发性成分对比,甲硫醇、 1,4- 戊二烯、2- 丙酮、二甲基二硫、异戊腈、2- 庚酮、 2,5- 二甲基吡嗪、2- 壬酮、苯乙酮是 3 株假单胞菌所共 有的;2 - 丁酮、氯二溴甲烷、异戊酸、2 - 甲基丁酸、

A.胰酪胨大豆肉汤(TSB);B.铜绿假单胞菌(Pa); C . 恶 臭 假 单 胞 菌 ( P p );D . 荧 光 假 单 胞 菌 ( P f ) 。 图 3   3 株假单胞菌的总离子流图 Fig.3 Total ion chromatograms (TICs) of MVCOs of the three Pseudomonas species 表 1   样品间的相似度 Table 1 Similarity of TIC of MVCOs of the three Pseudomonas species and TSB 样品名 空白 TSB 和铜绿假单胞菌(Pa) 空白 TSB 和恶臭假单胞菌(Pp) 空白 TSB 和荧光假单胞菌(Pf) 铜绿假单胞菌(Pa)和恶臭假单胞菌(Pp) 铜绿假单胞菌(Pa)和荧光假单胞菌(Pf) 恶臭假单胞菌(Pp)和荧光假单胞菌(Pf) 相似度 0.7915 0.7618 0.6915 0.9886 0.7970 0.8433

2.2.2

样品挥发性物质成分的鉴定 表 2、3 分别列出了空白培养液 TSB 和 3 株假单胞

菌的挥发性成分及相对百分含量。表 2 可见,空白培养

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表 3   3 株假单胞菌挥发性成分及相对百分含量 Table 3

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2- 甲基 -5-(甲基硫)呋喃是铜绿假单胞菌(Pa)所新产生的; 3,5- 二甲基辛烷、6- 甲基 -5- 庚烯 -2- 酮、2- 乙基己醇、 十二烷烃、2,6,10- 三甲基十二烷、 (1E)-1- 乙缩醛 -1 H茚、1,5- 二甲基萘是恶臭假单胞菌(Pp)所新产生的;2戊酮、甲硫醚、乙酸丁酯、硫代丁酸甲酯、1 - 环十 二烷烯、戊基环丙烷、3- 丙酰吡啶、3- 苯基呋喃是荧 光假单胞菌(Pf)所新产生的。结果表明,3 株假单胞菌 在生长代谢过程中产生的挥发性物质有着明显的区别。 3 讨  论

Volatile compounds and their relative contents in MVCOs of the three Pseudomonas species 相对含量(%) 铜绿假单 恶臭假单 荧光假 胞菌(Pa) 胞菌(Pp) 单胞菌(Pf) 甲硫醇 2.11 2.15 3.35 乳酰胺 1.86 - 0.58 1,4- 戊二烯 2.83 1.94 1.46 2- 丙醇 3.51 - 1.82 2- 丙酮 5.70 7.22 1.38 乙酸乙酯 - 6.68 - 2- 丁醇 2.14 - 1.03 2- 丁酮 2.45 - - 三氯甲烷 0.96 - 0.53 丁醇 - 1.12 0.68 异戊醛 2.74 0.64 - 2- 戊酮 - - 0.38 甲硫醚 - - 1.55 异戊乙醇 - 49.87 38.34 二甲基二硫 6.70 2.30 15.95 异戊腈 0.74 0.18 0.34 乙酸丁酯 - - 0.16 氯二溴甲烷 2.08 - - 异戊酸 3.56 - - 2-甲基丁酸 0.44 - - 乙酸异戊酯 - 0.76 1.22 甲基苯肟 6.84 - 0.98 2- 庚酮 1.00 1.32 0.56 硫代丁酸甲酯 - - 0.22 2,5-二甲基吡嗪 1.15 0.32 0.75 3,5-二甲基辛烷 - 0.38 - 2-甲基-5-(甲基硫)呋喃 0.82 - - 柑橘柠烯 9.73 6.38 - 6- 甲基 -5- 庚烯 -2- 酮 - 2.26 - 2-乙基己醇 - 1.56 - 桉树脑 - 1.36 - 1-十一碳烯 9.56 - 24.03 1-环十二烷烯 - - 1.61 戊基环丙烷 - - 0.14 2- 壬醛 2.82 0.38 0.22 1-(1,3- 噻唑 -2-基)乙酮 - - 0.32 2- 壬酮 18.78 4.56 0.42 壬醛 0.54 0.74 - 十二烷烃 - 0.47 - 苯乙酮 0.70 0.52 0.24 2,6,10-三甲基十二烷 - 0.47 - L- 樟脑 0.37 0.74 - 癸醛 - 0.32 0.18 十三烷烃 0.53 0.64 - 3-丙酰吡啶 - - 0.20 1- 亚甲基 -1H- 茚 0.68 0.54 0.18 3-苯基呋喃 - - 0.24 十四烷烃 1.38 0.58 - 2-甲基萘 - 0.29 0.09 (1E)-1- 乙缩醛 -1H-茚 - 0.56 - 1,5-二甲基萘 - 0.25 - 二丁基羟基甲苯 4.30 0.82 0.44 4,6-二叔丁基酚 0.34 0.24 - 1-(3,5-二叔丁基 -40.82 0.28 0.29 羟苯基)-1-丙酮 化合物名称

编号 保留时间(min) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 1.462 1.531 1.574 1.635 1.73 2.528 2.268 2.506 2.589 3.204 3.287 4.089 4.579 4.748 5.749 6.105 7.436 7.93 8.138 8.324 9.378 9.746 10.384 10.54 12.022 12.53 12.642 13.704 13.9 14.216 14.259 14.511 14.754 15.742 16.423 16.752 16.826 17.225 17.429 18.061 19.145 19.531 20.168 20.32 20.593 21.257 22.358 23.047 24.374 24.998 27.868 28.54 28.609 30.513

常见微生物检测方法有很多,传统意义上的方法主 要依靠微生物形态上的生理生化鉴定,耗时长、敏感 度低,很难及时检测出样品中的致病菌。免疫学检测 方法利用抗原抗体的特异性反应,并结合一些生物化学 或物理学方法来进行检测,特异性好、灵敏度高,但 操作繁琐时间长,对实验技能要求较高。分子生物学 方法主要针对核酸进行检测,与免疫学方法一样,特 异性好、灵敏度高,但需要进行细胞破壁提取核酸。 气味指纹技术用于微生物的检测,其主要针对于微生物 的挥发性代谢产物,对样品没有特殊的要求,操作简 单、费时短、灵敏度高,最重要的是在操作过程中不 需对样品进行任何破坏性处理,因而在微生物的快速无 损检测方面具有很好的应用前景。 Irmler 等[14]用电子鼻结合 MS 检测器挑选能产生很好 风味的乳酸菌。他们把乳酸菌接种于氨基酸液中,用 顶空萃取其挥发性物质,然后注入以电子鼻为基础的 M S 检测器中,用 P C A 来区分不同的菌株,在这基础 上挑选能产生很好风味的乳酸菌。Siripatrawan[15] 用金属 氧化传感器结合模式识别快速区别了大肠杆菌和鼠李沙 门氏菌。他把大肠杆菌和鼠李沙门氏菌分别培养于极好 的肉汤中,于 37℃培养,同时以空白培养液作为对照。 培养所得的挥发性物质用 GC-MS 做鉴定,同时用电子 鼻做监测。所得数据用 PCA 和人工神经网络进行分析。 结果发现,大肠杆菌和鼠李沙门氏菌能被很好的进行区 分。本实验采用了电子鼻和 HS-SPME-GC-MS 气味指纹 技术对 3 株从猪肉中分离的假单胞菌在 TSB 中产生的挥 发性代谢产物进行检测分析,结果发现,它们的挥发 性物质有着差异,它们能够被很好的区分。 Miller 等[16]利用 GC-MS 技术检测细菌引起的肉类食 品变质中发现,假单胞菌(Pseudomonas perolens)能够 产 生 乙 醇 、乙 醛 、乙 酸 乙 酯 、丁 酮 、甲 基 硫 醇 、二 甲基二硫醚等 MVOCs。Freeman 与 Stanley 分别在假单 胞菌感染变质的鸡肉[ 17 ] 、牛肉[ 18 ] 中也得到类似的结果, 所检测到的 M V O C s 主要为醇、醛、酮、酸、酯类化 合物。与本实验中检测出醇类、醛类、酮类、酸类、 酯类、含硫化合物结果较为类似,但也存在差异,比

注:-. 未检出。

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2009, Vol. 30, No. 18

食品科学

※分析检测

如烯烃类物质的检出,造成的原因可能是底物不同所引 起的。本实验着重分析 3 株假单胞菌经纯培养后的挥发 性物质,并用空白培养液作为对照,结果发现,3 株 假单胞菌纯培养后产生了明显不同于空白培养液的气味 成分物质,3 株假单胞菌之间也产生了一些不同的挥发 性物质成分如:与其他 2 株假单胞菌相比,铜绿假单胞 菌(Pa )新产生了 2 - 丁酮、异戊酸、2- 甲基丁酸、2- 甲 基 -5-(甲基硫)呋喃。至于这些物质是不是铜绿假单胞菌 (Pa)所特有的,尚缺乏与其他大量菌(包括不同属的、不 同种的、同种不同株的) 的比较。因此若在后期能够进 一步分析更多的细菌挥发性代谢产物,很有可能得到不 同细菌的特异性挥发性产物,从而建立不同细菌的气味 指纹特征图谱库,为将来利用气味指纹技术检测微生物 奠定坚实的基础。
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