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兽医生物制品学(收购版)


十年树木,百年树人,教育是根本

兽医生物制品学
扬州大学兽医学院 成大荣

课 程 内 容

第一章 第二章 第三章 第四章 第五章 第六章 第七章 第八章 第九章 第十章 第十一章 第十二章 第十三章

生物制品概述 菌种与毒种选育技术 细菌培养技术 病毒培养技术 实验动物 动物生物制品生产主要设备 灭活与灭活剂 佐剂 冷冻真空干燥技术 免疫血清制备技术 诊断用生物制品 动物生物制品的质量监控 畜禽防疫

第一章 兽医生物制品概述

生物制品技术
? 是一种既古老而又充满时代信息的技术, 并与生命健康息息相关。

一、兽医生物制品的概念
根据免疫学原理,以微生物、寄生虫及其代 谢产物或免疫应答产物,以及动物组织等生物 材料为原料,通过生物学、生物化学或生物工 程学等方法加工制备的一类生物制剂。

(biological)

二、兽医生物制品的分类
主要介绍3种分类方法!

1、按所用的材料、用途不同分类:
能够刺激机体免疫系统主动产生 主动免疫制品 —— 疫苗,以抗原为基础 相应的免疫力 既能用于短期内的特异性预防, 被动免疫制品 —— 免疫血清,以抗体为基础 又能用于的特异性治疗

诊断液

诊断疾病 —— 用于 检测机体免疫状态 鉴别病原微生物

血液制品(白蛋白、丙种球蛋白) 其他生物制品 —— 非特异性免疫制品(干扰素、胸腺肽) 微生态制品(促菌生)

2、按制备方法分类
普通制品 —— 利用一般生产方法制备的,
未经浓缩、纯化处理 并进行适当浓缩

精 制 品 —— 将原材料用物理或化学方法去除无效成分, 单价制剂 —— 只利用一种微生物的单一血清型 多价制剂 —— 利用一种微生物的若干血清型 混合制剂 —— 利用不同的微生物,
按免疫学原理和方法组合而成

3、按物理性状分类
液状制品 —— 含有水分的液状生物制品 冻干制品 —— 利用真空冷冻干燥技术去除水分 佐剂制品 —— 加入佐剂后制成的生物制剂 一般制品 —— 不加入佐剂的一般生物制剂

三、疫苗
Vaccine
由病原微生物、寄生虫及其组分或代谢产物制成, 接种动物后能产生主动免疫,从而预防疾病的一类 生物制剂。

随着生物化学、分子生物学及生物工程技术的发 展,新的疫苗、苗型不断研制成功,种类繁多。

传统疫苗 疫苗 新型疫苗

1、传统疫苗
利用微生物或寄生虫或代谢产物等完整个体制成的疫苗

主要介绍

? ? ? ?

灭活苗 弱毒苗 类毒素 亚单位疫苗

(1)灭活苗
将含有病原微生物的材料,利用化学或物理 方法处理,使其丧失感染性而保有免疫原性, 接种动物后能产生主动免疫并预防疾病的一类 生物制品。

又称死疫苗或死苗

组织灭活疫苗——又称为脏器灭活苗 可分为:
例如: 猪瘟结晶紫疫苗 兔出血症组织灭活疫苗

培养物灭活疫苗
例如: 猪丹毒氢氧化铝疫苗 羊梭菌多联菌苗

(2)弱毒疫苗
将微生物的自然强毒株通过化学、物理或生 物学方法,使其对原宿主动物致病力丧失或只 引起亚临床感染,但仍保存良好抗原性;以此 人工致弱的毒株制备的疫苗。

又称活疫苗或活苗

例如:

? ? ? ? ? ?

猪瘟兔化弱毒疫苗 牛肺疫兔化弱毒菌苗 猪丹毒弱毒菌苗 鸡痘鹌鹑化活疫苗 传染性法氏囊活疫苗 禽脑脊髓炎活疫苗



此外
从自然界筛选的自然弱毒株,也可以制备 弱毒疫苗。
如: 鸡新城疫Lasota疫苗等

关于灭活苗和弱毒苗的优缺点
活苗 1 一次免疫即可成功 2 抗原用量少,接种后能增殖 3 多种免疫途径 5 6 7 8 9 10 11 12 免疫作用快,免疫期长,效果巩固 一般不需佐剂 对母源抗体的中和作用敏感 有排出疫苗毒的可能,存在污染的危险 可能存在其他传染因子 疫苗合用(联苗)较困难 运输、保存要求条件较高 通常制成冻干苗以利保存 灭活苗 需要二次免疫或多次免疫 抗原用量多,接种后不增殖 只能注射 免疫作用慢,免疫期较短 佐剂能增强免疫力 对母源抗体的中和作用不敏感 不排毒,无污染危险 灭活过程中可将传染因子破坏 容易制成联苗或多价苗 运输、保存方便 均为湿苗

4 可激发全身系统免疫以及局部黏膜免疫 主要激发体液免疫

(3)类毒素
外毒素经化学药品(如甲醛)处理后,成为 无毒性而保留免疫原性的生物制剂。
化学处理 类毒素

外毒素

又称 脱毒毒素
毒性基团
抗原决定簇

(4)亚单位疫苗
? 是指提取微生物有效抗原部分,利用一种或 几种亚单位结构成分制成的疫苗。

例如:
– – 细菌的荚膜、鞭毛等, 病毒的囊膜、纤突、衣壳蛋白等.

去除了全微生物的某些毒副作用, 免疫效果好!
例如:
– 脑膜炎球菌多糖疫苗、肺炎球菌荚膜多价多糖疫苗 – 口蹄疫VP3疫苗和流感血凝素疫苗等

然而,其工厂化生产比较困难,成本高!

2、新型疫苗
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ 基因工程亚单位疫苗 基因工程活疫苗 核酸疫苗 合成肽疫苗 转基因植物可食疫苗 抗独特型疫苗 树突状细胞疫苗 T细胞疫苗

主要介绍

(1)基因工程亚单位疫苗
某个抗原基因 或 某几个抗原基因 基因重组技术 转入

病原体的

适当的细菌、酵母菌或哺乳动物细胞

目的基因表达

以获得的表达产物作为免疫原制成的疫苗, 称为基因工程亚单位疫苗。

例如: ? 大肠杆菌菌毛基因工程亚单位疫苗 ? 口蹄疫基因工程亚单位疫苗 ? 乙型肝炎基因工程亚单位疫苗

(2)基因工程活疫苗
基因工程技术

病原微生物

删除其致病基因或部分片段

获得毒力丧失或降低的毒株
减毒彻底、不易力返祖、安全 遗传性能更稳定

以此减毒的菌株或毒株制成的疫苗, 称为基因工程活疫苗。 例如: 去除毒力基因的腺病毒。

减毒的细菌和病毒也可作为载体

可将外源抗原基因插到细菌或病毒载体的 基因组中,就可以制成基因工程活载体疫苗.

(3)核酸疫苗
是将一种或多种抗原编码基因克隆到真核 表达质粒载体上,将构建的重组质粒直接注 入到体内而激活机体免疫系统。

(4)合成肽疫苗
? 合成肽疫苗是一种仅含抗原决定簇的小肽; ? 即用人工方法按天然蛋白的氨基酸顺序合成 保护性短肽,然后与载体蛋白连接后加佐剂 所制成的疫苗。

(5)转基因植物可食疫苗
? 利用分子生物学技术,将病原微生物的抗原 基因导入植物,并在植物中表达出活性蛋白;

? 人或动物食用含有该种抗原的转基因植物, 激发肠道免疫系统,从而产生针对相应病原 微生物的免疫能力。

(6)抗独特型疫苗
? 抗独特型抗体是针对Ab V区独特型决定簇 的抗抗体。

Ab2β为抗原的决定簇分子的“内影像”, 可模拟抗原并作为一种新型疫苗

(7)树突状细胞疫苗

DC是机体内最主要、最有效的抗原提呈细胞

肿瘤患者通常由于DC功能缺陷, 不能引发有效的抗肿瘤免疫应答,

是肿瘤免疫逃逸重要原因

DC在体外诱导扩增之后,通过基因工程技术 将肿瘤抗原基因、细胞因子基因导入或修饰 DC,就可以制成树突状细胞肿瘤疫苗

为探索新的疾病防治手段

开辟了新天地

(8)T细胞疫苗
是指用化学或物理方法灭活已活化的致病性 T细胞,使其丧失致病力,但保持其免疫特征, 从而制备成的疫苗。

对TCV的研究目前主要集中在

? 自身免疫性疾病
这两方面

? 同种移植排斥反应

四、兽医生物制品的用途
1、疾病预防 —— 疫苗接种→主动免疫
注射血清→被动免疫

—— 利用已知抗体检测未知病原 2、疾病诊断 利用已知抗原检测机体免疫水平 3、疾病治疗 —— 抗体→特异性增强机体免疫力

体液因子→非特异性增强机体免疫力

第二章 菌/毒种选育技术

1

菌种和毒种
是生物制品生产、检验与研究的基础

? 自然界存在多种多样的微生物; ? 而且还在不断地产生新的株和型。
2

由于生物制品用途的不同, 所选择的菌/毒种也各异
? 有的需要致病力强; ? 有的则要求致病力弱或仅有感染性 而无病害性
3

共同的要求

免疫原性高
4

一、菌/毒种的分类
按照其在生物制品生产、检定中的用途不同

分为四类
5

1、生产用菌/毒种
① 直接生产用菌/毒种
包括

② 免疫用菌/毒种 ③ 加工用菌/毒种

6

2、工具菌/毒种
只作为工具用的菌/毒种
例如: 生产痢疾杆菌噬菌体用的痢疾杆菌。

7

3、检定用菌/毒种
用于生物制品某些项目的测定

8

4、标准菌株或参考菌株
在研究或特殊问题鉴定方面必要、 必须的参考菌种和毒种 并不直接用于生产
9

二、菌/毒种的标准
菌/毒种是生物制品质量的关键
制备的疫苗必须安全、有效,诊断试剂 必须敏感和特异,因此所用的菌/毒种,除 毒力标准不同外,均需符合一定标准
10

1、历史清楚
? 流行地区、动物种、流行资料清楚; ? 分离鉴定资料完整; ? 传代、保藏、生物学特性检查方法明确。

11

2、生物学性状明显
? 菌种的形态、培养和生化、免疫学特性明 显,易于鉴别; ? 毒种的形态、增殖培养病变、免疫学特性 明显; ? 菌/毒种人工感染动物后的临床表现、病理 变化具有特征性。
12

3、遗传学上相对纯一与稳定
菌/毒种相对地讲是一个群体
但在传代过程中受各种因素的影响,会发生 遗传性状的变异,因此要求菌/毒种应有较好 的纯一性和稳定性。

13

提高或保持菌/毒种纯一性和稳定性的方法

经常进行挑选、纯化
例如:
? 羊痘鸡胚化毒种在经过羊体传代2~4代复壮、 纯化后方能用于制苗。

14

4、抗原性优良

是生物制品中菌/毒种的 重要指标。

15

优良的抗原性, 能使免疫动物获得坚强的免疫力
? 通常可通过浓缩、提纯或导入佐剂等方法 提高菌/毒种的免疫效果。

16

5、毒力应在规定范围以内
? 用于弱毒疫苗的毒种毒力,要尽可能弱些; ? 强毒株即使在灭活后,也可能含有毒物质, 对动物存在安全隐患,所以必需对致病力 要进行测定。

17

三、强菌/毒种的选育
强菌/毒种广泛用于
? 生物制品的生产和检验; ? 微生物与免疫学、动物传染病等研究。

18

毒力强大、抗原性好的自然强菌/毒种常分离自

疾病流行地区的典型病例
例如我国的:

? 石门系猪温病毒 ? 多杀性巴氏杆菌C44-1
19

强菌/毒种的

筛选程序与内容

20

1、致病力测定
常用易感实验动物、本种动物、鸡胚、易感细胞测定

? MLD ? LD50 ? EID50

(最小致死量) (半数致死量) (鸡胚半数感染量)

? ELD50 (鸡胚半数致死量) ? TCID50 (细胞半数感染量)
21

2、抗原性测定
(1)反应原性,多采用血清学方法测定, 以抗体滴度、效价表示; (2)免疫原性,多采用对免疫动物用定量 原强菌/毒株攻击测定,以保护率表示。

22

无论致病力测定,还是抗原性测定

均应设对照,否则无效

23

3、稳定性测定
对适应于在培养基、鸡胚或易感细胞增殖 培养、传代的菌/毒株,还要进行稳定性测定, 以证明其后代特性不变,才有使用价值。

24

筛选的毒力强、抗原性好、性状稳定的菌/毒株

经增殖后,须进行

冻干保存
25

冻干菌种和毒种通常保存于

-70~ -20℃
26

冻干菌/毒种一经传代

即应重新分离、鉴定和检测后 方能供种毒用。

27

四、弱菌/毒种的选育
弱菌/毒种主要用于 弱毒活疫苗、部分诊断制品和抗血清的制造

28

弱菌/毒种的重要特征是

? 致病力极微弱或无致病力 ? 免疫原性优良

29

弱菌/毒种的来源

? 自然弱毒株 ? 人工诱发突变弱毒株

30

无论自然弱毒株还是人工培育弱毒株

都是由于DNA突变的结果

31

1、自然弱毒株的选育
? 又称自发突变毒株 ? 是由于自然强毒株在长期的自然因素作用 下引起遗传基因突变,从而形成了与祖代 性状不尽相同的生物株。

32

例如
① 巴斯德从巴氏杆菌的陈旧培养物中分离到 禽霍乱弱毒菌株 ② 鸡新城疫Lasota弱毒株

分离、筛选后作为兽医生物制品的菌/毒种
33

自发突变率很低
因此获得自然弱毒株的

机率不高!
34

2、人工诱发突变弱毒株的选育
化学药品 物理因素 异种非易感动物

人工诱发突变

35

(1)通过化学途径选育
利用某些化学药品引起病原微生物DNA 碱基发生改变,从而表现遗传性状变化

36

例如
亚硝基胍是一种烷化剂

具有强大的诱变作用, 微量即引起突变,可极大提高突变率

诱变率达1%

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(2)通过物理途径选育
利用某些物理因素(X射线、紫外线、温度) 引起微生物突变,从而获得遗传性状不同于祖代 的弱毒株。

38

射线、紫外线、热、干燥
可干扰DNA的复制, 从而引起突变,导致遗传性状的改变

39

例如
巴斯德 ? 1881年将炭疽强毒菌在42.5℃高温下长期 传代培养,导致遗传性状变异,从而育成 了弱毒菌株; ? 1885年又将含有狂犬病病毒的脑脊髓置于 干燥条件中处理,制成弱毒疫苗。
40

日本乙型脑炎病毒强毒株经紫外线照射后 引起突变,从而出现遗传性状分离,育成了 弱毒株。

41

(3)通过生物途径选育
通过接种非易感的异种动物或细胞或禽胚, 使微生物经传代发生突变,从而育成弱毒株。

42

通过生物途径育成的弱毒株, 其生物稳定性极佳,但育成过程比较长。

我国在这方面处于领先地位

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常用的育成线路
① 适应非自然宿主 ② 适应细胞 ③ 杂交减毒

44

① 适应非自然宿主
? 通常用实验动物或禽胚进行 来源广泛 饲养管理方便 成本低廉 易于连续传代 操作便利
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? 其优点是

例如
? 狂犬病强毒通过兔体传代后育成的弱毒株; ? 猪瘟强毒通过兔体400余代后育成兔化弱毒株; ? 口蹄疫强毒通过乳鼠和鸡胚传代育成弱毒株; ? 鸭瘟强毒株通过鸭胚和鸡胚传代后育成弱毒株。

46

② 适应细胞
通常多采用同源或异源的原代细胞

? 或一种细胞 ? 或二种细胞
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例如
? 猪瘟强毒通过猪睾丸细胞142代,牛睾丸细 胞36代,再在豚鼠肾细胞传至41代后育成 弱毒株(日本)。 ? 将马传贫强毒株通过驴白细胞传代育成驴 白细胞弱毒株(中国)。
48

③ 杂交减毒
将两种遗传性状不同的毒株,在传代 培育中进行杂交,从而育成有使用价值 的弱毒株。

49

例如
将流感病毒温度敏感株(抗原性低)与流 行株(毒力强)在混合培养传代中进行杂交, 育成了毒力低抗原性强的弱毒株。

50

3、变异毒株的初选依据
? 微生物变异的方向难以预测 ? 变异株的筛选只能在培育过程中,通过从 外表观察、检测开始,然后再作系统鉴定。

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变异株初选依据
① 细菌菌落特征的变异
如菌落大小、形状、色泽、粗糙或光滑等

② ③ ④ ⑤

病毒蚀斑的变异 对温度敏感性变异 对药物敏感性变异 对营养要求变异
如对氨基酸的特殊需要

⑥ 对宿主动物易感性变异。
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4、我国一些弱毒株的 育成线路与方法

53

我国一些弱毒株的育成线路与方法
弱毒株
猪丹毒弱毒菌株(GC42) 猪丹毒弱毒菌株(GC42) 猪丹毒弱毒菌株(64T10) 猪丹毒弱毒菌株(64T10) 猪肺疫弱毒菌株(EO630) 猪肺疫弱毒菌株(EO630) 口服猪肺疫弱毒菌株 羊链球菌弱毒菌株(F60) 羊链球菌弱毒菌株(F60) 马流产弱毒菌诛(C355) 马流产弱毒菌诛(C355) 马流产弱毒菌诛(C39) 马流产弱毒菌诛(C39) 禽霍乱弱毒菌株(6190E4) 禽霍乱弱毒菌株(6190E4) 布氏杆菌羊5号弱毒菌株 布氏杆菌羊5 牛肺疫兔化弱毒株

致弱线路与方法
强毒株→豚鼠370代→鸡42代 强毒株→豚鼠370代→鸡42代 强毒株→豚鼠370代一含有0.01~0.04%吖啶黄血液琼脂培养基上传10代 强毒株→豚鼠370代一含有0.01~0.04%吖啶黄血液琼脂培养基上传10代 强毒株→含海鸥牌洗衣粉培养基上传630代 强毒株→含海鸥牌洗衣粉培养基上传630代 强毒株→在培养上于42℃培养传代 强毒株→在培养上于42℃ 强毒株→鸡10代→培养基42-44℃ 10代→鸽10代→培养基42-44℃ l0代→鸡10代→培养基42-44℃10代→鸽10代 强毒株→鸡10代→培养基42-44℃ 10代→鸽10代→培养基42- 44℃ l0代→鸡10代→培养基42- 44℃ 10代→鸽10代 强毒株中含醋酸铊培养基传代 强毒株→雏鸡99代 强毒株→雏鸡99代 强毒株→豚鼠190代—鸡胚40代 强毒株→豚鼠190代 鸡胚40代 布氏羊型强毒株→鸡胚传代 牛肺疫强毒诛→兔传代

牛瘟兔化弱毒株、猪瘟兔化弱毒株 强毒株→兔传代 羊痘弱毒株、鸭瘟弱毒株 马传贫驴白细胞弱毒株 鸡痘弱毒株 日本乙型脑炎弱毒株(28) 日本乙型脑炎弱毒株(28) 日本乙型脑炎弱毒株(53) 日本乙型脑炎弱毒株(53) 口蹄疫A型鼠化弱毒株 口蹄疫A O型鼠化弱毒株 ZB型弱毒株 ZB型弱毒株 强毒株→鸡胚传代 马传贫驴强毒株→驴白细胞传代 强毒株→鹌鹑传代 强毒株→紫外线照射、蚀斑挑选 强毒株→地鼠肾细胞传代→鸡胚细胞传代 牛源强毒株→乳鼠传代

54

5、我国菌/毒种的保藏机构
成立了

《中国微生物菌种保藏管理委员会》

55

1.普通微生物菌种保藏管理中心
中国科学院微生物研究所,北京(AS):真菌、细菌 中国科学院武汉病毒研宄所,武汉(AS-IV):病毒

2.农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)
中国农业科学院土壤肥料研究所,北京(ISF)

3.医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC) 
中国医学科学院皮肤病研究所,南京(ID):真菌 卫生部药品生物制品研究所,北京(NICPBP):细菌  中国医学科学院病毒研究所,北京(IV):病毒

4.兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)
由农业部兽医药品监察所负责保藏、管理、供应及交换 等项工作。
56

6、菌/毒种的管理
为保证菌/毒种性状典型,安全不外散, 应做好如下管理 ① 菌/毒种的登记  ② 菌/毒种的检查  ③ 菌/毒种的保藏 ④ 菌/毒种的消毁 ⑤ 菌/毒种的交换、供应
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第三章 细菌培养技术

细菌培养技术是 生物制品的重要基础工作
? 既要了解细菌的生长繁殖和营养需要; ? 又要掌握细菌培养的基本技术。

细菌种类繁多,代谢方式各异, 营养需求也不尽相同,

但生长繁殖的基本条件相似

一、简单回顾

《微生物学》

1、细菌生长繁殖规律
(1)繁殖方式 二分裂繁殖

(2)繁殖速度
细菌每分裂一次,即为一代。 ? 在良好条件下,分裂迅速; ? 受外界环境条件的影响很大, 不能无限制地生长繁殖。

(3)生长曲线
细菌在特定环境或培养基(特别是液体 培养基)中,常呈现一定的生长曲线。

2、细菌的营养
? 细菌从外界摄取营养物质作合成的原料, 或产生能量;少数物质可调节新陈代谢。

① 水分 ② 有机物 ③ 矿物质 ④ 生长因子

3、细菌生长的环境条件
? 细菌培养的环境条件应与其自然生长繁殖 的要求相同或相似。

① 温度 ② 酸碱度 ③ 渗透压 ④ 气体

二、动物生物制品中

细菌的培养方法

根据目的和要求的差异

可采取不同的培养方法

1、表面培养
? 又称固体表面培养。 ? 将细菌种子液均匀地接种于固体培养基表面, 平放静置培养,然后收集菌苔。 ? 缺点:产量低,成本高。

多用于制造菌苗和诊断抗原, 如炭疽芽胞苗、布氏杆菌抗原等。

2、深层培养
? 将细菌种子液接种于液体培养基进行培养。 ? 包括 ① 液体静置深层培养 ② 生物反应器(发酵罐)深层培养

发酵罐

是大量培养细菌的最好方法

优点
① 自动控制 ② 密闭培养,污染少; ③ 产量高,成本低。

由常规培养的10~20亿/mL

提高到100亿/mL以上

3、透析培养
根据小分子能透过半透膜扩散,而将不同 分子量的物质分离原理设计的一种细菌培养 装置进行细菌培养。

通过透析培养可获得 高浓度的纯菌和高效价的毒素

有利于制造高效力的生物制品。
肉毒梭菌苗的比常规法的高200余倍, 安全性也相应提高。

三、影响细菌培养的因素

1、氢离子浓度
? 适宜的酸碱度是培养细菌的重要因素 ? 酸碱度主要通过两方面影响细菌的代谢: ①改变蛋白质的pI,使酶活性受阻; ②改变细菌的电荷性质,影响膜通透性, 使细菌生长受阻。

一般的病原微生物要求在

pH6.8~7.2
由于培养过程中,微生物产酸或产碱, 使pH发生改变,因此常在培养基中加入 缓冲系统。

2、水分和渗透压
各种生命活动必须有水才能进行。

? 是细菌的重要组成成分; ? 又是一种良好的溶媒。

也受到渗透压的影响
? 对一般的细菌来说: 处于高渗溶液——质壁分离 处于低渗溶液——细胞膨胀,甚至破裂 大多数细菌对渗透压的改变有一定的适应 能力,但突然改变将会使细菌失去活力。

3、温度
? 细菌只能在一定温度范围内生长繁殖, 超出温度的最低或最高限度,生长将中止。

在最适温度,生长发育最旺盛

多数病原细菌

最适温度在37℃

4、气体
? 细菌有不同的呼吸类型,要有适宜的 氧气环境: 有氧 无氧

? 有些细菌需要一定量的CO2才能旺盛生长

通气
可使需氧菌良好生长

5、种子接种量
种子是生物制品术语,指菌种的增殖培养物。 ① 接种量过少,
? 会引起生长繁殖缓慢,甚至出现无菌生长。

② 接种量过多
? 会将过多的代谢物带入,抑制细菌的生长。

种子接种量通常为

1~2%

6、培养时间
? 最佳的培养时间依据生长曲线而定 ? 多数在对数增殖后期至稳定前期活菌数最高 ① 收获过早,则活菌数少而幼嫩 ② 收获过迟,则细菌衰老,死菌及代谢物多

第四章 病毒培养技术

病毒为严格细胞内寄生!

自身无完整的酶系统,不能进行独立的代谢

病毒的复制与增殖
? 病毒的复制增殖过程 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 吸附 进入 脱壳 生物合成 装配 释放

6个步骤

疫苗、抗病血清的制造

需要大量病毒

培养病毒的方法

① 动物接种 ② 禽胚培养 ③ 细胞培养

一、动物接种增殖病毒技术
是最原始的病毒培养方法

优点
① 方法简单; ② 可测定病毒的致病性; ③ 可用于无法通过鸡胚或细胞培养的病毒。

缺点
① 动物的品质、个体差异性、体液因素等 ② 可能携带病原体等

干扰生物制品的质量

1、动物的选择

动物的品质对病毒的增殖影响很大, 并可干扰生物制品的质量。

如何选择动物

① 大动物应来源于非疫区:最好未接种过相应 病毒的疫苗,对相应病毒易感;经隔离饲养、 观察检查证明健康; ② 家兔、小鼠、大鼠等应为普通级或清洁级 ③ 鸡应属非免疫或SPF级标准; ④ 犬、猫应品种明确及普通级实验动物标准: ⑤ 体重、年龄基本一致,个体差别不宜过大。

2、接种方法
? 可根据病毒性质、材料性质以及目的不同, 采取不同途径:

(1)皮肤划痕接种 (2)皮下接种 (3)皮内接种 (4)肌肉接种 (5)腹腔内接种

二、病毒的禽胚培养技术

1911年Rous等首先用鸡胚培养研究 鸡肉瘤病毒的增殖

但这一技术直到1938年 Goodpasture等才应用鸡胚增殖病毒

Cox应用卵黄囊培养立克次体后, 鸡胚培养才广泛用于病毒和立克次体的研究。

鸡胚培养技术已广泛用于

? 病毒的分离、鉴定 ? 疫苗的抗原制备

等方面

鸡胚
是正在发育的活体

组织分化程度低,细胞代谢旺盛
? 适于许多人类和动物病毒 的生长增殖,

是常用的病毒分离培养方法

鸡胚培养的优点
① 来源充足,价格低廉, ② 操作简单,无需特殊设备或条件, ③ 易感病毒谱较广, ④ 对接种的病毒不产生抗体等。

鸡胚培养的缺点
① 可能含有某些家禽病毒的母源抗体; ② 可能携带垂直传播的病原体; 等等。

因此,用鸡胚分离培养病毒时

应使用非免疫鸡胚, 最好用SPF鸡胚.

一般8~14天的鸡胚最有利于病毒的生长 因为此阶段
? 发育日趋完善,各种脏器均已形成, 已能经受接种物的适当刺激; ? 胚胎细胞幼嫩,利于病毒的增殖, ? 也有利于收获高滴度的病毒

尿囊液量在11-13日龄时最高,

平均达6毫升左右。

除鸡胚外
其它禽胚也常用于动物病毒的分离培养

如:鸭胚、鹅胚、鸽胚等。

1、实验用器械
鸡胚培养技术简便,但仍需一些基本器械,例如:

? 孵化箱、检卵器、卵架、打孔器、镊子 ? 酒精灯、眼科镊和剪刀、吸头、洗耳球 ? 注射器、适用的针头 ? 无菌试管、平皿、三角瓶、烧杯 ? 消毒胶布、石蜡等

2、鸡胚的孵育
? 适宜的孵育温度为38~39℃ 相对湿度为45~60% ? 注意空气流通。 ? 孵育3天后每天应翻卵1~2次, 以保证气体交换均匀,发育齐全。

3、鸡胚的接种、检视和收获
? 根据病毒的不同,选用不同的接种途径 ? 主要应考虑

最适病毒感染部位、最佳接种胚龄 和获得最大的病毒滴度。

常用的接种途径
? 尿囊腔 ? 绒尿膜 ? 羊膜腔 ? 卵黄囊 ? 静 脉

4、影响禽胚病毒增殖的因素
? 种蛋质量 ? 接种技术 ? 孵化技术 ? 禽胚污染

大致有

(1)种蛋质量
种蛋质量直接与所增殖病毒的质量相关! ? ? ? 最理想的是SPF种蛋 其次是非免疫种蛋 而普通种蛋则不常用

① 病原微生物
? 家禽有很多病原可经种蛋垂直传递 ? ? ? ? ? ? 白血病病毒 网状内皮增殖病病毒 脑脊髓炎病毒 等 传染性贫血 腺病毒 支原体

常见的有

这些病原体既可污染生物制品本身, 又可影响接种病毒在鸡胚内增殖
如NDV接种SPF鸡胚和非免疫鸡胚, 在相同条件下培养,前者毒价至少比 后者高1个滴度。

② 母源抗体
? 家禽在感染病原或受到抗原刺激后,则其 种蛋就带有相应母源抗体,从而影响病毒 在鸡胚内增殖。 如IBDV强毒可使SPF鸡胚死亡率达100%, 但使非免疫鸡胚死亡率约30%。

③ 抗生素
? 饲料中的抗生素可以传递到种蛋。

如用四环素饲喂产蛋母鸡, 则鸡胚对立克次体和衣原体的感染产生抵抗.

(2)孵化条件
适宜的孵化条件 使鸡胚发育良好

利于病毒增殖,获得高滴度病毒

① 温度
? 温度是禽胚孵化成功的首要条件。

禽胚发育的适宜温度为37~39.5℃; 如用孵化机,适宜温度37.8~38℃。

② 湿度
? 禽胚对湿度有一定的耐受能力。
偏差5~10%对禽胚发育没有严重影响

? 湿度可控制孵化过程中蛋内水分的蒸发。

鸡胚孵化湿度标准为53~57%, 水禽胚孵化湿度比鸡胚约高5~10%.

③ 通风
? 禽胚在发育过程中吸入氧气排出CO2, 随胚龄增长需更换孵化机内空气。

孵 化 机 —— 机械通风 普通恒温箱—— 定期开启

④ 转蛋
? 转蛋的作用: A、使胚胎受热均匀; B、防止胚胎与蛋壳粘连;
这在鸡胚孵化至第4~7天尤为重要

C、强制胚胎定期活动,促进胚胎发育。

通常种蛋大头向上垂直放置 孵化过程中定期转蛋

(3)接种技术
? 不同的病毒有不同的接种途径; ? 同一种病毒接种不同日龄禽胚获得的 病毒量也不同。

鸡胚13~14日龄,鸭胚15~16日龄,

尿囊液含量最高(6~8mL)
因此,应根据不同病毒的培养时间 选择最恰当的接种胚龄。

同时应严格按照规定进行接种
不应伤及胚体和血管,以免影响其发育, 使病毒增殖速度降低或停止。

(4)禽胚污染
是危害病毒增殖最严重的因素之一, 应严格防上。

因此必须做到
① 接种时严格无菌操作 ② 定期清扫和消毒孵化室 ③ 种蛋入孵前需要消毒 ? 先用温水清洗; ? 再用0.1%来苏儿或新洁尔灭消毒凉干。

三、病毒细胞培养技术
自上世纪40年代末,首次在体外组织培养 脊髓灰质炎病毒以来,细胞培养已成为增殖 病毒的重要方法。

病毒细胞培养的原理

为病毒易感的组织细胞提供良好的生长环境, 使细胞适应并繁殖,从而为病毒增殖提供宿主.

1、细胞的分类
? 根据细胞的染色体和繁殖特性,可分为3类:

? 原代细胞(Primary cell) ? 细 胞 株(Cell strain) ? 细 胞 系(Cell line)

(1)原代细胞
? 由新鲜组织经过剪碎、胰酶消化制备的细胞 例如:鸡胚成纤维细胞

原代细胞对病毒的增殖最为敏感

但制备和应用不方便

因为原代细胞仅可传3代左右
原代细胞传代1次后的细胞称为次代细胞; 次代细胞形态和染色体与原代细胞基本相同。

(2)细胞株
? 自继代培养的细胞中选育的具有特殊生物学 性质和标记的细胞。 例如:
PK15(猪肾细胞株) BHK(地鼠肾细胞株) Vero(非洲绿猴肾细胞株)

这类细胞能连续传很多代 (50~100代)

但不能无限传代

细胞株广泛用于 病毒性生物制剂的制备

具有可靠的安全性

(3)细胞系
? 能在体外无限传代,多数来源于癌细胞 例如:
Hela(人子宫颈癌细胞) RAG(鼠肾腺癌细胞)

应用方便
多用于病毒的分离鉴定

有致癌性
不能用于疫苗的制备

2、细胞培养方法 随着生物技术的发展, 细胞培养的方法也日益增多!

目前在兽医生物制品上使用的方法

(1)静置培养 (2)转瓶培养 (3)悬浮培养 (4)微载体培养

(1)静置培养
? 将细胞悬液接入培养瓶或培养板中,置于 恒温箱内静置培养,细胞生长繁殖成单层。

静置培养是最常用的方法

广泛用于
病毒研究和生物制品的制造

(2)转瓶培养
? 将细胞悬液接入转瓶后放在恒温箱的转鼓上, 转速多为10~20转/h,使贴壁细胞不总是浸于 培养液中,有利于细胞呼吸和物质交流,

可利用少量的培养液培养 大量的细胞来增殖病毒

多用于生物制品生产

(3)悬浮培养
? 通过振荡或转动装置使细胞始终分散悬浮于 培养液内的培养方法,主要用于一些在振荡 或搅拌下能生长繁殖的细胞。

细胞悬浮培养瓶

悬浮培养能大量地提高细胞数量

从而提高生物制品的 产量和质量

(4)微载体培养
? 用细小的颗粒作为细胞载体,通过搅拌悬浮 在培养液内,使细胞在载体表面繁殖成单层 的一种细胞培养技术。

微载体大小为50~105nm,透明,无毒, 颗粒密度与培养液密度相似,易于细胞吸附
? 例如: DEAE-Sephadex A-50 Cytodex1 Cytodex2 Cytodex3

3、影响细胞生长的因素
培养液的好坏,是细胞培养的重要因素!

除此之外,还受到其他因素的影响

(1)温度
? 通常为37℃——有利于细胞的生长 也有利于病毒的繁殖 ? 高温可导致细胞死亡 ? 低温可使细胞生长减缓或终止。

(2)pH值
? 一般为pH7.0~7.4。 ? 低于6.8或高于7.6,都会抑制细胞的生长。

(3)气体
? O2是细胞生长所必需的; ? 另外CO2(5%)有利于细胞的生长。

(4)细胞接种量
? 细胞接种量太少,容易死亡。 ? 接种太多,细胞回很快脱落、死亡,死亡 细胞的碎片对细胞具有毒性作用。

(5)无菌条件
? 微生物的污染可使细胞迅速死亡,因此在 细胞培养的过程中要求严格无菌操作。

第五章 实验动物

一、概念
指经人工饲育,来源清楚、遗传背景明确, 并对其携带的微生物实行控制,可用于科研、 教学、生产、检定等的动物。

二、分类  介绍3种分类方法

1、根据来源及实际用途分类
(1)实验动物 专门培育,供实验用的动物。

(2)家畜家禽 可转为实验动物

产业家畜、禽 社会家畜

猪,马,牛,羊,鸡,鸭,鹅,兔,鸽 等 犬、猫等

(3)野生动物
是指从自然界捕获的动物,没有进行或 难以进行人工繁殖和饲养的动物。

如:

两栖类(青蛙、蟾蜍) 鱼类 鸟类 啮齿类(如黑线姬鼠等野鼠)

除少数外,一般不能或不易进行人工繁殖生产

(4)观赏动物
是指作为玩赏和供观赏的动物。 如:玩赏犬和猫等 

2、根据遗传学控制程度分类
(1)近交系动物
是指血缘关系极为相近的个体之间或遗传 组成极相似的个体之间进行的交配繁殖,从 而培育出来的动物。 近亲繁殖 20代以上 纯系动物

(2)封闭群动物
一个种群在固定地点,5年以上不从外部引入 任何新种,仅在群内随机交配繁殖,即可称为 封闭群。

近交系数低 既保持群体的一般特性,又保持动物的杂合性

(3)突变系动物
动物由于正常染色体的某个基因发生突变, 从而导致遗传变异,繁育出与亲本不同的新 品系,称为突变系。 如: 癫痫大鼠
高血压大鼠 裸鼠

理想的动物模型

(4)杂交群动物
两个近交品系动物之间进行有计划交配 所获得的第一代动物,称之为杂交群动物 或称杂交一代动物。

3、根据微生物学控制程度分类
(1)普通级动物 (2)清洁级动物 (3)无特定病原动物 (4)无菌动物 (5)悉生动物 

(1)普通级动物
Conventional animal, CV

? 不携带所规定的人兽共患病原和烈性传染 病病原的动物。 ? 饲养于开放环境,微生物等级要求最低, 但要有良好的饲养设施、管理操作规程及 规章制度。

(2)清洁级动物
Clean animal, CL

? 饲育在比较清洁的环境中,除普通动物应 排除的病原外,不携带对动物危害大和对 科学研究干扰大的病原体。

(3)无特定病原体动物
Specefic pathogen Free animal, SPF

? 是指机体内无特定的微生物和寄生虫及其 抗体存在的动物,但非特定的微生物和寄 生虫是允许存在的。

(4)无菌动物
Germ-free animal,GF

? 是指机体任何部位,用现有的检测技术, 检测不出任何微生物和寄生虫的实验动物

(5)悉生动物
Gnotobiotic animal,GN

? 已知菌动物或已知菌丛动物
animal with known bacterialflora

? 是将无菌动物在特定条件下饲养,人为 地植入某些微生物,即机体内带着已知 微生物的动物。

分为

? ? ? ?

单菌动物 双菌动物 三菌动物 多菌动物

其生活能力比无菌动物强,相对容易饲养, 而且在多种试验中可代替无菌动物,是用途 广泛、较为理想的实验动物。

三、实验动物标准化
实验动物在生物制品研制及科学研究中, 占有非常重要的地位。

没有标准化的实验动物, 就像没有标准化的仪器一样

不能保证生物学实验结果的科学性和可靠性!

实验动物标准化

是一个涉及多方面的大问题!
主要包括遗传学、微生物学、寄生虫学、 营养学、环境生理学等方面的质量控制标准, 以及以科学的方法培育和使用动物。

四、善待动物与动物保护

善待动物
美国加州大学动物房 小型猪有玩具玩 猴子可以看电视 白大衣改成淡绿色

倡导三R

R-1 (Replacement)
? 实验动物的代替 ? 用器官、组织、细胞、理化方法以及电脑 模拟等代替实验动物

R-2 (Reduction)
? 减少实验动物使用量 ? 使用低等动物,合用动物,使用高质量动物。

R-3 (Refinement)
? 动物实验的优化 ? 改良仪器设备(如核磁共振只需1只动物)

第六章 动物生物制品生产 主要设备

一、无菌设备
1、高压蒸汽灭菌器 立式 卧式

大型高压蒸汽灭菌器
应为双门嵌墙式结构→ 使操作区与净化区完全隔开

2、干热灭菌器
? 普通箱式

? 层流隧道箱式

3、辐射灭菌设备
? 利用射线或电子辐射穿透物品、杀死其中 微生物的灭菌方法。

? 主要用于:一次性使用的医用制品 SPF动物的饲料

辐射灭菌的优点
① 穿透力强,消毒均匀彻底 ② 可在常温下消毒,不破坏包装,消毒后的 用品可长期保存 ③ 消毒的速度快,操做简便,价格便宜

辐射灭菌的缺点
① 一次性投资大 ② 技术人员要专门培训

4、无菌室及超净台

无菌室

超净台

二、培养设备
1.温室:指用保温建筑材料作墙壁、地坪 和天花板的一种恒温暖房

2.培养箱

3.摇床

4.孵化器

5.生物反应器
可用来大规模培养细菌或细胞

三、乳化设备
1、组织捣碎机 组织的捣碎 用于 疫苗的乳化 液体的混合



2、胶体磨
? 是用于制造油乳剂疫苗的工具

工作原理

通过转齿和定齿的相对运动,通过其间隙的 剪切力、摩擦力、离心力和高频振动,从而使 油佐剂与抗原乳化;乳化的液珠直径约1~2μm

3、高压匀浆泵

? 是一种制备超细液-液乳化物或液固分散物的 通用设备。

工作原理
① 油佐剂及抗原在高压下进入可调节的间隙, 从而获得极高的流速(200~300m/s); ② 通过湍流和剪切力的作用,将油佐剂和抗原 加工成极细微的颗粒(0.25—2μm)。

四、分装与包装设备
是由
理瓶旋转工作台→多头分装机→胶塞定位机 →收集器→压盖机→贴签机→封口机→包装机 组成的作业流水线。

五、冷藏设备
1、冷库
① 空调间:0~15℃,高温库 ② 冷藏间:≤15℃,低温库

2、冷藏箱
① 冷藏箱:有制冷系统, 可保持比较好的低温状态 ② 保温箱:无制冷系统, 以软木、泡沫塑料等为保温材料

3、液氮罐

? 液氮的温度可达-196℃——超低温

4、冷藏运输设备

冷藏车

是构成冷链的重要环节

第七章 灭活与灭活剂

灭活是生物制品中的 一项非常基本的技术!!!

为什么要灭活?

1、提高生物制品的安全性 2、防止病原体扩散

一、什么是灭活
1. 微生物学意义上,灭活有两层含义: ① 是指破坏或杀死微生物使其成为没有生命 活力的过程。 ① 还有“灭能”的含义,是指将一些活性物质 (如激素、酶、补体等)丧失活性的过程。

2. 生物制品学意义上,灭活的含义

指利用物理或化学方法,破坏病原微生物的 活性(繁殖和致病能力),但仍保留抗原性的 过程。

3. 灭活的原理

使微生物蛋白、核酸、脂质等变性和 失去活性,从而起到灭活作用。

二、灭活的类型
按照灭活作用的性质可分为两类:

1. 物理灭活 2. 化学灭活

1、物理灭活
加 热灭活 包括 紫外线灭活 γ射线灭活
影响免疫原性,已基本淘汰

效果不够确实

效果尚不十分清楚

2、化学灭活

利用化学药品等使微生物、活性物质的某些 结构位点发生改变,从而丧失生命力、感染性、 毒性或活性。

方法简单、效果确实 最为常用

然而,化学灭活的效果常受
? ? ? ? 灭活剂种类、剂量 作用温度 pH 时间

等因素的影响

因此必须筛选最佳的灭活条件

三、灭活剂
inactivator

指用来灭活生物制品活性的化学物质, 又称化学灭活剂。

? 1911年,Lowenstein DH用甲醛处理破伤风 毒素而制成类毒素 ? 1924年,Puntoni以苯酚或甲醛处理制成犬瘟 热灭活苗, ? 1934年, Morion Dorset等用结晶紫灭活猪 瘟病毒制成猪瘟结晶紫疫苗。

介绍几种灭活剂

1、甲醛
? 是最古典、使用最广泛的灭活剂。 ? 甲醛的水溶液——福尔马林(含甲醛36~40%)

灭活机制是:还原作用
氨基→生成羟甲基胺 其醛基作用于微生物蛋白质的 梭基→生成亚甲基二醇单脂 羟基→生成羟基酚 巯基→生成硫代亚甲基二醇

常用浓度
? 细菌菌苗灭活 → 0.1~0.8% ? 病毒疫苗灭活 → 0.05~0.1%

2、苯酚
? 又称石炭酸。 ? 灭活机制: 使微生物蛋白(如脱氨酶、氧化酶等 酶系统)变性和抑制,从而导致微生物 死亡。

常用浓度
? 杀死细菌 → ≥1% ? 抑制细菌 → 0.2%

3、结晶紫
? 是甲基紫、龙胆紫的纯品 ? 灭活机制: 结晶紫阳离子与微生物蛋白质的羧基 结合,从而影响微生物正常代谢。

4、其他
① β-丙烯内脂 ② 烷化剂 ③ 缩水甘油醛 ④ 乙烯亚胺 ⑤ 二乙烯亚胺 ⑥ 硫柳汞
破坏病毒的核酸 潜在的致癌因子 破坏病毒的核酸 使病毒蛋白、核酸丧失活性 灭活效果在病毒要高于细菌 常用作消毒剂和杀菌剂

四、影响灭活效果的因素 什么是“灭活效果”?

二层含义
① 指灭活的完全性
即被灭活物的活性(毒性)是否完全丧失或破坏

② 指灭活后是否保留良好的抗原性
即灭活物是否具有刺激机体产生坚强免疫力的能力

1、灭活剂种类
? 不同灭活剂对同一微生物的灭活效果不同。 ? 如:
口蹄疫病毒经甲醛灭活17d后,仍可分离出有活性的核 酸,且能致死小鼠;用 乙烯亚胺 灭活则能使核酸丧失感 染性而达到完全灭活。

2、灭活剂剂量

灭活速度常随灭活剂量增高而递增

3、温度
? 同一浓度的灭活剂,温度越高灭活越快。 ? 但超过40℃,则对微生物抗原性有影响。

4、灭活物浓度
被灭活物的浓度越高,灭活时间越长

5、灭活物内的杂物
? 杂物越多 → 灭活时间长,灭活剂量高 ? 例如:制造组织灭活苗时,所用灭活剂量和 灭活时间要比细胞灭活苗时高和长。
以甲醛为例,制造兔出血症组织灭活苗,甲醛 浓度为0.4~0.8%,而灭活细菌为0.1~0.8%,灭活 病毒时为0.05~0.1%。

因此
在生物制品制造中,除应筛选出良好 的灭活剂外,还要选定最佳的灭活剂量、 温度、时间以及其他条件(如pH)。

五、灭活的检测
1、细菌: 2、病毒: 培养 → 活菌检测 动物 → 毒性检测 动物试验

注意

灭活病毒的复活

(1)交叉复活作用
灭活病毒与活病毒之间的重组, 子代病毒具有了灭活病毒的某些性状

(2)多数感染复活作用
在以同株灭活病毒大量感染敏感动物 或细胞时,会产生活的感染性病毒
一般认为,这是因为在灭活过程中,遭受破坏的 病毒基因部位不同;对个体来说,这些病毒子已经 被灭活,但在大量感染时,由于取长补短,恢复了 原毒株灭活前的所有基因结构而发生复活。

第八章 佐剂

佐剂是免疫学和生物制品学中的 一个重要内容

对增强机体对抗原的免疫应答, 提高生物制品的免疫效应发挥着重要作用

什么是“佐剂”呢?
adjuvant

是指与抗原物质混合或先于抗原或同时注入 动物体内,能非特异性地增强机体对抗原物质 的免疫应答的一类物质。

也称为免疫佐剂、抗原佐剂

一、研究历史
1、起始阶段
? 1916年Moignae最早用羊毛脂与石蜡油制成伤寒 沙门氏菌乳剂苗;继后Prevet用羊毛脂加琼脂为 佐剂制出炭疽菌苗。 ? 1925年,Gaston Ramon证明了明矾的佐剂作用。

该阶段多是铝佐剂在生物制品上的应用研究

2、1950年代
为提高兽医生物制品的免疫效果,在兽医 领域对佐剂进行了广泛的研究。

用氢氧化铝胶吸附再加油佐剂制成的猪 丹毒菌苗,免疫乳猪后的免疫力可持续9个 月,比铝胶佐剂苗提高1倍。

3、1960年代以后
矿物油佐剂的研究发展迅速

? ? ? ? ?

布氏杆菌油佐剂苗(1966) 魏氏梭菌油佐剂苗(1966) 流感油乳剂苗(1977) 禽支原体+新城疫油乳剂二联苗(1978) 链球菌+葡萄球菌乳剂二联苗(1984)



4、我国的佐剂的研究
佐剂的研究和佐剂苗的生产,始于1950年代

? 1958年曾用羊毛脂和液体石蜡油制造猪丹毒油乳 剂苗,但效果不理想。 ? 1980年代以来,对白油佐剂的研究和应用发展极 快,尤以禽病白油佐剂疫苗的种类更多,使用效 果也比较满意

二、佐剂标准
WHO认为佐剂除具有免疫增强效应外, 尚必须具备下列标准,否则不得用作佐剂。

1、无致癌或辅助致癌性
不能诱导或促进肿瘤形成

2、安全无毒性

通过肌肉、皮下、静脉、腹腔、 滴鼻、口服等各种途径进入动物 体后无毒副作用。

3、纯度高、杂质少

杂质往往是副作用的诱发物。 因此,佐剂必须符合质量标准。

4、应有一定的吸附力
最好吸附力强

5、在动物体内易降解
不宜长时期留存而诱发组织损伤

6、不含与动物有交叉的抗原
以避免诱发自身免疫反应, 防止发生自身免疫性疾病。

7、不应诱发自身超敏性
也不应与抗体结合形成有害的 免疫复合物。

8、应性质稳定
佐剂抗原混合物储存1年以上, 必须不分解、不变质和不产生不良 物质。

三、常见的兽用免疫佐剂

1、矿物质类佐剂
? 矿物质佐剂是传统佐剂中的一类。
包括

? 氢氧化铝胶 ? 磷酸铝胶

在兽用疫苗的制备中广泛使用。

特点
? 主要诱导体液免疫应答,
可刺激机体迅速产生持久的高抗体水平。

? 比较安全。

缺点
? 皮下注射时常有肿胀或结块; ? 不能有效刺激保护性T细胞免疫。

2、油类佐剂
? 佛氏佐剂
主要有

佛氏完全佐剂 佛氏不完全佐剂

? 矿物油佐剂

佛氏不完全佐剂
是由低引力和低粘度的矿物油及乳化剂 组成的一种贮藏性佐剂。

佛氏完全佐剂
在不完全佐剂的基础上加一定量的 分支杆菌而成。 虽然具有一定的副作用, 但其佐剂活性是其它物质难于相比的。

佛氏佐剂的特点
? 可使在正常状态下缺乏免疫原性的物质成为 免疫原。 ? 先作用于Th1细胞,后是Th2细胞,并能启 动细胞免疫而发挥作用。

矿物油佐剂
常用的有:10号白油

能使疫苗中的抗原物质缓慢释放, 从而延长疫苗的作用时间。

3、微生物佐剂
主要有脂多糖、分支杆菌等 分支杆菌在兽医中广泛地应用于疫苗。 经理化方法处理,可进一步获得有佐剂活性的片段

四、佐剂的生物作用机理

1. 佐剂与抗原物质混合后,改变了抗原的物理 性状,使抗原缓慢释放,延长作用时间。

2. 抗原被佐剂吸附后,增加了抗原的表面积, 使抗原易于被巨噬细胞吞噬。

3. 诱引巨噬细胞吞噬抗原物质, 刺激吞噬细胞对抗原的处理。

4. 促进淋巴细胞之间的接触,增强Th的作用。

5. 刺激致敏淋巴细胞分裂和浆细胞产生抗体。

故佐剂可使无免疫原性物质 变成有效的免疫原

五、油乳佐剂疫苗
? 单相乳化型
分为

? 双相乳化型

单相乳化型
(1)油包水(W/O)
O W

? 较粘稠,在机体内不易分散;但佐剂活性 优良,为生物制品所采用的主要剂型

(2)水包油(O/W)

W

O

? 较稀薄,在机体内易于分散;但佐剂活性 很低,生物制品中不采用

双相乳化型
又分为水包油包水或油包水包油型
W O O W O WO

粘度小,注射局部反应轻微, 易吸收和佐剂效应高

1、油乳剂原理
一种液体或粉末微粒(分散相或内相) 借助乳化剂、机械力的作用,分散悬浮于 另一种不相溶的液体(连续相或外相)中, 从而形成稳定的分散体系。

O

W

W

O

W O

O W

O

WO

乳化剂
? 指油乳剂中内相与外相间的界面活性物质, 具有促进和稳定两种互不相溶物形成乳剂。

W

O

Span80、Arldlcel80、Tween80、AtlsG-1471等

乳化原理
? 降低分散物的表面张力,在微滴(粒)表面上 形成薄膜或双片层,以阻止微滴(粒)的相互 凝结。
W O

2、油乳剂检验
? 粘度测定
检验项目: ? 稳定性测定 等

? 粒度大小及分布检测

生产中以粘度测定与稳定性测定为主:
粘度测定 – 最简易的方法是用内径为1.2mm的吸管,在室温 下吸乳剂lmL,垂直放出0.4mL所需的时间作为 粘度单位,以2~6s为合格,不得>10~15s。 稳定性测定 – 常用离心分层法:于半径10cm离心管装油乳剂, 3000rpm离心10~15min不分层,相当于可保存1年 以上不破乳。

第九章 冷冻真空干燥技术

冷冻真空干燥 是一种常用的物质干燥方法

简称冷冻干燥或冻干

目前,冷冻真空干燥技术已广泛用于 生物制品业方面。

该技术能有效地保存抗原的生物活性, 从而有利于贮存和延长活性。

一、冻干的原理
1. 将含有大量水分的生物活性物质先行降温 冻结成固体; 2. 再在真空和适当加温条件下使水分子直接 升华成水汽而被抽出;从而使生物活性物 质形成疏松、多孔样固状物。

二、冻干的特点
1、能有效保护生物活性
? 例如酶、微生物、激素等经冷冻干燥后生 物洁性影响甚微。 ? 因为冻干全过程都在低温真空条件下进行, 有效的降低了氧分子对微生物、酶等活性 物质的作用。

2、有利于冻干物的长期保藏而不致变质
? 由于物质是在冻结状态下升华干燥的,可将 95%以上的水分除去。 ? 冻干物呈海绵状结构,体积几乎不变,加水 后能迅速溶解并恢复原来状态。

三、冻干的应用
冻干技术已广泛应用于: ①生物制品方面
疫苗、诊断制剂、血清制品等的冻干

②医药工业方面
抗生素、维生素、酶制剂、血液制品等的冻干

③食品和化学工业方面
速溶咖啡、果汁、催化剂等的冻干

四、冷冻真空干燥系统
冻干过程是在低温真空条件下进行的,这个 过程的完成必须有一定的设备,这就是冷冻真 空干燥系统。

冷冻真空干燥系统由
致冷系统 真空系统 热交换系统 控制系统

四部分组成

冻干机组成示意图

五、保护剂
Protector

? 指保护微生物、寄生虫等活力和酶、激素、 免疫反应物等活性的一类物质。

又称稳定剂(stabilizer), 在冷冻真空干燥制品中广泛应用

就其组成讲,保护剂是一种混合物

① 既含有不能利用的成分; ② 也含有可利用的营养成分。

1、保护剂种类
(1)按化学成分分类
① 复合物类:脱脂乳,明胶,蛋白质及水解物, 酵母浸液,血清等 ② 聚合物类:葡聚糖,聚乙二醇,聚乙烯毗咯烷酮等 ③ 糖 类:蔗糖,乳糖,果糖,麦芽糖,棉子糖,已糖,葡萄糖等 ④ 醇 类:山梨醇,甘油,甘露醇,肌醇等 ⑤ 酸 类:氨基酸,拧檬酸,酒石酸,EDTA,磷酸等 ⑥ 盐 类:氯化钠,氯化绅,氯化铰,乳酸钙,谷氨酸钠等 ⑦ 抗氧化剂类:维生素C和E,硫脲等

(2)按分子大小以及抗氧化性分类
① 低分子物质
谷氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、赖氨峻、苹果酸、乳糖酸、 葡萄糖、乳糖、蔗糖、棉子糖、山梨醇等

② 高分子物质
脱脂乳、明胶、血清、脱纤血液、羊水、蜂蜜、酵母浸汁、 肉汤、蛋白胨、淀粉、糊精、果胶、阿拉伯胶、右旋糖酐、 聚乙烯毗咯烷酮、葡聚糖、羧甲基纤维素等

③ 抗氧化剂
维生素C和E、硫脲、碘化钾、铜酸铵等

2、保护剂的功能
既有生物学作用,也有物理学效应
① 保护微生物和活性物质在冻干过程中理化因素的 影响或损伤,维持较高的存活率和活性。
例如:菌苗的活菌数、疫苗的病毒滴度、酶的活性等;

② 使微生物、活性物质处于半静止或静止状态,以 延长生命、活性期。

③ 活性物质在冻干过程中保持原有的构架, 使制品形成海绵状结构。

④ 抗氧化剂能抑制氧化作用,从而维持微 生物、活性物质稳定以及静止状态。

3、保护剂的作用机理
不同的保护剂,其作用机制不同
① 防止活性物质失去结构水及阻止结构水形成结晶 而导致活性的损伤; ② 降低细胞内外渗透压差、防止细胞结构水结晶, 以保持细胞的活力; ③ 保护或提供细胞复苏所需的营养,有利于活力的 复苏和迅速修复自身。

4、适用于微生物的保护剂
不同的微生物、不同的生物制品 所用的保护剂也不同

病原细菌
常用的有: ? 5%蔗糖 ? 10%脱脂乳 ? 5%蔗糖脱脂乳 ? 1.5%明胶 ? 灭活犊牛血清 ? 灭活马血清



厌氧菌
常用的有: ? 10%脱脂乳 ? 7.5%葡萄糖血清 ? 0.1%谷氨酸钠 ? 10%乳糖溶液



支原体
常用的有: ? 3%脱脂乳、5%葡萄糖混合液 等 ? 12%蔗糖、1%牛血清白蛋白 ? 7.5%葡萄糖、1%牛血清白蛋白

立克次体

常用: ? 10%脱脂乳

酵母菌

常用: ? 马血清 ? 7.5%葡萄糖马血清

病 毒
明胶,血清,蛋白胨、血清蛋白,乳糖, 蔗糖,葡萄糖,谷氨酸钠,山梨醇,聚乙烯 毗咯烷酮等,

可不同浓度单独或混合组成保护剂使用

5、兽医生物制品常用的保护剂
(1)5%蔗糖(乳糖)脱脂乳
成分:蔗糖(乳糖) 5g 脱脂乳 加至100mL 制法: ①充分溶解,110~116℃高压灭菌30~40min; ②无菌检验阴性,4℃保存备用。 用途: – 羊痘鸡胚化弱毒冻干苗、鸡新城疫I系、II系 冻干苗、鸡痘鹌鹑化弱毒冻干苗、鸭瘟鸡胚 化弱毒冻干苗等。

(2)40%蔗糖明胶
成分: – 蔗糖 40g – 明胶 12g – 蒸馏水加至100mL 制法: ①混合溶解,调pH 6.8~7.0 ,116℃高压30~40min ②无菌检验阴性,4℃保存供配苗用。 用途: 猪肺疫弱毒冻干菌。

(3)聚乙烯毗咯烷酮乳糖
成分: – 聚乙烯毗咯烷酮 1g – 乳糖 10g – 蒸馏水加至 100mL 制法: ①混合溶解,120℃高压灭菌20min ②无菌检验应阴性,4℃保存供配苗用 用途: 水貂犬瘟热细胞冻干苗

(4)SPGA
成分:
– – – – – – 蔗 糖 76.62g 磷酸二氢钾 0.62g 磷酸氢二钾(3H20) 1.64g 谷氨酸 0.83g 牛血清白蛋白 10g 无离子水 加至1000ml

制法: ①混合溶解,除菌滤过 ②无菌检验应阴性,4℃保存供配苗 用途: 鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒苗

6、影响冻干保护剂效能的因素
(1)保护剂种类
? 利用不同保护剂冻干的同一种微生物的保存期 的存活率不同。 ? 如:分别用7.5%葡萄糖肉汤和7.5%乳糖肉汤作 保护剂冻干的沙门氏菌,在室温保存7个月后 的细菌存活率分别为35%与21%。

(2)保护剂浓度:
以大肠杆菌加不同浓度葡萄糖作保护剂 进行冻干,并测定冻干品的细菌存活率, 证明5~10%葡萄糖存活率最高

(3)保护剂配制方法
? 配制方法的不同往往能影响保护剂的效果, ? 例如含糖保护剂灭菌温度不宜过高,否则由 于糖的炭化而影响冻干制品的物理性状和保 存效果,所以均以114℃30min灭菌。 ? 又如血清保护剂就不能用热灭菌法,必须以 滤过法除菌。

(4)保护剂pH
? 保护剂的pH应与微生物生存时的pH相同或 相近,过高或过低都能招致微生物的死亡。 ? 例如明胶蔗糖保护剂的pH以6.8~7.0为最 佳,否则会造成微生物大量死亡。 ? 又如含葡萄糖、乳糖保护剂经高压灭茵后 能或多或少改变保护剂的pH值,从而影响 保护效果,为此最好采取滤过除菌。

因此,每种新的冻干制品在批量生产前应进 行系统的最佳保护剂选择试验,包括:
① 保护剂冻干前后的活菌数、病毒滴度和效 价测定的比较试验 ② 不同保存条件和不同保存期的比较试验 ③ 即使在冻干制品投产以后,仍须根据条件 的改变不断作选择试验,以改进冻干制品 的质量

第十章 免疫血清制备技术

什么是免疫血清?
动物在接受抗原刺激或自然感染康复后,其 血清中通常含有针对特定抗原的高效价特异性 抗体,该动物的血清即称为免疫血清。 又称为高免血清、抗病血清。

? 抗细菌血清
主要包括

? 抗病毒血清 ? 抗毒素血清

是用于人工被动免疫的制剂
1. 动物感染病原后,使用免疫血清,就等于 直接给动物输入抗体,可以迅速中和病原 或毒素,发挥良好的治疗作用。

2. 免疫血清也可用于疾病的预防,提供短期的 被动免疫。 3. 特异性免疫血清还可用于疫病诊断和微生物 鉴定。

一、免疫血清的制备过程
通常是给适当动物以多次注射特定病原微生物 或其代谢产物等抗原物质,刺激动物发生免疫应 答,在血清中产生大量的特异性抗体。

1、动物的选择
? 既可用同种动物,也可用异种动物!
用同种动物制造的血清 用异种动物制造的血清 同源抗病血清 异源抗病血清
以抗病毒血清居多 抗菌性和 抗毒素血清为主

? 常选择大动物 → 主要是考虑出血量问题。

(1)许多免疫血清是用马制备的! 优点
? 不受接种途径、抗原量限制; ? 饲养管理也比较方便; ? 采血便利;产血清量多。

马匹的选择
① 年轻:3~8岁 ② 健康:来自非疫区
? 就地进行常规检疫后运回隔离饲养、观察 ? 然后根据不同生产目的进行系统检疫(马鼻疽、 马传染性贫血、马流产等),优选出的马匹经 消毒后转入专用饲养舍饲养、生产。

(2)也可用健壮阉牛制造
? 饲养管理简便; ? 多选择3~10岁的黄牛,并应隔离观察检疫 (结核、牛肺疫、布病等),证明完全健康后 方可用于生产; ? 但血清渗出率偏低。 多用于抗气肿疽、抗猪丹毒、抗猪牛出败、 抗牛瘟等血清的制备。

(3) 猪
? 应选择体壮、健康者; ? 放血提取血清,不作循环采取血清方法; ? 主要用于抗猪瘟血清生产。

(4) 羊 、 兔 、 鸡 等
? 常用于制备诊断用高免血清; ? 较少用于抗病血清生产。

2、抗原的准备
抗原是制备免疫血清的基础 优良的菌/毒种则是制备优良抗原的关键

优良菌/毒种的生物学特征应十分典型
(形态、培养、生化和血清学等)

? 强 毒 常用的菌/毒种有: ? 弱 毒 ? 灭活毒 可单独使用,可共同使用,也可交互使用, 其目的是尽可能提高抗体效价。

按照制备方法的不同

免疫用抗原分为

(1)组织毒抗原
用健康、易感的本种动物人工感染增殖病原; 根据微生物增殖规律,采集含毒高的组织制成 活的或灭活的抗原液。 如血液、肝、脾、肺、肾、淋巴结和脑组织等

细菌和病毒等微生物

都可利用动物增殖!

例如:抗猪瘟血清抗原制备
① 给健康、敏感、40~80kg猪注射猪瘟强毒1mL ② 于6~8d发病典型时(高温、症状明显)颈动脉放血 ③ 采血液、脾和淋巴结等,分别制成血液毒抗原和 组织毒悬液抗原。

(2)鸡胚毒抗原
① 可在鸡胚增殖的微生物均适用 ② 将种毒接种鸡胚,收获后经检验合格即可 作为免疫原。

(3)细胞毒抗原
① 多种病毒均可通过细胞增殖; ② 将种毒接种细胞后培养增殖,然后根据不同 病毒的增殖盛期收获,经检验合格后即可作 为免疫原。 ③ 必要时可浓缩、提纯,也可制成佐剂抗原。

(4)培养物抗原
细菌抗原几乎都用培养物制造。 ① 将菌种接种于规定的培养基,37℃培养, 收获后经检验合格制成抗原。 ② 也可于培养物内加入佐剂制成佐剂抗原。

3、免疫程序
由于病原微生物的性质、免疫机制的不同, 各有其最佳的免疫程序。

1、一般的免疫程序
(1)如以强毒抗原为抗原 ? 基础免疫时以灭活疫苗为抗原, ? 然后以递增量强毒抗原进行高度免疫。

这种免疫程序通常可获得高效价的抗血清 如:抗气肿疽血清、抗猪牛出败血清等

(2)如以灭活佐剂抗原免疫
只需以递增量抗原进行免疫, 即可获得高效价的抗血清。

如:破伤风抗毒素血清等

2、免疫间隔和次数
不同的免疫原,差异较大!
如: ? 抗猪丹毒血清全程免疫要注射抗原20次、100d左右 ? 抗猪瘟血清全程须注射抗原6次以上、50d左右

3、抗体效价测定
? 常在免疫程序完成后采血进行抗体效价测定 ? 合格后方可采血提取血清

然后按后期程序注射、采血,持续生产抗血清

4、血清提取
包括:采血和血清分离

(1)采血
① 采血时间
? 通常在最后一次免疫8~10d后测定抗体效价, 合格后开始第1次采血。 ? 第1次采血后3~5d可进行第2次采血 ? 第2次采血后,经3~5d天可再次注射抗原, 如此循环进行。

② 采血量
? 按动物每kg体重采取10mL左右

注意: 采血常在上午空腹时进行,前一晚上不喂 精料,而仅给草料和水,避免血中出现乳糜

(2)血清分离
① 自然凝结加压法
? 无菌操作采血后室温静置凝固; ? 然后于血凝块上加上灭菌的不锈钢铭, 将血块压下以析出血清。

② 枸橼酸盐血浆分离血清法
? 以10%枸橼酸钠液为抗凝剂(3.5%)采血; ? 静置分层; ? 按1000mL血浆加入30%CaCl2 1.3mL,混匀 后静置48h,去除纤维制成血清。

5、质量检验
① 物理性状检验
按成品检验的有关规定进行

② 无菌检验 ③ 效力检验 ④ 安全检验
按各种抗血清规定方法、标准进行 常用:
? 18-22g健康小鼠2只,各皮下注射血清0.5mL ? 250-450g健康豚鼠2只,各皮下注射血清10mL ? 观察10d均应健活

二、类毒素及抗毒素的制备
某些病原微生物能产生强有力的特殊毒性 物质,从而大大增强病原的毒害作用,这种 毒性物质就称为毒素。

? 外毒素 毒素 ? 内毒素

是微生物在生命活动过程 中产生并释放或分泌到周 围环境中的毒素。

只有在微生物死亡后细胞 破裂时,才能释放出来的 毒素。

类毒素
外毒素经适量浓度的甲醛处理后,可去除 其毒性,保持其抗原性;这种丧失了毒性而 仍具有抗原性的外毒素,称为类毒素。

也称为“变性毒素”

抗毒素
以类毒素作为抗原免疫动物,刺激机体相应 的B细胞活化增殖为浆细胞后,产生的特异性 抗体,称为抗毒素。 抗毒素可特异性识别侵入机体的外毒素 并中和其毒性,以保护机体免受毒害

1、类毒素的生产和检定
产毒素菌种 产毒培养基 培养毒素4~7d 毒素的检定
如破伤风MLD应>2×106

毒素脱毒
0.3~0.4%甲醛,37℃,20~30d

类毒素

除去 非特异性物质

精制类毒素 适当佐剂 吸附精制类毒素

类毒素及 吸附类毒素的检定

类毒素的检定:安全试验等; 吸附类毒素的检定:吸附度试验,安全试验,效力试验

2、抗毒素血清的制备 
毒素或类毒素 免疫动物 抗毒素血清 提纯 精制抗毒素 抗毒素的质量检定 [安全性试验、热原质试验、效价测定]
?马、骡、驴是比较适用的动物 ?基础免疫和加强免疫

三、卵黄抗体的制备
卵黄抗体,不能理解为抗卵黄的抗体, 而是在卵黄中含有针对某种病原微生物的 特异性抗体。

目前,家禽病毒病是没有特效药物

使用血清是一种很好的方法, 但血清的价格比较高!

人们又寻求了另外一条途径

制备高免卵黄抗体, 并收到了良好的防治效果。

卵黄抗体液的制备过程
以抗IBD的卵黄抗体液为例

1、动物的选择
同制备抗血清的要求一样 必须选择健康无病的产前或开产鸡群

2、疫苗的选择
很重要 →获得高效价抗体的关键 通常选择免疫原性优良的油乳剂疫苗

3、免疫程序
① 第1次免疫: ? 肌肉注射免疫,每只2mL,分点注射 ② 第2次免疫: ? 第1次免疫后10~14d,重复免疫1次 ③ 第3次免疫: ? 第2次免疫后10~14d,再重复免疫1次

4、抗体监测与高免蛋的收集
? 第3次免疫后,以琼脂扩散法测定卵黄中的 抗体水平; ? 在抗体效价达到1:128时,开始收集高免蛋, 一般高免蛋合格时间大约可持续1个月。 ? 抗体效价降低到1:64时停止收蛋,并根据情 况再进行1次加强免疫。

5、卵黄液的收集与处理
① 收取卵黄液前,必须对鸡蛋进行清洗消毒
? ? 先进行清洗,必要时要擦拭(如粘了很多鸡粪) 然后用0.5%新洁尔灭浸泡消毒

② 打开鸡蛋去除蛋清,分离蛋黄。

③ 根据检测的抗体效价,加入灭菌生理盐水 进行稀释

? 加水不是没有限制的,必须保证稀释后的抗体效价 不低于1:16~32; ? 在稀释后的卵黄液中,加入青、链霉素,至终浓度 各为1000U/mL→抑制可能存在的杂菌污染。 ? 目前不提倡加入硫柳汞。

6、成品检验

① 效价测定
主要包括

② 细菌培养 ③ 安全实验

四、免疫血清或卵黄抗体的 合理使用

1、尽早使用
? 抗体可中和病原或毒素,但这种作用仅局限 于未与组织细胞结合的病原或外毒素。 ? 因此,使用免疫血清治疗传染病,越早越好。

2、途径合理
? 大多采用注射的途径,但在注射方法上, 可皮下或肌肉注射,也可静脉注射。 ? 一般多采用皮下或肌肉注射 静脉注射作用虽快,但易引起过敏反应。

3、用量足够
? 治疗传染病,作用快、效果好。但半衰期短 (同种动物3w,异种动物2w), 有效维持时间 一般只有2~3w。 ? 因此,必须足量注射,才能取得理想的效果。

4、防止发病
? 免疫血清如用异种动物制备,则具有抗原性, 有引起血清病的可能。 ? 预防的主要措施是使用提纯的制品,并按照 要求剂量使用,一次用量不可过大。

第十一章 诊断用生物制品

一、定义
诊断用生物制品——也称为诊断试剂 指采用免疫学、微生物学、分子生物学等 原理或方法制备生物制剂,用于疾病的预防、 监测、流行病学调查以及健康状态评价等。

二、分类
包括抗原、抗体、核酸、激素、血浆蛋白、 肿瘤标记物、基因的检测,以及血型、细胞组 织配型、免疫组化、生物芯片等试剂。

抗原与抗体
是利用微生物、寄生虫或其代谢产物,或动物 血液、组织,根据免疫学原理制备的生物制剂。 用于疾病诊断、群体检疫、免疫 状态检测以及病原微生物鉴定。

体外试验诊断用品 体内试验诊断用品

多数 少数

抗原与抗体
① 凝集试验用抗原与抗体 ② 沉淀试验用抗原与抗体 ③ 标记试验用抗原与抗体 ④ 补体结合试验用抗原与抗体 ⑤ 定型因子血清 ⑥ 变态反应抗原

1、凝集试验用抗原与抗体
? 颗粒性抗原与相应抗体以合适的比例结合, 在电解质存在条件下,能发生凝集反应。 ? 如:
布氏杆菌凝集反应抗原 马流产凝集反应抗原 鸡白痢凝集反应抗原 鸡源支原体凝集反应抗原

2、沉淀试验用抗原与抗体
? 可溶性抗原与相应抗体以合适的比例结合, 在电解质存在条件下,能发生沉淀反应。 。 ? 如:
马传贫琼脂扩散反应原 传染性法氏囊病琼脂扩散反应原 马立克氏病琼脂扩散反应原 炭疽沉淀素血清

3、标记试验用抗原与抗体

? 荧光抗体 ? 酶标抗原、酶标抗体 ? 同位素标记抗体 等

4、补体结合试验用抗原与抗体
? 鼻疽补体结合反应抗原 ? 牛肺疫补体结合反应抗原 ? 布氏杆菌补体结合反应抗原 ? 马传贫补体结合反应抗原 ? 钩端螺旋体补体结合反应抗原



5、定型因子血清

? 大肠杆菌定型血清 ? 沙门氏菌因子血清 ? 魏氏梭菌定型血清 等

6、变态反应抗原 ? 鼻疽菌素 ? 布氏杆菌水解素 ? 结核菌素


三、诊断试剂的要求

特异

敏感

使用方便

纯化

标记

商品化

第十二章
生物制品的质量监控

兽医生物制品是一类特殊的药品

它除用于临床治疗和诊断以外 还可用于预防疾病

? 质量好的制品→增强机体的免疫力,预防疾病

? 质量差的制品→不但不能保障健康, 还可能带来灾难! 如:发生散毒或发生异常接种反应等

一、药品生产管理与质量检验准则
为促进我国生物制品质量的提高, 必须遵守药品生产管理与质量检验的GMP准则。

什么是GMP

GMP
Good Manufacture Practice

中文译为《药品生产质量规范》

是对医药用品生产的全面质量管理

涉及工厂环境、厂区、车间、控制区、洁净区、 原材料采购、生产过程管理、质量检验、清洁卫 生、组织机构与人员、技术文件、产品销售和用 户服务等一系列影响产品质量的环节所作的具体 规定,以保证产品的安全性。

GMP的由来
GMP是从药品生产中获取经验教训的总结。
人类在经历了多次药物灾难,特别是20世纪最大 的药物灾难“反应停”事件后,公众要求对药品制定 严格监督的法律。在此背景下,美国于1962年修订 了《联邦食品药品化妆品法》。

并于1963年首先颁布了GMP
是世界上最早的一部GMP,在经过数次修订 后,成为至今较为完善、内容详细、标准最高 的GMP。

1969年WHO也颁发了GMP 并受到许多国家和组织的重视

经过3次修改,成为一部较全面的GMP

目前
世界上已有100多个国家和地区实施了 GMP或准备实施GMP。

我国GMP推行过程
我国提出并推行GMP是在1982年, 比最早提出GMP的美国,迟了20年。

? 1982年,中国医药工业公司参照先进国家 GMP制订了《药品生产管理规范》(试行稿)

? 1984年修改成为《药品生产管理规范》(修订稿)

? 1988年,国家卫生部颁布了我国第一部《药 品生产质量管理规范》,作为正式法规执行。 并于1992年进行了修订。 ? 1999年,国家药品监督管理局对1992年GMP 进行了修订,使我国的GMP更加完善、更加 严谨、更加切合国情。

为什么要进行 GMP认证?

GMP的诞生是制药工业史上的 一块里程碑
它标志着对制药业全面质量管理的开始。 实施GMP认证是国家对企业监督检查的一种 手段,是药品监督管理工作的重要内容。

1、实施GMP管理对传统管理体系提出了挑战 淘汰落后的管理办法,强化符合GMP要求 的管理,是企业发展的必由之路。 一些不适应GMP管理要求的做法必然会退 出历史舞台。

2、国家法规使得GMP认证工作已经由被动 的行为,变为企业自身发展的需求。 随着国家药品监督管理局的成立,颁布了 《药品生产质量管理规范》、《药品GMP认 证管理办法》、《药品GMP认证工作程序》 等有关法规,以及执行在新药审批、药品生 产许可证的换发、药品的定价等倾斜性政策。

3、能否取得GMP认证是进入药业的前提条件 我国已经采取药品GMP认证与生产许可证 相结合的办法,只有通过了药品GMP认证的 制药企业,政府才发给许可证。

4、GMP给法定标准提供一个广泛、实际的解释

从而使药品生产企业能在法律范围内经营管理。

5、GMP认证为企业管理提供一种办法, 使任何一种药品都能按照一套标准生产 从而可以消除生产上的不良习惯,使药品 质量得以保证。

6、GMP是制药企业进行国际贸易时, 关于药品质量的共同语言和统一标准 企业要与国际接轨,就必须实施GMP,符 合社会质量管理国际化、标准化、动态管理 的发展趋势,才能经得起入世浪潮的冲击。

7、实施GMP是制药企业的根本出路 国际竞争日益激烈,大部分市场份额被少 数的跨国制药公司控制。 实施GMP,提高产品质量,增强服务观念 是市场经济条件下中小型企业的立足之本, 发展之源。

制订和实施 GMP的意义

1. 保护消费者的利益,保证用药安全有效; 2. 保护企业,使企业有法可依、有章可循; 3. 实施GMP是制药行业的责任,也是中国 加入WTO之后,实行药品质量保证制度 的需要(未通过GMP认证→就会被拒之 于国际贸易的技术壁垒之外)。

GMP与ISO9000 有何区别?

1. GMP是国际药品生产质量管理的通用准则, ISO9000是由国际标准化组织(ISO, International Organization for Standardization)颁布的关于质量管理 和质量保证的标准体系。 2. GMP具有区域性,多数由各国结合本国国 情制定本国GMP,仅适用于药品生产行业。 ISO9000是国际性的质量体系,不仅适用于 生产行业,也适用于服务、经营、金融等 行业,因而更具广泛性。

3. GMP是专用性、强制性标准,在绝大多数 国家或地区的GMP具有法律效力,它的实 施具有强制性,其所规定内容不得增删。 ISO9000的推进、贯彻、实施是建立在企业 自愿基础之上,可进行选择、删除或补充某 些要素。

二、我国动物生物制品监察制 

我国在1952年建立颁布了兽医生物药品监察 制度 , 设立中国兽药监察所统一管理监督全国 兽医生物药品的生产与质量。

中国兽药监察所的职能
? 贯彻、检查《兽医生物药品制造及检验规程》的 执行; ? 选育、保藏、鉴定与分发生产用的菌种和毒种; ? 抽查出厂产品的质量; ? 组织新产品和新工艺的审定; ? 处理或仲裁有关的产品质量事故; ? 传播生物药品方面的信息与技术培训。

三、生物制品GMP规范
兽药生产质量管理规范、兽药生产质量管理规范附录 1.从事生物制品制造的全体人员(包括清洁人员、维修人员) 均应根据其生产的制品和所从事的生产操作进行卫生学、 微生物学等专业和安全防护培训。 2.生产和质量管理负责人应具有兽医、药学等相关专业知识, 并有丰富的实践经验以确保在其生产、质量管理中履行其 职责。

三、生物制品GMP规范
3.生物制品生产环境的空气洁净度级别要求:
① 10000级背景下的局部100级:细胞的制备、半成品制备中的接种、 收获及灌装前不经除菌过滤制品的合并、配制、灌封、冻干、加 塞、添加稳定剂、佐剂、灭活剂等; ② 10000级:半成品制备中的培养过程,包括细胞的培养、接种后鸡 胚的孵化、细菌培养及灌装前需经除菌过滤制品、配制、精制、 添加稳定剂、佐剂、灭活剂、除菌过滤、超滤等;体外免疫诊断 试剂的阳性血清的分装、抗原--抗体分装; ③ 100000级:鸡胚的孵化、溶液或稳定剂的配制与灭菌、血清等的 提取、合并、非低温提取、分装前的巴氏消毒、轧盖及制品最终 容器的精洗、消毒等;发酵培养密闭系统与环境(暴露部分需无菌 操作);酶联免疫吸附试剂的包装、配液、分装、干燥;

三、生物制品GMP规范
4.各类制品生产过程中涉及高危致病因子的操作,其空气 净化系统等设施还应符合特殊要求。 5.生产过程中使用某些特定活生物体阶段,要求设备专 用,并在隔离或封闭系统内进行。 6.操作烈性传染病病原、人畜共患病病原、芽胞菌应在专 门的厂房内的隔离或密闭系统内进行,其生产设备须专 用,并有符合相应规定的防护措施和消毒灭菌、防散毒 设施。对生产操作结束后的污染物品应在原位消毒、灭 菌后,方可移出生产区。

三、生物制品GMP规范
7.如设备专用于生产孢子形成体,当加工处理一种制品时应 集中生产。在某一设施或一套设施中分期轮换生产芽胞菌 制品时,在规定时间内只能生产一种制品。 8.生物制品的生产应避免厂房与设施对原材料、中间体和成 品的潜在污染。 9.聚合酶链反应试剂 (PCR)的生产和检定必须在各自独 立的环境进行,防止扩增时形成的气溶胶造成交叉污染。 10.生产用菌毒种子批和细胞库,应在规定储存条件下,专 库存放,并只允许指定的人员进入。

三、生物制品GMP规范
11.以动物血、血清或脏器、组织为原料生产的制品必须使 用专用设备,并与其它生物制品的生产严格分开。 12.使用密闭系统生物发酵罐生产的制品可以在同一区域同 时生产,如单克隆抗体和重组DNA产品等。 13.各种灭活疫苗(包括重组DNA产品)、类毒素及细胞提取物 的半成品的生产可以交替使用同一生产区,在其灭活或消 毒后可以交替使用同一灌装间和灌装、冻干设施,但必须 在一种制品生产、分装或冻干后进行有效的清洁和消毒, 清洁消毒效果应定期验证。

三、生物制品GMP规范
14、用弱毒(菌)种生产各种活疫苗,可以交替使用同一生产区、 同一灌装间或灌装、冻干设施,但必须在一种制品生产、 分装或冻干完成后进行有效的清洁和消毒,清洁和消毒的 效果应定期验证。 15.操作有致病作用的微生物应在专门的区域内进行,并保持 相对负压。 16.有菌(毒)操作区与无菌(毒)操作区应有各自独立的空气净 化系统。来自病原体操作区的空气不得再循环或仅在同一 区内再循环,来自危险度为二类以上病原体的空气应通过 除菌过滤器排放,对外来病原微生物操作区的空气排放应 经高效过滤,滤器的性能应定期检查。

三、生物制品GMP规范
17.使用二类以上病原体强污染性材料进行制品生产时,对 其排出污物应有有效的消毒设施。 18.用于加工处理活生物体的生产操作区和设备应便于清洁 和去除污染,能耐受熏蒸消毒。 19.用于生物制品生产、检验的动物室应分别设置。检验动 物应设置安全检验、免疫接种和强毒攻击动物室。动物饲 养管理的要求,应符合实验动物管理规定。 20、生物制品生产、检验过程中产生的污水、废弃物、动物 粪便、垫草、带毒尸体等应具有相应设施,进行无害化处 理.

三、生物制品GMP规范
21.生产用注射用水应在制备后6小时内使用;制备后4小时内 灭菌72小时内使用,或者在80℃以上保温、65℃以上保温 循环或 4℃以下存放。 22.管道系统、阀门和通气过滤器应便于清洁和灭菌,封闭性 容器(如发酵罐)应用蒸汽灭菌。 23.生产过程中污染病原体的物品和设备均要与未用过的灭菌 物品和设备分开,并有明显标志。 24.生物制品生产用的主要原辅料(包括血液制品的原料血浆) 必须符合质量标准,并由质量保证部门检验合格签证发放.

三、生物制品GMP规范
25.生物制品生产用物料须向合法和有质量保证的供方采 购,应对供应商进行评估并与之签订较固定供需合同,以 确保其物料的质量和稳定性。 26.动物源性的原材料使用时要详细记录,内容至少包括动 物来源、动物繁殖和饲养条件、动物的健康情况。用于疫 苗生产、检验的动物应符合《兽用生物制品规程》规定的 “生产、检验用动物暂行标准”。 27.需建立生产用菌毒种的原始种子批、基础种子批和生产 种子批系统。种子批系统应有菌毒种原始来源、菌毒种特 征鉴定、传代谱系、菌毒种是否为单一纯微生物、生产和 培育特征、最适保存条件等完整资料。

三、生物制品GMP规范

28.生产用细胞需建立原始细胞库、基础细胞库和生产细胞库 系统,细胞库系统应包括:细胞原始来源(核型分析,致瘤 性)、群体倍增数、传代谱系、细胞是否为单一纯化细胞系、 制备方法、最适保存条件控制代次等。 29.从事人畜共患病生物制品生产、维修、检验和动物饲养的 操作人员、管理人员,应接种相应疫苗并定期进行体检。 30.生产生物制品的洁净区和需要消毒的区域,应选择使用一 种以上的消毒方式,定期轮换使用,并进行检测,以防止产 生耐药菌株。

三、生物制品GMP规范
31.在生产日内,没有经过明确规定的去污染措施,生产人 员不得由操作活微生物或动物的区域进入到操作其他制品 或微生物的区域。与生产过程无关的人员不应进入生产控 制区,必须进入时,要穿着无菌防护服。 32.从事生产操作的人员应与动物饲养人员分开。 33.生物制品应严格按照《兽用生物制品规程》或农业部批 准的《试行规程》规定的工艺方法组织生产。

三、生物制品GMP规范

34.对生物制品原辅材料、半成品及成品应严格按照《兽用生 物制品规程》或《兽用生物制品质量标准》的规定进行检验。 35.生物制品生产应按照《兽用生物制品规程》中的“制品组批 与分装规定”进行分批和编写批号。 36.生物制品的国家标准品应由中国兽医药品监察所统一制备、 标定和分发。生产企业可根据国家标准品制备其工作标准 品. 37.生物制品生产企业设立的监察室应直属企业负责人领导。 负责对物料、设备质量检验、销售及不良反应的监督与管 理,并执行《生物制品企业监察室组织办法》的有关规定.

四、成品检验程序及方法
1. 抽样
按灭活菌苗及血清批量在50万毫升以下者每批抽样 5 瓶, 50—100 万毫升者抽样 10 瓶, 100 万毫升以上者 抽样 15瓶;同批冻干制品分几柜冻干者,应以柜为单 位,每柜抽样5瓶;诊断液每批抽样5瓶

2. 无菌检验或纯粹检验 3. 活菌计数 4. 安全检验
检查外源性细菌污染检查杀菌;灭活或脱毒状况检查 残余毒力或毒性物质;检查对胚胎的致畸和致死毒性

5. 效力检验
目的在于评定制品的实际使用价值  

6. 物理性状检验
检查其装量是否正确、封口是否严密、包装是否 整洁美观,以及内容物是否有异物等

7. 真空度检查
目前都用高频火花真空测定器检查,凡瓶内出现 蓝紫色或紫色或白色光者为合格 

8. 残余水分测定
进行真空烘箱测定法或卡氏测定法测定含水量。 冻干制品残余水分含量均不得超过4%

五、我国新动物生物制品的管理
1. 目前动物生物制品生产及检验规程的审批程序是:
按新制品要求准备详细资料,向中国兽药监察所申报, 然后交中央农业部兽药规程委员会审定,审定认可后列入 《规程》,正式生产、销售和使用。

2. 新制品管理
凡菌(毒)种的变换、生产工艺的重大改变或新的生物制剂 的研制成功,经实验室试验、区域性试验和中间试验三个 步骤证明安全有效,并有一定的数据者均属新制品。新制 品可按国家新制品管理要求申报列入《规程》。

3. 申报新制品的资料应包括: ? ? ? ? ? ? ? 菌(毒)种的选育与鉴定 菌(毒)种的毒力与稳定性 免疫原性 生产工艺流程 安全与效力检验标准和方法 免疫剂量、免疫产生期和免疫期 保存条件与保存期等方面的内容 等等

4. 新制品申报的资料应包括:
①申报公函; ②新制品制造及检验规程草案; ③新制品使用说明书; ④新制品质量标准起草说明; ⑤新制品试验研究报告; ⑥新制品中间试制和区域试验总结; ⑦区域试验地区的反映。

5. 新制品只能在经兽药规程委员会审定认可后 方可正式生产、销售。 

第十三章 畜禽防疫

尽管使用疫苗不能消灭疫病,但它在控制 和预防畜禽传染病的发生和流行,促进养殖 业的发展中发挥着不可替代的重要作用。

疫苗是重要的生物制品

没有今天这样种类繁多、品质优良的各类 兽医生物制品,养殖业则很难求得大发展

疫苗的作用功不可没

但是
免疫接种失败仍然是最令养殖户头痛的问题

畜禽虽已接种疫苗,但在规定免疫期内经 检查免疫效力不合格或抵抗不住相应特定 疫病的爆发和流行,均称为免疫接种失败

防不胜防, 常造成不应有的损失

一、免疫接种失败的原因

1. 疫苗因素
(1)疫苗的选择
? 应选免疫原性好的毒株或当地流行毒株。 ? 疫苗与当地流行病原的血清型应该相同。 ? 对多血清型病原应该考虑使用多价疫苗。

(2)疫苗的质量
? 抗原含量直接决定疫苗接种的免疫效果;
– 弱毒疫苗中必须含有足够量的有活力的弱毒; – 灭活疫苗没有在体内繁殖的过程,因此必须含有 足够含量的抗原。

? 如使用了假冒、伪劣及来源不明、标识不清、 非法生产和非法进口的疫苗,或使用了过期、 失效或破损的疫苗,就必然会影响免疫效果。

(3)疫苗的保存
? 不同类型的疫苗对保存条件的要求不一样。
– 灭活苗 – – – 弱病毒苗 弱毒活菌苗 细胞结合疫苗 ——2~15℃的阴暗处 ——-15~-20℃,避免反复的冻融 ——2~8℃下的冰箱中,不宜结冰保存 ——液氮

? 疫苗在运输或携带过程中,也要保证适宜 的温度,尤其要避免高温和阳光直射。

(4)疫苗的稀释液
? 特定的疫苗(如MDV疫苗等)一定要用配套的 专用稀释液; ? 其它疫苗最好采用灭菌生理盐水进行稀释; ? 避免使用自来水→漂白粉可致弱毒活力下降。

(5)不同疫苗之间的干扰
? 不同的弱毒疫苗同时或以相同途径接种, 疫苗在体内会相互干扰,影响彼此复制和 免疫应答。 ? 如:
– 传染性支气管炎活疫苗对新城疫弱毒苗的干扰 – 猪繁殖与呼吸障碍综合征活疫苗会影响猪瘟活疫苗

(6)疫苗的安全性
? 致弱毒株存在毒力返强的可能; ? 弱毒疫苗可能存在病原体污染; ? 灭活疫苗可能会出现灭活不彻底; ? 疫苗接种后,某些成分可能会导致超敏反应。

2. 动物因素
(1)遗传因素
? 应选免疫原性好的毒株或当地流行毒株。 ? 疫苗与当地流行病原的血清型应该相同。 ? 对多血清型病原应该考虑使用多价疫苗。

(2)母源抗体的干扰
? 幼畜禽的母源抗体水平过高,会干扰活疫苗 在体内的复制,不能产生应有的保护力。 ? 因此,应根据抗体监测确定首免时间。

(3)动物的营养状况
? 营养不良(如缺乏维生素、微量元素及氨基酸) 会影响免疫系统的发育,从而造成免疫功能 低下。 ? 例如:
– VA缺乏会导致免疫器官的萎缩,影响淋巴细胞的 增殖、活化、受体表达,导致T细胞、NK细胞数 量减少,吞噬细胞的吞噬能力下降,B细胞的抗 体产生能力降低。

3. 人为因素
(1)免疫程序不合理
? 没有根据疫病流行和本场实际情况,照搬照抄别 人的免疫程序或随意增减免疫次数、疫苗种类及 剂量等。 ? 如初免时间过早,则会因动物免疫器官未发育成 熟或受较高母源抗体的干扰,影响抗体的产生; ? 但初免时间过晚,则可能造成未免疫时已感染; ? 另外,必须考虑抗体的半衰期。

(2)疫苗接种剂量
? 一定剂量范围内,免疫力产生与剂量成正相关; ? 疫苗用量过少,不足以引起足够强度的免疫力; ? 疫苗用量过大,会引起免疫麻痹; ? 免疫次数过于频繁,也可造成免疫麻痹。

(3)疫苗接种途径不恰当

? 接种的途径有:点眼、滴鼻、饮水、喷雾、注射、 刺种等。 ? 采用哪一种方法应根据疫苗类型及抗体产生的形 式决定的。 ? 不采取正确的接种方法,则不能产生坚强的免疫 保护力。

(4)疫苗混合不匀
? 弱毒疫苗在使用前,通常需要进行适当的稀释; ? 如果稀释不均匀,则会导致部分动物得不到足够 的疫苗,从而不能产生应有的应答。

(5)疫苗失活

? 饮水免疫时,如果稀释液中含有氯及其他消毒剂、 或酸碱度不适宜,防疫器械内残留有消毒剂等, 均可以使疫苗效力降低。 ? 接种过程或饮水时间过长,也可导致活疫苗活力 降低,一般不超过2~3h。

(6)接种操作不当
? 打“飞针”或注射器漏液、针头过粗,均可使注射 剂量不准。 ? 接种时操作无序或无标记,可造成漏防或重防。 ? 点眼、滴鼻免疫时,药液没有滴入眼、鼻内,或 未待药液吸入后已放手。 ? 喷雾免疫时喷射不均,雾粒大小不当。 ? 饮水免疫时,水量不足或饮水器过少,畜禽强弱 争饮,而使饮水不均,致不同个体的抗体水平层 次不齐 。

(7)接种时污染强毒
? 接种的器械必须严格灭菌,最好每只家畜更换 一个针头,家禽最起码每10只更换一个针头。 ? 动物群体中可能存在潜伏感染或隐性感染个体, 如果用一个针头连续注射全群动物,则很容易 引起疾病水平传播。

4. 病原因素
(1)免疫抑制性疾病
? 如PRRSV,PRV,PCV,IBDV,MDV,CAV,ALV 以及霉菌毒素中毒、某些严重寄生虫感染等, 均会损害免疫系统,导致免疫抑制,使机体 对疫苗不能产生有效的免疫力。 ? 动物发病期间接种疫苗,还可以发生严重的 反应,甚至引起死亡。

(2)野毒或强毒株的早期感染
? 疫苗接种后需要一定时间才能产生免疫力。 ? 而这段时间恰恰是一个潜在的危险期,一旦有 野毒入侵,就难免疾病的发生。

(3)病原变异
? 疫苗在研制、使用通常都滞后于病原的变异, ? 使用原来的菌株或毒株制备的疫苗在接种后, 不能针对变异的病原产生有效的免疫力。

5. 其他因素
(1)不良应激
? 不良应激因素可通过神经-内分泌-免疫网络, 减弱疫苗的免疫应答,甚至导致免疫失败。 ? 例如:
– 机体在发生应激时产生的大量肾上腺皮质激素, 能显著损伤T细胞,抑制巨噬细胞作用,增加 IgG的分解代谢。

(2)卫生状况不良
? 动物的圈舍及周围环境中存在大量的病原。 ? 做好环境卫生和消毒工作,可减少或避免感染, 也可使动物安全度过接种后的诱导期。

(3)药物因素
? 如氟苯尼考、庆大霉素、头孢噻呋、敌菌净、喹 乙醇等抗菌药物,莫能菌素、盐霉素、克球粉等 抗寄生虫类药物,地塞米松、氢化可的松、强的 松等肾上腺皮质激素类药物。

? 免疫前后使用了这些药物,可降低动物免疫作用。

(4)光照
? 有研究表明日光照时间超过20L:4D时(L光照 时间;D无光照时间),鸡体会对抗体的产生 有一定抑制作用; ? 在长时间光照饲养条件的进行免疫,免疫失败 的可能性会增加。

二、使用畜禽疫苗注意的问题

1、加强饲养管理、注意健康状况
? 只有在机体健康的前提下接种疫苗,才能产生 好的效果;因此接种时畜禽必须健康,否则不 能进行免疫。 ? 例如: – 机体免疫器官受损(如IBDV感染) – 机体的营养不佳

(2)注意免疫程序
? 合理的免疫程序是防疫获得成功的基础。 ? 由于畜禽的年龄、母源抗体、疫苗类型及当地 疫病流行情况不尽相同,应按照当地疫病流行 特点制订合理的免疫程序,以确保畜禽能获得 坚强的免疫力,从而达到防病的目的。

(3)注意疫苗质量
? 选用优质疫苗是防疫取得良好效果的前提。 ? 应仔细检查疫苗名称、厂家、批号、有效期、 贮藏条件等;经销单位是否有经营资格。 ? 对已失效、无批号、物理性状异常或来源不清 的疫苗要坚决废弃。

(4)注意使用方法
? 正确的使用方法是防疫取得成功的关键。 ? 在使用前应:
– 详细核对疫苗与所预防的疫病是否相符; – 使用的器械是否经过清洗和消费; – 是否严格按要求使用指定的稀释液和按规定的方法 进行操作; – 稀释后的疫苗是否在规定时间内用完; – 接种疫苗的剂量和部位是否准确无误等。。

(5)注意应激反应
? 畜禽接种疫苗后一般7-21天才能产生免疫力。 ? 在此期间若发生剧烈的应激反应(如转群、断 喙、突然换料等)则均会影响免疫力;因此, 要尽量减少和防止应激反应的发生。。

(6)防止早期感染
? 早期感染是导致防疫失败的罪魁祸首。 ? 要切实做好日常的环境卫生和消毒工作,特别 在接种疫苗前后要严防病原入侵和早期感染。

三、如何制定免疫程序
免疫程序是指根据传染病、疫苗和动物的 特点所制订的免疫接种具体实施程序

免疫程序在不同的养殖场、不同用途 的畜禽群、不同饲养方式的情况下 是不可能的相同的。

应当根据当地疫病流行情况及其影响因素,

制定合理的免疫程序

(1)应结合疫病的流行情况
? 当地比较流行或曾经发生及存在威胁的疫病应 重点安排; ? 而本地从未发生过的疫病,即使有疫苗,也应 慎重使用。

(2)应注意畜禽的用途
? 不同用途的畜禽接种疫苗的种类不一; ? 对于饲养周期较长的动物,其免疫程序应综合 考虑系统免疫;
– 如母猪需接种细小病毒疫苗,而育肥猪则不需

(3)应考虑畜禽的抗体水平
? 应根据母源抗体水平确定首免日龄; ? 还应根据疫苗接种后免疫力产生的时间、免疫 期或抗体检测情况,确定何时加强免疫。

(4)应注意各种疫苗的特点
? 各种疫苗的免疫特性、产生免疫力的时间、免 疫期的长短各不相同的。 ? 一般情况下应首先选用毒力弱的疫苗作基础免 疫,然后再用毒力稍强的疫苗进行加强免疫。 ? 有时可用联苗,但对流行比较严重的传染病, 其疫苗最好单独接种。

(5)其他应注意的因素
? 免疫程序的受多方面因素的影响,不能作硬性 统一规定。 ? 为使免疫更合理、更科学化,应考虑建立免疫 监测制度,根据免疫监测适时调整和修正免疫 程序。

举例 1

蛋鸡免疫程序

举例 2
商品肉鸡免疫程序

举例 3

猪主要传染病免疫程序


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