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PCR基因扩增


PCR 基因扩增
摘要:PCR 基因扩增受到各种反应要素 (引物、酶、dNTP、模板和 Mg2)和反应 条件(为温度、时间和循环次数)的影响, 在标准反应中采用三温度点法,双链 DNA 在 90~95℃变性(通常为 94℃,1min), 再迅速冷却至 40 ~60℃(通常为,55℃, 1min),引物退火并结合到靶序列上,然 后快速升温至 70~75℃(通常为 72℃,

2min),在 Taq DNA 聚合酶的作用下, 使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长 度为 100~300bp 时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为 一,一般采用 94℃变性,65℃左右退火与 延伸(此温度 Taq DNA 酶 仍有较高的 催 化活性 )。 循环次数为 30 次。 关键词:PCR; 聚合酶链式;反应条件; 影响;温度 化控制 DNA 的变性和复性,并设计引物做 启动子,加入 DNA 聚合酶、dNTP 就可以 完成特定基因的体外复制。 但是,DNA 聚合酶在高温时会失活,因此, 每次循环都得加入新的 DNA 聚合酶,不仅 操作烦琐,而且价格昂贵,制约了 PCR 技 术的应用和发展。发现耐热 DNA 聚合同酶 --Taq 酶对于 PCR 的应用有里程碑的意义, 该酶可以耐受 90℃以上的高温而不失活, 不需要每个循环加酶,使 PCR 技术变得非 常简捷、 同时也大大降低了成本, PCR 技术 得以大量应用,并逐步应用于临床。 类似于 DNA 的天然复制过程,其特异性 依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR 由变性--退火(复性)--延伸三个基本 反应步骤构成:① 模板 DNA 的变性:模 板 DNA 经加热至 93℃左右一定时间后, 使 模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离,使之成为单链,以便它与引物 结合,为下轮反应作准备;②模板 DNA 与 引物的退火(复性):模板 DNA 经加热变性 成单链后,温度降至 55℃左右,引物与模 板 DNA 单链的互补序列配对结合;③引物 的延伸:DNA 模板--引物结合物在 TaqDNA 聚合酶 的作用下,于 72℃左右, 以 dNTP 为反应原料, 靶序列为模板, 碱 按 基配对 与半保留复制原理,合成一条新的 与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循 环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多 的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为 下次循环的模板。每完成一个循环需 2~4 分钟,2~3 小时就能将待扩 目的基因 扩 增放大几百万倍。

聚合酶链式反应简称 PCR(英文全称: Polymerase Chain Reaction),是体外 酶促合成特异 DNA 片段的一种方法,由 高 温 变性、低温退火及适温延伸等几步反应 组成一个周期,循环进行,使目的 DNA 得以 迅速扩增,具有 特异性 强、灵敏度高、操 作简便、省时等特点。它不仅可用于 基因 分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还 可用于疾病的诊断或任何有 DNA,RNA 的 地方.聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, 简称 PCR)又称无 细胞 分子克隆或特异性 DNA 序列体外引物定向 酶促扩增技术。 DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重 要途径。双链 DNA 在多种酶的作用下可以 变性解链成单链,在 DNA 聚合酶 与启动 子的参与下, 根据 碱基互补配对原则 复制 成同样的两分子挎贝。 在实验中发现, DNA 在高温时也可以发生变性解链, 当温度降低 后又可以复性成为双链。因此,通过温度变

1 仪器、材料、试剂与方法 1.1 实验仪器

PCR 热循环仪, 琼脂糖凝胶电泳系统, 凝胶 成像仪或紫外投射仪或 Dark Reader,微 孔加热器(微量恒温器)。 1.2 实验材料 DNA 模板,dNTP 混合物,引物对(正向 引物和反向引物),Ex-Tap 酶,PCR 管, 吸头、小指管,琼脂糖,冰醋酸(HAc), 三羟甲基氨基甲烷(Tris),乙二胺四乙酸 (EDTA),溴酚蓝,蔗糖,GoldView TM 或 EB,乙醇,博大 PCR 产物快速胶回收试 剂盒。 1.3 实验试剂 2.5mmol/LdNTP 混合物,Tap 酶 1U/ul,模板 DNA 1ng/ul,引物对 10mmol/ul, 10×PCRbuffer 含 Mg2+) ( , 50×TAE,10×loading-buffer 1.4 实验设计 1.4.1 PCR 反应体系的配置 取 1 只 0.2mlPCR 管, 分别加入 10×扩增 缓冲液 2ul ,4 种 dNTP 混合物各 200umol/L , 引物各 1ul, 模板 DNA2ul, TaqDNA 聚合酶 0.5ul, Mg2+1.5mmol/L,加双或三蒸水至 12.5ul ,。 1.4.2 扩增 ①把 PCR 管放入 94℃环境中预变性 5min,②在 94℃环境中变性 1min;③ 55℃环境中退火 1min;④72℃环境中延 伸 2min;⑤重复步骤②到④30 次; ⑥72℃ 环境中延伸 10min 1.4.3 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 结果 配置 80%琼脂糖凝胶(1×TAE),50ul PCR 扩增产物+6ul 10×loading- buffer, 恒压 80V, 凝胶成像仪或紫外投射 仪或 Dark Reader 观察记录结果。 2 结果与分析 2.1 温度对 PCR 的影响

2.11 变性温度与时间:变性温度低,解链 不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。一 般情况下,93℃~94℃min 足以使模板 DNA 变性,若低于 93℃则需延长时间,但 温度不能过高, 因为 高温环境 对酶的活性 有影响。此步若不能使靶基因模板或 PCR 产物完全变性,就会导致 PCR 失败。 2.12 退火(复性)温度与时间: 退火温度是 影响 PCR 特异性的较重要因素。变性后温 度快速冷却至 40℃~60℃,可使引物和模 板发生结合。由于模板 DNA 比引物复杂得 多, 引物和模板之间的碰撞结合机会远远高 于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时 间,取决于引物的长度、 碱基组成 及其浓 度,还有靶基序列的长度。对于 20 个核苷 酸,G+C 含量约 50%的引物,55℃为选 择最适退火温度的起点较为理想。 引物的复 性温度可通过以下公式帮助选择合适的温 度: Tm 值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T) 复性温度=Tm 值-(5~10℃) 在 Tm 值允许范围内, 选择较高的复性 温度可大大减少引物和模板间的非特异性 结合, 提高 PCR 反应的特异性。复性时间 一般为 30~60sec,足以使引物与模板之 间完全结合。 2.13 延伸温度与时间:Taq DNA 聚合酶 的生物学活性:: 0~80℃ 150 核苷酸/S/酶分子 70℃ 60 核苷酸/S/酶分子 55℃ 24 核苷酸/S/酶分子 高于 90℃时, DNA 合成几乎不能进行。 PCR 反应的延伸温度一般选择在 70~ 75℃之间,常用温度为 72℃,过高的延伸 温度不利于引物和模板的结合。 PCR 延伸反 应的时间,可根据待扩增片段的长度而定, 一般 1Kb 以内的 DNA 片段,延伸时间 1min 是足够 的。3~4kb 的靶序列需 3~ 4min;扩增 10Kb 需延伸至 15min。延伸

进间过长会导致非特异性扩增带的出现。 对 低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。

响。此步若不能使靶基因模板或 PCR 产物 完全变性,就会导致 PCR 失败。 参考文献:

3 结论与讨论 通过不同变性温度对 PCR 基因扩增反应的 研究,结果表明,93℃~94℃变性 1min, 55℃退火 1min;④72℃环境中延伸 2min,为最适扩增方案,当变性温度低于 93℃时,解链不完全则需延长时间。温度 不能过高, 因为 高温环境 对酶的活性有影

①分子生物学实验指导(魏群主编)。—2 版。—北京:高等教育出版社,2007.11 (2010 重印) ISBN 978-7-04-022501-3


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