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人教版教学课件微生物的实验室培养


第一节
第一课时

病毒 微生物 细菌

病毒界

包括哪五类: 放线菌
真菌

原核
真菌界

原生动物 原生生物界

真核

特点:结构都相当简单,多数个体十分微小 (<o.1mm)的生物的总称。 通

常要用光学显微镜 或电子显微镜才能看到,有的甚至没有细胞结构. 且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.

病毒

SARS病毒

禽流感病毒

朊病毒(蛋白质病毒)

真菌

酵母菌和霉菌

如图是酵母菌电子显微 镜下的形态结构

青霉

一、课题目标: 了解有关培养基的基础知识,进行无 菌技术的操作,进行微生物的培养。 二、课题重点和难点: 无菌技术的操作。 三、技能目标: 掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和 平板划线法等基本操作技术,熟练、规范 地进行无菌操作,成功地培养微生物。

一 基础知识:
(1)按培养基的 (2)按培养基的 化学成分分: 物理形态分: ? 液体培养基 · 天然培养基 ? 半固体培养基 · 合成培养基 · 合成培养基 ? 固体培养基 半
阅读课本分别说出 它们的优点、缺点。

(3)按培养基的 功能分: 基础培养基 选择培养基 鉴别培养基

培养基的种类 在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要
的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长。 液体培养基 根据微生物的代谢特点,在培养基中加入某种 例如,在培养基中加入青霉素,以抑制细菌、 指示剂或化学药品配制而成,用以鉴别不同种 据物理性质分 半固体培养基 放线菌的生长,从而分离到酵母菌和霉菌。又 类的微生物。例如,在培养基中加入伊红和美 如,在培养基中加入高浓度的食盐可以抑制多 固体培养基 常用于工业生产 蓝,可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在 种细菌的生长,但不影响金黄色葡萄球菌的生 大肠杆菌等细菌:如果有大肠杆菌,其代谢产 长。 常用于观察微生物的 天然培养基 物就与伊红和美蓝结合,使菌落呈深紫色,并 运动、鉴定菌种 据化学成分分 带有金属光泽。 用于微生物的分离、计数 合成培养基 常用于工业生产 选择培养基 据用途分 鉴别培养基常用于分类、鉴定

选择培养基
加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物 加入青霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞 加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基: 分离杂交瘤细胞

合成培养基:
根据细胞生存所需物质的种类和 数量,用人工方法模拟合成的。 合成培养基主要成分是氨基酸、 维生素、碳水化合物、无机盐和其它 一些辅助物质。 优点:标准化生产,组分和含量相 对固定;成本低 缺点: 缺少某些成分,不能完全满 足体外细胞生长需要。

天然培养基:
天然培养基有血清、血浆、和组 织提取液(如鸡胚和牛胚浸液)。 优点:营养成分丰富,培养效果好 缺点:来源受限;成分复杂,影响对某 些实验产物的提取和实验结果的分析; 易发生支原体污染;

固体培养基:菌落

液体培养基:

表面生长

均匀混浊生长

沉淀生长

半固体培养基:

无动力

有动力(弥散)

(是否运动)

培养基的配制原则:
? ①目的要明确:根据培养的微生物种类、培养的 目的等确定培养基的类型和配制量。 ? ②营养要协调:培养基中各种营养物质的浓度和 比例要适宜。例如:碳氮比4∶1时,谷氨酸棒状 杆菌大量繁殖而产生谷氨酸少;碳氮比为3∶1时, 菌体繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。 ? ③pH要适宜:细菌培养基pH中性或偏碱性,霉菌 培养基呈酸性。 ? 细菌pH为:6.5-7.5;

? 放线菌pH为:7.5-8.5; ? 真菌pH为:5.0-6.0

微生物的五种营养要素
碳源
凡能为微生物提供生长繁殖所需碳元 素的营养物质都称为碳源 。

凡是能为微生物提供所需氮元素的营养 氮源(nitrogen source) 物质都称为氮源。

无机盐(mineral salts) 生长因子
微生物生长不可缺少的微量有机物质叫生 长因子。维生素 氨基酸 碱 基

水(wahtor)
Cncnc-micro

碳源种类
无机C源:CO2、碳酸盐,只能被自养微生 物利用

有机C源:各种糖类,其次是有机酸、醇 类、 脂类和烃类化合物

Cncnc-micro

氮源种类
分子态氮:固氮微生物以分子氮为唯一氮源 无机态氮:硝酸盐、铵盐几乎所有微生物能利用 有机态氮:蛋白质及其降解产物 a实验室常用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏做氮源 b生产用玉米浆、豆饼、葵花饼、花生饼等

Cncnc-micro

无机盐(mineral salts)
无机盐功能 构成微生物细胞的组成成分 调解微生物细胞的渗透压, PH值和 氧化还原电 位 有些无机盐如S、Fe还可做为自养微 生物的能源 构成酶活性基的组成成分,维持酶活 性。Mg、Ca、K是多种酶的激活剂
Cncnc-micro

无机盐种类
构成微生物细胞以C、H、O、N、P、S六 种元素为主,约占细胞干重的95%以上; Ca、K 、Mg、Fe为大量元素,以无机盐阳 离子形式被吸收,配培养基要加磷酸盐、硫 酸盐。 Zn、Ca、Mn、Co、Mo等微量元素,在微 生物培养中有0.1PPM就可以了,自来水原 料中已够用,不需另加。
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碳源、氮源、生长因子的比较
来 源 常用原料 功 能 构成细胞物质 和一些代谢产 物,有些还是 异养做生物的 主要能源物质

CO2、NaHCO3、糖 碳源 类、脂肪酸、花生粉 糖类 饼、石油等

N2、NH3、铵盐、硝 合成蛋白质、 铵盐、硝酸 氮源 酸盐、尿素、牛肉膏 核酸以及含氮 盐等 和蛋白胨等 的代谢产物 生长 维生素、氨基酸、碱 因子 基 酶、核酸等的 组成成分

? 各种培养基的具体配方不同,但一般都包 括哪些成分? ? 答:不管哪种培养基,一般都含有水、碳 源、和氮源、 无机盐等营养物质。
?

注: 另外还需要满足微生物生长对pH、特殊 营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需,而自 身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌 呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。

二 无菌技术:无菌操作泛指在培养微生物的
操作中,所有防止杂菌污染的方法。

(1)常用消毒的方法:
1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min 2、巴氏消毒法:70-75 ℃下煮30min 或 80 ℃ 下煮15min 3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁 尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源 4、紫外线消毒 ……

(2)常用灭菌的方法:
1、灼烧灭菌: 2、干热灭菌: 160-170 ℃下加 热1-2h。 3、高压蒸气灭菌: 100kPa、121 ℃ 下维持15-30min.

无菌技术:
分类 灭菌法 高效消 毒法 中效消 毒法 低效消 毒法 定义 方法 物理法:热力、辐射、微 杀灭一切微生物 波、等离子体 化学法:醛类、烷化剂 杀灭一切致病微 紫外线、含氯剂、臭氧、 生物 复配剂等 杀灭除芽孢外的 超声波、碘类、醇类、酚 致病微生物 类 杀灭细菌繁殖体、 单链季胺盐、双胍类、中 亲脂病毒 草药、金属离子

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1. 无菌技术包括: (1)对实验操作空间、操作者的衣着和手进行 清洁和消毒 ; (2)将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行 灭菌 ; (3)为避免周围微生物污染,实验操作应在 酒精灯火焰附近 旁进行; (4)避免已灭菌处理的材料用具与 周围物品 相接触。 2. 消毒方法: (1)日常生活经常用到的是 煮沸 消毒法; (2)对一些不耐高温的液体,则使用 巴氏 消毒法(作简要介绍); (3)对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒 石炭酸或煤酚皂 等溶 液以增强消毒效果,然后使用 紫外线 进行物理消毒。 (4)实验操作者的双手使用 酒精 进行消毒; (5)饮水水源用 氯气 进行消毒。 3.灭菌方法: (1)接种环、接种针、试管口等使用 灼烧 灭菌法; (2)玻璃器皿、金属用具等使用 干热 灭菌法,所用器械是 干热灭 菌箱 ; (3)培养基、无菌水等使用 高压蒸汽 灭菌法,所用器械是 高压蒸 汽灭菌锅 。 (4)表面灭菌和空气灭菌等使用 紫外线 灭菌法,所用器械是 紫外 灯。

常 识

1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物 被其他外来微生物污染外,还有什么目的? 答:无菌技术还能有效避免操作者自 身被微生物感染。
2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭 菌。如果需要,请选择合适的方法。 (1) 培养细菌用的培养基与培养皿 (2) 玻棒、试管、烧瓶和吸管 (3) 实验操作者的双手 答:(1)、(2)需要灭菌;(3)需要消毒。

3.微生物实验室培养的基本操作程序 1、器具的灭菌 2、培养基的配制 3、培养基的灭菌 4、倒平板 5、微生物接种 6、恒温箱中培养 7、菌种的保存

三、实验操作 1.制备牛肉膏蛋白胨培养基(用于培养细菌)

操作步骤:

1).配制:计算、称量、熔化 2).调节pH: 用3%的HCI/NaOH调节 pH 7.0--- 7.2 3).分装:分装过程中注意不要使培养基沾 在管口或瓶口上,以免沾污棉塞而引起污染 。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积 的一半为宜。 4).包扎:

5).灭菌: 将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中, 塞上棉花塞,包上牛皮纸,再放入高压蒸气灭菌 锅,在压力为100kPa、温度为121℃,灭菌 15~30min。 将培养皿用旧报纸包裹,放入干热灭菌箱内, 在160~170 ℃下灭菌2h。 6).倒平板: 待培养基冷却到50 ℃左右时,在酒精灯附 近倒平板。2d后观察平板,无杂菌污染才可用 来接种. 7).无菌检查: 将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24— 48小时,以检查灭菌是否彻底。

倒平板:

菌种的保存

1)、临时保藏: 接种到固体斜面培 养基,菌落长成后 臵于4℃冰箱保存。 2)、长期保存: 甘油冷冻管藏法

注意:
1).培养基灭菌后,需要冷却到50 ℃左右时, 才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的 温度?

答:可以用手触摸盛有培养基的锥形 瓶,感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手 时,就可以进行倒平板了。
2).为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰?

答:通过灼烧灭菌,防止瓶口的微生物 污染培养基。

3).平板冷凝后,为什么要将平板倒臵?
答:平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,凝固 后的培养基表面的湿度也比较高,将平板倒臵, 既可以使培养基表面的水分更好地挥发,又可以 防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染。 4).在倒平板的过程中,如果不小心将培养基 溅在皿盖与皿底之间的部位,这个平板还能用 来培养微生物吗?为什么? 答:空气中的微生物可能在皿盖与皿底之 间的培养基上滋生,因此最好不要用这个平板 培养微生物。

2、纯化大肠杆菌:
微生物的接种技术 接种方法有: 平板划线法和稀释涂布平板法 平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养 基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀 释分散到培养基的表面. 在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁 殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.

菌落:
? 单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖 时,就会形成一个肉眼可见的,具有一定 形态结构的子细胞群体,叫做菌落。 ? 菌落是鉴定菌种的重要依据。

菌落
细菌的菌落特征 因种而异

菌落
霉菌的菌落 特征 因种而异

划线后

培养一段时间后

微生物的恒温培养

微生物的恒温培养

1).为什么在操作的第一步以及每次划线之 前都要灼烧接种环?在划线操作结束时,仍然 需要灼烧接种环吗?为什么? 答:操作的第一步灼烧接种环是为了避免接 种环上可能存在的微生物污染培养物;每次划线 前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后,接种 环上残留的菌种,使下一次划线时,接种环上的 菌种直接来源于上次划线的末端,从而通过划线 次数的增加,使每次划线时菌种的数目逐渐减少, 以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环,能及时 杀死接种环上残留的菌种,避免细菌污染环境和 感染操作者。

2).在灼烧接种环之后,为什么要等其 冷却后再进行划线? 答:以免接种环温度太高,杀死菌种。 3).在作第二次以及其后的划线操作时, 为什么总是从上一次划线的末端开始划线?
答:划线后,线条末端细菌的数目比线 条起始处要少,每次从上一次划线的末端开 始,能使细菌的数目随着划线次数的增加而 逐步减少,最终能得到由单个细菌繁殖而来 的菌落。

四、课题成果评价
(一)培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温1~2 d后无 菌落生长,说明培养基的制备是成功的,否则需要重新 制备。 (二)接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基 本一致,并符合大肠杆菌菌落的特点,则说明接种操作 是符合要求的;如果培养基上出现了其他菌落,则说明 接种过程中,无菌操作还未达到要求,需要分析原因, 再次练习。 (三)是否进行了及时细致的观察与记录 培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明 显不同,及时观察记录的同学会发现这一点,并能观察 到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生 良好的科学态度与习惯。

本课题知识小结:

【典例解析】
例1.关微生物营养物质的叙述中,正确的是: 答案:D A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量 解析:不同的微生物,所需营养物质有较大差别,要 针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项,它的表达是 不完整的。有的碳源只能是碳源,如二氧化碳;有的碳源可 同时是氮源,如NH4HCO3;有的碳源同时是能源,如葡萄 糖;有的碳源同时是氮源,也是能源,如蛋白胨。对于C选 项,除水以外的无机物种类繁多,功能也多样。如二氧化碳, 可作为自养型微生物的碳源;NaHCO3,可作为自养型微生 物的碳源和无机盐;而NaCl则只能提供无机盐。对于D选 项,无机氮源提供能量的情况还是存在的,如NH3可为硝化 细菌提供能量和氮源。

例2.下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是: A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌 答案:B C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前
解析:灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A 说的是灭菌的目的,因为发酵所用的菌种大多是单一 的纯种,整个发酵过程不能混入其他微生物(杂菌), 所以是正确的;B是错误的,因为灭菌的目的是防止杂 菌污染,但实际操作中不可能只消灭杂菌,而是消灭 全部微生物。C是正确的,因为与发酵有关的所有设备 和物质都要灭菌;发酵所用的微生物是灭菌后专门接 种的,灭菌必须在接种前,如果接种后再灭菌就会把 所接菌种也杀死。

例3.右表是某微生物 编号 培养基成分,请据此回答: (1)右表培养基可培 ① 养的微生物类型是 (2)若不慎将过量 NaCl加入培养基中。 如不想浪费此培养基, 可再加入 含碳有机物 . 用于培养 金黄色葡萄 球菌.
自养型微生物

成分 粉状硫
(NH4) 2SO4

含量 10g 0.4g 4.0g
9.25g 0.5g 0.5g 100ml

② ③
④ ⑤ ⑥ ⑦

K2HPO4
MgSO4 FeSO4 CaCl2 H 2O

(3)若除去成分②,加入(CH2O), 该培养基可用于培 固氮微生物 养 。 (4)表中营养成分共有 3 类。 (5)不论何种培养基,在各种成分都 溶化后分装前,要进行的 是 。 调整pH (6)右表中各成分重量确定的原则 是 。 (7)若右表培养基用于菌种鉴定,应 依微生物的生长需要确定 该增加的成分是 。

琼脂(或凝固剂)

? 解析: 对于一个培养基,它能培养何种微生物, 要看它的化学成分。当然这只适用于合成培养基, 如果是一个天然培养基就不能从培养基的成分上 区分它是培养何种微生物的。分析化学成分要从 营养物质的类型出发。右表中的营养物质有水、 无机盐、氮源三类,缺乏碳源和特殊营养物质。 对特殊营养物质,有的微生物是不需要的,但没 有微生物是不需要碳源的。该培养基中没有碳源, 说明培养的微生物是从空气中获得碳源的,即可 培养的微生物就是自养型微生物了。该培养基中 加入了过量食盐,就可以成为金黄色葡萄球菌鉴 别培养基,但金黄色葡萄球菌是异养型微生物, 这个培养基就还需要加入有机碳源。该培养基若 加入(CH2O),培养基中就有了碳源,但除去 成分②,却使培养基中没有了氮源,这时就只能 用于培养固氮微生物了。对于菌种鉴定,往往用 的是固体培养基,而表中没有凝固剂,需要加入 常见的凝固剂——琼脂。


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