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【学案】 课题1 DNA的粗提取与鉴定学案


专题 5

DNA 和蛋白质技术
编写:李成明

课题 1 DNA 的粗提取与鉴定学案
一、课题目标
1、通过尝试对植物或动物组织中的 DNA 进行粗提取,了解 DNA 的物理化学性质。 2、理解 DNA 粗提取与鉴定的原理

二、课题重点与难点
课题重点: DNA 的粗提取和鉴定

方法 课题难点: DNA 的粗提取和鉴定方法 注:考纲要求:DNA 的粗提取和鉴定方法 考点:①DNA 的粗提取和鉴定方法

【基础知识】
(一)提取 DNA 的方法 提取生物大分子的基本思路是 。对于 DNA 的粗提取而言,就是要利用 、 等在物理和化学性质方面的 差异,提取 DNA,去除其他成分。 1、DNA 的溶解性 DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度的 中溶解度不同, 利用这一特点,选择适当的盐浓度就能使 充分溶解,而使杂质沉淀,或者相反, 以达到分离目的。 课本图 5—1 是 DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度曲线,请根据曲线图,思考: 【思考 1】在 浓度下,DNA 的溶解度最小?DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度变化 是 。 【思考 2】如何通过控制 NaCl 溶液的浓度使 DNA 在盐溶液中溶解或析出? 此外,DNA 不溶于 溶液,但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原 理,可以将 DNA 与蛋白质进一步的分离。 2、DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶能水解 ,但是对 没有 o 影响。大多数蛋白质不能忍受 60—80 C 的高温,而 DNA 在 以上才会变性。洗涤 剂能够瓦解 ,但对 DNA 没有影响。 3、DNA 的鉴定 在 条件下,DNA 遇 会被染成 色,因此 二苯胺可以作为鉴定 DNA 的试剂。

【实验设计】
(一)实验材料的选取 凡是含有 的生物材料都可以考虑,但是使用 的 生物组织,成功的可能性更大。在下面的生物材料中选取适合的实验材料: 鱼卵、猪肝、菜花(花椰菜) 、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、 菠菜、在液体培养基的大肠杆菌 【思考 3】哺乳动物的红细胞的特点? (二)破碎细胞,获取含 DNA 的滤液 动物细胞的破碎比较容易,以鸡血细胞为例,在鸡 血细胞液中加入一定量的 ,同时用 搅拌,过滤后收集滤液即可。 如果实验材料是植物细胞,需要先用 溶解细胞膜。例如,提取洋葱的 DNA 时,在切碎的洋葱中加入一定的 和 ,进行充分的搅拌和研磨,过滤后收集 研磨液。 【思考 4】①为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂?

【思考 5】加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么? 【思考 6】如果研磨不充分,会对实验结果产生怎样的影响? 【思考 7】此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分? (三)去除滤液中的杂质 阅读课本的三个方案,思考: 【思考 8】为什么反复地溶解与析出 DNA,能够去除杂质?

【思考 9】方案二与方案三的原理有什么不同? (四) DNA 的析出与鉴定 将处理后的溶液过滤, 加入与滤液体积 、 冷却的 , 静置 , 溶液中会出现 , 这就是粗提取的 DNA。 用玻璃棒 搅 拌,卷起丝状物,并用滤纸吸取上面的水分。 取两支 20ml 的试管, 各加入物质的量浓度为 的 NaCl 溶液 5ml, 将丝状物放 入其中一支试管中,用玻璃棒搅拌,使丝状物溶解。然后,向两支试管中各加入 4ml 的 。混合均匀后,将试管置于 中加热 5min,待试管冷却后,比较 两支试管溶液颜色的变化,看看溶解有 DNA 的溶液是否变 。 【思考 10】DNA 的鉴定是否需要对照实验?

【操作提示】
1、以血液为实验材料时,每 100ml 血液中需要加入 3g ,防止 。 2、加入洗涤剂后,动作要 、 ,否则容易产生大量的泡沫,不利于后续 步骤地操作。 加入酒精和用玻璃棒搅拌时, 动作要 , 以免 , 导致 DNA 分子不能形成絮状沉淀。 3、二苯胺试剂要 ,否则会影响鉴定的效果。

【结果分析与评价】 【疑难点拨】
1. DNA 的溶解度与 NaCl 溶液浓度的关系: 当 NaCl 溶液浓度低于 0.14mol/L 时,随浓度的升高,DNA 的溶解度降低;当 NaCl 溶 液浓度高于 0.14mol/L 时,随浓度升高,DNA 的溶解度升高。 2. 制备鸡血细胞液时,要在新鲜的鸡血中加入柠檬酸钠的原因 制备鸡血细胞液时,要在新鲜的鸡血中加入抗凝剂——柠檬酸钠,防止血液凝固。 其原理是柠檬酸钠能与血浆中 Ca2+发生反应,生成柠檬酸钙络合物,血浆中游离的 Ca2+大 大减少,血液便不会凝固,因为鸡血红细胞,白细胞都有细胞核,DNA 主要存在于细胞核 中,所以在离心或静置沉淀后,要弃出上层清液——血浆。 3.提取 DNA 的第一步是材料的选取,其目的是一定要选取 DNA 含量较高的生物材料,否 则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难;第二步是 DNA 的释放和溶解,这 一步是实验成功与否的关键, 要尽可能使细胞内的 DNA 全部溶解; 第三步是 DNA 的纯化, 即根据 DNA 的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性,最大限度地将 DNA 与杂质 分开;最后一步是对 DNA 进行鉴定,这是对整个实验的结果的检测。 4.盛放鸡血细胞液的容器,最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的 DNA,容易被 玻璃容器吸附,由于细胞内 DNA 的含量本来就比较少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取

到的 DNA 就会更少。因此,实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管,这样可以减少提取过 程的 DNA 的损失。 【总结】 DNA 的粗提取与鉴定 一、植物 DNA 的粗提取 1.取材 称取 30g 的菜花,去梗、切碎。 2.研磨 将切碎的菜花放入研钵中,加入洗涤剂和食盐,充分研磨搅拌。 加洗涤剂的作用:洗涤剂能瓦解细胞膜,有利于 DNA 的释放。 食盐的作用:高浓度的食盐能溶解 DNA。 充分研磨的作用:使细胞核中 DNA 充分释放出来。 3.过滤 在漏斗中放上 ,进行过滤。 4.去除滤液中的杂质 第二次过滤 在滤液中加入 2mol/L 的 NaCl, 。 第三次过滤 沿烧杯壁加蒸馏水使 NaCl 的浓度为 0.14mol/L 时,析出 DNA,用纱布 过滤。 。 第 四 次 过 滤 将 纱 布 中 的 DNA 溶 于 2mol/L 的 NaCl , 用 二 层 纱 布 过 滤 , 去 除 。 5. 沉淀 在一倍体积的上清液中倒入体积相等的冷却的酒精, 溶液中析出白色丝状物。 冷酒精的作用:1。抑制核酸水解酶的活性,防止 DNA 水解。 2.降低分子运动,使 DNA 易于析出。 3.低温有利于增加 DNA 的柔韧性,减少断裂。 6.鉴定 取两支试管,各加入 2mol/L 的 NaCl 溶液 5ml,将丝状物溶于其中一支试管 中,然后向两支试管中各加入 4ml 的 ,混合均匀,沸水浴加热,待冷却后, 比较两支试管的颜色变化。 二、动物 DNA 的提取 1.取材 取鸡血加入抗凝剂。 (抗凝剂为柠檬酸钠) 2.破碎细胞获得 DNA 在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水,搅拌、过滤。 蒸馏水的作用:使血细胞吸水涨破,释放出 DNA 3.过滤 用 3-4 层纱布过滤,除去 4.去除滤液中的杂质 。

【典例解析】
例1、 本实验中有三次过滤: ⑴过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液 ⑵过滤含粘稠物的 0.14mol/LNaCl 溶液 ⑶过滤溶解有 DNA 的 2mol/LNaCl 溶液 以上三次过滤分别为了获得( ) A、含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含 DNA 的滤液 B、含核物质的滤液、滤液中 DNA 粘稠物、含 DNA 的滤液 C、含核物质的滤液、滤液中 DNA 粘稠物、纱布上的 DNA D、含较纯的 DNA 滤液、纱布上的粘稠物、含 DNA 的滤液 例 2、填写本实验完成下列实验操作时所用试剂。

⑴提取鸡血细胞中核物质 ⑵溶解核内 DNA: ⑶析出 2mol/LNaCl 溶液中的 DNA ⑷DNA 粘稠物的再溶解 ⑸提取杂质较少的 DNA 白色乳状丝状物 ⑹DNA 的鉴定 例 3、关于 DNA 粗提取的实验材料的选择,也经过了多次实验效果的比较,最终选择鸡 血做实验材料的原因是什么?请回答下列问题: ⑴鸡血细胞中红细胞 ,家鸡属于鸟类,新陈代谢旺盛,因而血液中 细 胞树木较多,可以提供丰富的 。 ⑵实验前由老师制备血细胞液供同学们做实验材料,而不用鸡全血,主要原因是 。 ⑶生活在牧区的人们, 采集牛、 羊和马血比较方便, 若他们按实验要求完成实验步骤后, 结果是 , 这是因为这些动物和人一样, 成熟的红细胞中 , 但若改用动物肝脏做实验材料, 实验能顺利进行。 这是因为 。 ⑷若选用动物肝脏做实验材料,在提取之前,最好增加 程序,使组织细胞 更易分离。 强化自测: 1.在研究 DNA 的基因样本前,采集来的血样需要蛋白水解酶处理,然后用有机溶剂除去 蛋白质。用蛋白水解酶处理血样的目的是( ) A.除去血浆中的蛋白质 B.除去染色体上的蛋白质 C.除去血细胞表面的蛋白质 D.除去血细胞中的所有的蛋白质,使 DNA 释放,便于进一步提纯 2.与析出 DNA 粘稠物有关的叙述,不正确的是( ) A.操作时缓缓滴加蒸馏水,降低 DNA 的溶解度 B.在操作 A 时,用玻璃棒轻缓搅拌,以保证 DNA 分子完整 C.加蒸馏水可同时降低 DNA 和蛋白质的溶解度,两者均可析出 D.当丝状粘稠物不再增加时,此时 NaCl 的浓度相当于 0.14mol/L 3.洗涤剂能够瓦解( ) ,但对 DNA 没有影响。 A.细胞壁 B.细胞膜 C.细胞核 D.细胞质 4.在沸水浴的条件下,DNA 遇( )会被染成蓝色。 A.斐林试剂 B.苏丹Ⅲ 染液 C.双缩脲试剂 D.二苯胺 5.在 DNA 提取过程中,最好使用塑料试管和烧杯,目的是( ) A.不易破碎 B.减少提取过程中 DNA 的损失 C.增加 DNA 的含量 D.容易洗刷 6.下列操作中,对 DNA 的提取量影响最小的是( ) A.使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂,放出 DNA 等核物质 B.搅拌时,要使用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌 C.在“析出 DNA 粘稠物”时,要缓缓加蒸馏水,直至溶液中粘稠物不再增加 D.在用酒精沉淀 DNA 时,要使用冷酒精,甚至再将混合液放入冰箱中冷却 E 在 DNA 的溶解和再溶解时,要充分搅拌 7.DNA 的粗提取中,将与滤液体积相等的、冷却的( ) ,静置 2—3min,溶液中会 出现白色丝状物。 A.0.9%的 NaCl B.0.14mol/L 的 NaCl 溶液 C.质量分数 15%的 HCl D.体积分数为 95%的酒精溶液 8.以血液为实验材料时,需要向血液中加入( ) ,防止血液凝固。

A.醋酸钠 B.龙胆紫 C.柠檬酸钠 D.醋酸洋红 9.在向溶解 DNA 的 NaCl 溶液中,不断加入蒸馏水的目的是( ) A.加快溶解 DNA 的速度 B.加快溶解杂质的速度 C.减少 DNA 的溶解度,加快 DNA 析出 D.减小杂质的溶解度,加快杂质的析出 10.去除滤液中的杂质时,直接在滤液中加入嫩肉粉,利用嫩肉粉中的( )分解蛋白质。 A.胃蛋白酶 B.胰蛋白酶 C.木瓜蛋白酶 D.肠肽酶 11、提取鸡血中 DNA 时,要除去血液中的上清液,这是因为什么?


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