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茶叶中有机酸的测试方法概述


第 34 卷第 6 期 2008 年 11 月

中国测试技术 CHINA MEASUREMENT & TESTING TECHNOLOGY

Vol.34 No.6 Nov.2008

茶叶中有机酸的测试方法概述
谭和平, 叶善蓉, 陈


丽, 邹

/>燕

(中国测试技术研究院, 四川 成都 610021 )
要 : 针对茶叶中有机酸测定前处理分析测试条件等不统一, 导致测试结果无可比性的问题, 该文在参阅 1907

年以来国内外关于茶叶中有机酸分析的 30 余篇文献的基础上,对茶叶中有机酸的分析方法做了较系统的归纳阐 述, 并对目前常用的分析方法包括高效液相色谱法、 离子色谱法以及毛细管电泳色谱法等进行了评述, 提出了茶叶 中有机酸测定应进行标准化, 以确保测试结果的可比性。
关键词:茶叶; 有机酸; 分析; 高效液相色谱法; 离子色谱法 中图分类号:TS272 ;TS207.3 文献标识码:A 文章编号:1672-4984 (2008 )06-0077-04

Determination Overview of organic acids in tea
TAN He-ping,YE Shan-rong,CHEN Li,ZOU Yan (National Institute of Measurement and Testing Technology, Chengdu 610021, China ) Abstract:The measurement results of organic acids in tea were incomparable for the different pre-treatments and test conditions. More than 30 literatures since 1907 about the organic acid determinations in tea had been consulted. And these determination methods of organic acids in tea were introduced in detail. The most general methods at present such as high performance liquid chromatography,ion chromatography,capillary electrophoresis, and so on were emphasized. Based on which, the determination method of organic acids in tea should be standardized to improve the comparability of the measurement results. Key words:Tea;Organic acids;Analysis;HPLC;IC

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茶叶中有机酸的种类较多, 含量为干物质总量 的 3%左右。茶叶中的有机酸是香气和滋味的主要 成分之一, 并且参与茶树的新陈代谢, 在生化反应 某些有机酸对 中常为糖类分解的中间产物。此外, 茶多酚激活 α-淀粉酶、 胰蛋白酶酶活性具有协同效 应[1]。因此有机酸的定性与定量分析对茶叶品质开 本 发有重要意义, 在茶叶生产管理过程中必不可少。 文就目前应用于茶叶中有机酸分析的主要方法作 一综述。

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茶叶中有机酸的组成

种维生素; 没食子酸和绿原酸可划归多酚类; 而乙 丙酸、 丁酸以及己烯酸则属于挥发性化合物。于 酸、 是茶叶中所论有机酸, 通常指以下两类: 一是二元 羧酸和羟基多元羧酸 (在分子中含有两个或多个羧 苹果酸、 柠檬酸等; 二是环状结构脂 基 , ) 如琥珀酸、 [2-3] 莽草酸等 。据文献报道, 茶叶 肪酸, 如奎尼酸、 (汤 中经发现的有机酸有 40 余种。其中, ) 茶汤中的 有机酸有 10 余种,香气成分中的有机酸有 30 余 但经氧化 种。有些有机酸如亚油酸本身虽无香气, 后可转化为香气成分; 有些有机酸是香气成分的良 好吸附剂, 如棕榈酸等。

广义地说, 凡含有羧基 (-COOH 的有机化合物 ) 都可以叫做有机酸。然而从茶叶的化学成分和实际 测定观点来说, 某些有机酸已各有归属。例如氨基 酸为蛋白质的基本组成而自成一类; 抗坏血酸是一
收稿日期:2008-05-18 ;收到修改稿日期:2008-07-25 基金来源:国家科技基础条件平台 (2004DEA71180 ) 作 者 简 介 : 谭和平 (1957-) 男, , 重庆市人, 研究员, 主要从事

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茶叶中有机酸的分析方法

关于茶叶中有机酸分析的研究报道还不是很多, 已有报道的方法有滴定法、 原子吸收法、 气相色谱法、 高效液相色谱法、 离子色谱法、 毛细管电泳法等。 3.1 滴定法 滴定法包括酸碱滴定法、 电位滴定法等, 常用 于有机酸总量的测定。酸碱滴定法一般根据酸碱指

茶树生理生化研究。

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中国测试技术

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示剂的颜色变化来确定滴定终点, 但茶叶样品的水 提液或醇提液常常具有较深的颜色, 会干扰滴定终 点的确定。而电位滴定法是利用电位的变化来确定 滴定终点的。因此, 电位滴定法用于茶叶中有机酸 总量的测定更为准确[4]。 3.2 原子吸收法 此法常用于测定茶叶中的草酸含量。其原理是 先用磷钨酸将茶样浸提液中所含多酚类化合物沉 淀分离, 然后再用氨水中和, 并借助含有钙离子的 醋酸缓冲液, 使草酸根沉淀为草酸钙。由于草酸钙 溶解度最小, 而其它各种有机酸已被氨水中和而溶 解, 用火焰原子吸收法测出钙含量, 即可得知草酸 含量。 尹方 [3]使用原子吸收法, 对红茶和绿茶中草酸 进行了测定, 并用高锰酸钾滴定法做为对照。结果 表明, 红茶及绿茶每 100 g 茶样中皆含草酸根 10 mg 左右。 3.3 气相色谱法(GC ) 气相色谱法的原理是根据试样中各组份在气 相和固定液液相间的分配系数不同, 当汽化后的试 样被载气带入色谱柱中运行时, 组份就在其中的两 相间进行反复多次分配, 由于固定相对各组份的吸 附或溶解能力不同, 从而达到分离的目的。该方法 适用于测定茶叶中低分子量的有机酸。气相色谱与 不同的检测器的联用,大大提高了其检测灵敏度。 其中气相色谱和质谱联用 (GC-MS 已成为一种具 ) 有高分离能力、 高灵敏度、 高分析速度和高鉴定能 力的分离检测技术, 它是目前低分子有机酸检测中 酒类、 发 最常见和最精密的方法。该方法在中药材、 酵液、果汁中的有机酸检测方面都有着广泛的应 用。 文献 [5] 使用气相色谱-飞行时间质谱联用法 ) 苹果酸、 琥珀 (GC-TOF/MS 测定了日本绿茶中草酸、 酸、 莽草酸、 柠檬酸、 奎尼酸等六种有机酸的含量, 使 用石英毛细管柱 (30 m×0.25 mm, μm , 0.25 ) 升温程序 80 升温至 330 ℃ (15 ℃/min , ) 然后 为: ℃保持 2 min, 保持 6 min, 各种有机酸的保留时间在 5 min~12 min 之间。 气相色谱法虽然可以对低分子量有机酸进行 分析, 但也存在着局限性。如需对难挥发有机酸进 行衍生,从而导致样品的前处理比较困难且费时、 回收率不高等。 3.4 离子色谱法(IC ) 离子色谱法在有机酸分析中有着非常广泛的

应用,可以按分离原理分为离子交换色谱法 (IEC ) ) 和离子排斥色谱法 (ICE 两种。 3.4.1 离子交换色谱法 (IEC ) 离子交换色谱法的原理是树脂上可电离离子 与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离 子进行可逆交换, 根据各离子与离子交换基团具有 不同的电荷吸引力而分离。该法主要用于分析有机 酸、 氨基酸、 多肽及核酸。 有机酸的 IEC 利用了有机 酸在水溶液中的可离解性。有机酸在水溶液中部分 离解成羧酸根阴离子和氢离子, 羧酸根阴离子在阴 离子交换柱中与固定相的阴离子交换基团相交换 而被保留。各种有机酸因离解度、 荷电性、 亲水性等 差异而得到分离。一般来说, 容易离解的有机酸在 阴离子交换柱中的保留值较大。 用于无机阴离子分离的阴离子交换柱一般都 可以用来分离有机酸。近年来开发出的几种高性能 的低交换容量阴离子交换柱使得多种有机酸的相互 日本横河电机 (Yokogawa systems 的 ) 分离得以实现。 化学结合型阴离子交换柱 SAM 3-075、 日本的 TSK gel IC Anion-PW 和 Shim-pack IC-A1 阴离子交换 柱都可用于茶叶中主要有机酸的同时分离。近年 来, 低电导淋洗液的非抑制型离子交换色谱法的使 用逐渐增多, 这类淋洗液多为有机羧酸及其盐, 如邻 苯二甲酸氢钾等。 张光军等[6]使用离子交换色谱法同时检测了信 阳毛尖、 龙井和茉莉花茶中的有机酸含量。样品前 处理方法为: 各取茶样 0.5 g, 分别浸泡于 80 mL 新 过滤, Shim-pack IC 阴离 过 沸后蒸馏水中 20 min, 子交换柱 (4.6 mm×100 mm) 用 0.75 mmol/L 邻苯 , 二 甲酸氢钾及 0. 25 mmol/L 邻苯二甲酸混合液洗 脱, 然后用离子色谱仪进行分析。三种茶样有机酸 含量分别为: 苹果酸 3.66 mg/g~5.18 mg/g, 柠檬酸 6.94 mg/g~8.94 mg/g, 酒石酸 0.80 mg/g~1.59 mg/g, 琥 [7] 珀酸 49.49 mg/g~66.79 mg/g。 Casella 等 使用铜修饰 电极-阴离子交换色谱法测定了茶叶中的酚酸及有 1.5 机酸。样品处理方法为: g 茶叶用 150 mL 蒸馏 水浸泡 3.5 min, 0.45 μm 微孔膜过滤后直接测定。 文献[8] 使用阴离子交换色谱法测定了茶叶中的酒 苹果酸、 柠檬酸以及琥珀酸。样品前处理简单 石酸、 方便,各种有机酸的检出限在 0.48 mg/L~1.34 mg/L 之间。文献[9]使用阴离子交换色谱法测定了黑茶、 绿茶及乌龙茶中的的苹果酸、 柠檬酸以及琥珀酸。 三种有机酸的检出限分别为: mg/L、 mg/L 及 1.7 6.4 1.5 mg/L。黑茶中三种有机酸含量分别为 0.57 mg/g、

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2.34 mg/g 和 83.97 mg/g。 使用离子交换色谱法分析低分子量有机酸, 无 须对样品进行复杂的预处理, 就能够很好地分离和 同时检测多种有机酸物质。 与离子排斥色谱法相比, 离子交换色谱法分析有机酸的最大优点是: 不受其 他有机物质干扰, 对共存的无机阴离子可同时进行 分离和定量, 因此在实际样品测定中应用较为广泛。 3.4.2 离子排斥色谱法 (ICE ) 在 ICE 分离模式中, 有机酸的分离受溶液中的 ) 容易离解的有机酸或极 唐南 (Donnan 平衡的支配。 性较强的有机酸在柱中的保留值小, 这与离子交换 柱中的情形正好相反。所以, 就整体而言, 模式 ICE 中有机酸的流出顺序与 IEC 模式相反。近年来, 用 于有机酸分离的 ICE 在固定相方面, 仍以大交换容 量的阳离子交换树脂为主导。一些性能较好的 ICE 柱得到应用, Shim-pack SCR-102H 和 Aminex 如 并且还有专门用于有机酸分离的 ICE HPX-87H 等。 柱 问 世 并 得 到 应 用 , 日 本 研 制 的 TSK gel OA 如 pack-A 柱和美国的 Ion-300 柱等。 离子排斥色谱法 所用淋洗液仍多采用稀强酸,如稀盐酸和稀硫 酸。 电导检测与 ICE 分离模式配合使用的实例比以 UV 前有所减少, 检测有所增加。 3.5 高效液相色谱法(HPLC ) 在有机酸分析中, 一般常用的是反相高效液相 ) 有机酸分子 色谱法 (RP-HPLC 。在该分离模式中, 直接在两相中分配, 各种有机酸因分配系数不同而 被分离。 通常使用非极性固定相 (如 C18、 8 , C ) 流动相 乙腈、 异丙醇、 丙酮、 四 为水或缓冲液, 常加入甲醇、 氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。这 种方法适用于分离非极性和极性较弱的化合物。其 分离模式与检测方法多种多样, 可以根据样品的构 流动相、 成与性质来选择合适的色谱条件 (色谱柱、 检 测 器) 一 些 常 见 的 ODS 色 谱 柱 如 Hypersil、 。 Zorbax、 Shimpack、 Novapark、 Kromasil、 μBondpark 等 均可以用于植物性样品中有机酸的分析测定。 有机酸在水中很容易发生电离,产生多峰现 象。为了使有机酸尽可能地以分子形式存在, 一般 使用酸性流动相来抑制有机酸的离解。通常在流 冰醋酸、 磷酸等。赵景 动相中加入磷酸盐缓冲液、 [10] 婵等 研究了在用 RP-HPLC 法测定小分子有机酸 时如何对流动相的酸度进行控制, 给出了流动相的 最佳 pH 的选择通式:色谱柱允许的最低 pH 值≤ 最佳 pH≤pKa-2。 RP-HPLC 分离模式中, 在 由于使 用的是酸性流动相,有机酸在检测器中几乎不离

解, 因此 UV 是通用检测器。RP-HPLC 在现代液相 色 谱 中 应 用 最 为 广 泛 , 它 占 整 个 HPLC 应 用 的 80%。由于其对有机酸分析的简单、 快速和稳定, 该 方法在检测苹果汁、 植物提取液及茶叶有机酸的应 用中越来越普遍。 浙江大学的屠幼英教授等[11-13]对影响紧压茶有 机酸分离的主要因素进行了研究, 并且使用高效液 相色谱法对其中 10 种有机酸进行了测定。 其样品前 处理方法为: 称取 3.0 g 磨碎茯砖茶样, 放入 500 mL 三角瓶中, 450 mL 沸水, 加 置沸水浴上浸提 45 min, 滤液冷却后定容至 500 mL。 抽滤, 用热水洗涤 2~3 次, 滤液过 0.45 μm 滤膜后测定。 实验考察了检测波长、 流动相、柱温和流速对有机酸分离效果的影响, 最 终得到的紧压茶中有机酸分析的最佳色谱条件为: Diamonsil C18 柱 μm, (5 250×4.6 mm , ) 柱温 30 ℃, 检 测波长 210 nm,进样量 15 μL,流动相 0.1 mol/L ) 流速 0.6 mL/min。该 KH2PO(用磷酸调至 pH=2.8 , 4 方法有机酸添加回收率达到 92.5%~101.3%, 相对标 准差 0.62%~2.73%, 各种有机酸浓度与 HPLC 峰面 积的线性相关系数大于 0.94, 具有较高的准确度和 [14] 精确度。 印度的 Jayabalan R 使用 HPLC 方法测定了 葡糖醛酸、 乳酸、 柠檬酸。分析条件 发酵茶中的乙酸、 为: Phenomenex Luna C18 柱 μm, (5 250×4.6 mm , ) 柱温 28 ℃, 流动相为 0.2 mol/L KH2PO4, 流速 1.0 mL/min, 检 进样量 10 μL。 测波长 220 nm, 3.6 高效毛细管电泳法(HPCE ) 高效毛细管电泳是以高压电场为驱动力, 以毛 细管为通道, 依据样品中各组分之间电泳或分配行 为的差异而实现分离的液相分离技术。它有六种常 ) 毛细管胶 用的操作模式, 即毛细管区带电泳 (CZE 、 ) 毛细管凝胶电泳 (CGE 、 ) 毛细管等 束电泳 (MECC 、 电聚焦 (CIEF 、 ) 毛细管等速电泳 (CITP 和毛细管电 ) ) 色谱 (CEC 。 HPCE 为近年来发展最快的一种分离分析技 术, 具有分离效率高、 分析速度 快 、 品 用 量 少 、 样 应用范围广及操作 简 便 易 行 等 优 点 。 自 从 1981 年 Jorgenson J 和 Lukacs K D 使用内 径 为 75 μm 的玻璃毛细管、 施加 30 kV 电压、 用激光诱导荧光 检测器做柱上检测等几项新措施以来, 毛细管电泳 ) 毛细管 拥有了超群的分离效能 (40 万理论塔板数 , 内强大的电渗流可使正负离子向同一方向流动, 因 负电荷离 而在一次进样中可以同时分离测定带正、 子, 分析时间短。从而开始了毛细管电泳技术蓬勃 发展的时期。

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中国测试技术 [5]

2008 年 11 月 Eiichiro F,Takeshi B,et al. Prediction of Wipawee P, Japanese green tea ranking by gas chromatography/mass spectrometry -based hydrophilic metabolite fingerprinting [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, (2 : 55 ) 231-236.

HPCE 在有机酸类成分分析的应用研究中以 CZE 法最多, 它是根据带电溶质在电场中的电泳淌 度的差异而实现分离的, CZE 法较适合带电溶质的 [15] 分离。 文献 使用毛细管区带电泳法分离测定了茶汤 苹果酸、 奎尼酸以及柠檬酸。样品前处理 中的草酸、 方法为: 称取绿茶、 黑茶及普洱茶各 3.0 g, 180 mL 加 沸水, 置沸水浴上浸提 3 min, 抽滤, 用热水洗涤 2~3 次, 滤液冷却后定容至 900 mL, 0.45 μm 滤膜后 过 测定。使用的色谱条件为: 石英毛细管柱 (570 mm× 360 μm, μm , 75 ) 柱温 20 ℃, 电压-20 kV。使用 10 mM 铬酸钠混合 0.5 mMTTAB 及 0.1 mMNa2EDTA 做为 电解液。绿茶及黑茶中各种有机酸的回收率分别 97%~105%和 97%~100%。 各种茶中草酸含量为 为: 12.1 mg/L ~166.3 mg/L, 苹 果 酸 含 量 为 15.8 mg/L ~ 40.9 mg/L, 奎尼酸含量为: mg/L~316.4 mg/L, 13.5 柠 檬酸含量为 3.7 mg/L~31.7 mg/L。

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张光军, 许建文, 丁明玉.离子交换色谱法同时分析绿茶 中有机酸和无机阴离子的含量 [J]. 新乡医学院学报, 2002, (1 : 19 ) 36-38.

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结束语

有机酸是茶叶品质成分的重要物质, 但目前国 内外相关分析方法和标准的研究还不多。根据国内 外专家学者提出的关于茶叶中有机酸测定的方法, 笔者认为对这些方法的前处理、 分析测定条件以及 茶叶中各种有机酸的最佳测试方法等必须进行标 准化研究。只有经过标准化研究, 才能使各实验室 对茶叶中有机酸的测试结果有可比性, 测试结果的 可靠性才能得到保证。
参考文献
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