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浅谈石蜡切片的制作与存在问题


浅谈石蜡切片的制作与存在问题
摘要:石蜡切片是观察植物组织构造常用的制片方法之一。活的细胞或组织多为 无色透明,各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差,在一般光镜下不易清 楚区别;组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败,失去原有正常结构,因此, 观察植物叶片结构结果显示,组织经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤后完好 保存细胞原有状态,而且能清晰辨认其形态结构。 关键

词:石蜡切片;组织;染色;形态结构 石蜡切片(paraffin section)石蜡制片又叫永久制片,组织学常规制片技术 中最为广泛应用的方法。其优点主要是适合各种植物组织的制片,切片的厚薄易 于控制(最薄可达015μ m) ,清晰度很好,亦适合作细胞学研究,并能够制成连续 切片,制片易于长久保存,易于交流等。 但制片周期较长,易受条件限制,制片中使 用化学试剂较多,对人有一定毒害,易使材料变脆、变硬或变形,某些内含物易于 消失,常使组织变小,甚至使组织扭转变形,细胞所含物质缩小而折光性增强,影 响观察正确性,且制片成本较高等。 一、植物组织制片技术的概述 植物组织制片技术是随着显微镜的出现而发展起来的技术, 使人们认识植物 体结构的有效手段,已成为植物生物学的重要组成部分[1]。切片技术是生物科学 工作者特别是植物学工作者常用的一种实验手段。 随着各种新仪器的问世和新技 术方法的不断建立与使用,石蜡切片技术也逐渐扩展、渗入许多新领域中,做为 基础技术提供有效的实验或使用样品。 石蜡包埋组织切片还可用于细胞原位核酸 分子杂交技术中, 可对材料中被杂交的DNA 分子进行定位、含量分析或观察基因 表达(mRNA)水平;聚合酶链式反应(PCR)技术可用于固定、石蜡包埋组织的 DNA 分析,使研究进入了分子水平,但在短期内这些技术尚不能做常规使用[2]。 迄今为止, 植物制片技术已建立了许多方法,多采用的有徒手切片法、滑走切片 法、离析法、压片法、石蜡切片法等[3],其中最常规的为石蜡切片法。然而采用 常规石蜡切片法包埋及染色所需的时间太长、太繁琐,有些质地过硬的材料也不 宜使用。本研究同样采用此方法,并在方法上进行了一些改进,其周期短成为该 法的显著特点,8-10 天即可完成整个制片过程,同时还节省了试剂[6]。 二、实验器具与试剂

2.1 器具 石蜡切片机、烘箱、切片刀、恒温展片台、蜡杯、酒盅若干、酒精灯、 蜡铲、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、台木、树胶、脸盆、包埋纸盒、吸管、 毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。 2.2 试剂 1%番红、1%固绿、各浓度的酒精(无水乙醇、95%、85%、80%、 70%、50%、30%)、FAA 固定液、二甲苯、石蜡、埃利希苏木精染液、郝普特氏 粘片剂、蒸馏水、中性树胶等。 3 实验材料 选择植物健康、标准、具代表性的部分[4]。如果不是为了特别目的,不能用 一些病态的不正常的材料。 采下的材料应尽快浸入固定液固定。本实验采用几种 针茅(Stipa.)的叶片进行石蜡制片,材料直径1mm 左右,长0.8-1.0cm。 4 实验步骤 4.1 固定 所截取得材料应迅速投入固定液。选择固定液的原则就是用药品把细胞杀 死,使细胞的原生质凝固,死后不发生变化,尽可能保持原来的结构以供我们观 察。良好的固定剂,应是穿透力强,使细胞立刻致死,原生质全部凝固;不发生 任何变形,增强折光率,并且不妨碍染色。因此植物材料不同,应选择不同的固 定液。 我们选择FAA 固定液对针茅叶片进行固定,FAA 固定液是最常用的一种固 定液, 其用量最少应为所固定材料的总体积的20倍,应该使植物材料四周都能 浸泡在固定液里,这样能在短时间里使固定液浸透材料。植物材料固定后,若不 立即制片,可以保存在固定液中,或转至70%酒精溶液中保存[7]。 4.2 脱水及透明 将材料从固定液中取出后,进行植物材料脱水,其具体流程如下: A:酒精X:二甲苯 70%A(2h)→70%A(2h)→70%A(2h)→80%A(过夜)→85%A(2h)→95%A+伊红 (2h)→100%A(1h)→100%A(1h)→1/2A+1/2X(1h)→1/2A+1/2X(1h)→X (1h)→X(1h)。设置浓度梯度是为了防止材料皱缩,但具体浓度梯度和浸泡 时间要视材料情况而定,对于幼嫩的材料,梯度要大些,各步浸泡时间可短些,

老的硬的梯度则要小些, 各步浸泡时间则相应要长些。第二次100%A 脱水很关 键,一定要确保水脱尽。 4.3 渗蜡 将透明的材料用镊子取出放进蜡杯中, 再把碎石蜡(熔点48-50℃)用蜡铲 放到蜡杯2/3 为止,加盖放入37℃温箱,放置24 h 进行溶蜡。24 小时后去掉蜡 杯的盖子, 之后再将温箱温度调至56℃放置5天,使其透明剂充分挥发。取若干 个酒盅将材料转移至盛有熔点为60-62℃石蜡的酒盅里,温箱温度调到70℃,2h 换一次熔点60-62℃的石蜡, 换三次即可进入包埋程序。 4.4 包埋 4.4.1 折包埋纸盒 包埋前应先准备包埋用的纸盒。纸盒用较硬而光滑的纸折成,大小根据植物 材料的大小而定,这里用6cm×1cm×1cm 的纸盒。 4.4.2 植物材料包埋 将纯石蜡倒入小纸盒, 用加热的镊子迅速把材料按需要的切面和一定的间隔 排列整齐并使其竖直,进行包埋[5]。稍微凝固后倒置于清水盆中彻底冷却凝固。 在常规石蜡包埋中最困难的是碎小组织、纤细叶片的包埋,可以在纸盒里倒入少 许的石蜡,是材料基部固定住后,再倒石蜡至完全覆盖住材料。 4.5 修蜡 将包埋好的材料从摆卖纸盒里拖出蜡块, 用双面刀片切割成小块,刀片不 宜太厚,以免材料从蜡块中脱落。每个小块包含一个材料,并修成梯形,切面在 梯形的上部。注意上部矩形对边平行,梯形底部用烧热的蜡铲将其固定在木台 (2cm×2cm×2.5~3cm)上,植物材料的切面与木台的粘贴面平行。 4.6 切片 将粘有蜡块的小木块至于切片机上固定, 调整切距到适当大小,转动调节 器调切片厚度8μ m 进行切片。注意切片时要一手转动切片机,另一手执毛笔将 切下来的片子摊开以形成一长条蜡带。切片过程中,如果蜡带偏向一边,也要及 时修正蜡块,从而保证切片的连续性。 4.7 粘片及烘片 滴一滴粘片剂于干净载玻片中央, 用干净的擦镜纸涂抹均匀后, 滴上蒸馏水,

将取下的具代表性的蜡带切成小段置于载玻片上(放上四至五段),然后将载玻 片放到恒温展片台上(保持40℃)烫片。 待充分烫平后将其移至边缘试玻片上的水 分充分烘干。之后将切片放置15天自然晾干或取代为31℃ 温箱烘干一天。烫片 时要注意把握时间,不能烫片过度,但要保证充分烫平。 4.8 脱蜡及染色 将玻片标本放于切片框里待进行脱蜡于染色步骤, 具体步骤如过一下)→ 85%A(过一下)→50%A (过一下) →30%A (过一下)→1%番红溶液(4h)→蒸馏水 (迅 速)→50%A+HCI (迅速)→95%A+氨水(迅速)→1%固绿(95%A 配制)(30s) →95%A (1min)→100%A (过一下)→100%A(过一下)→50%X+50%A(过一下)→ 100%X(过一下)→100%X(过一下)。注意番红染色时间要长些(至少3h 以上), 随后的两次经过酒精的时间都应很短,以免洗掉染上的番红,固绿的染色时间大 约在20-30s,均要视具体情况而定。 4.9 封片 从二甲苯中取出然好色的片子,用中性树胶进行封片。酱油植物切片的玻片 平置于实验台上, 在上面滴一滴树胶于玻片中央位置,使其慢慢向外溢,用镊 子取干燥的或浸在75%乙醇中的盖玻片,从植物切片的一侧呈一倾斜的角度接触 树胶, 慢慢盖上, 待整个盖玻片的内表面全部接触树胶后, 用镊子轻轻盖压玻片, 赶出切片中的气泡,并使树胶曾尽可能薄而均匀。注意封片用的该玻片要清洁, 封片时要注意不要产生气泡。 三、石蜡切片制作中的问题与解决 石蜡切片是目前各种切片制作方法中最普遍应用的一种方法。 优质切片的标 准是切片要平整、无刀口、无划痕、无皱褶, 染色鲜明、清晰, 红蓝对照明显。 但制作石蜡切片程序较多, 步骤复杂, 无论哪个环节出现问题, 都会影响切片 整体质量。影响切片质量的因素很多: 1、脱水 脱水过程中出现的问题主要是脱水不净和过度硬化,脱水不净时二甲苯不能 渗入,蜡液不能渗入组织,可导致切片困难,切出的片子在染色时易脱片。而组织 蜡块与空气接触后也会因水分蒸发而凸陷,故脱水时一定要保证脱水液浓度达标, 经常更换新液,遇脂肪组织或疏松的纤维组织宜加长脱水时间。组织在纯洒精中

放置的时间也不能过久,否则会造成过度硬化,另外为防止组织过硬,对于比较柔 嫩的组织,其起始的脱水洒精浓度可低于70 %[8]。 2、透明 二甲苯是最常见的透明剂,但其收缩性强,极易使组织变脆,故在这一过程中 要严加控制,一般30 分钟就可达到透明的程度,但温度较低时可适当延长时间或 置于温箱中加热,另外在透明过程中还要注意更换二甲苯,有时甚至更换二、 三次 以上,每次10 分钟左右,如二甲苯为旧液体,应选择多的更换次数。 3、浸蜡、包埋 浸蜡和包埋要一次完成,要尽量在恒温下操作,防止中间出现温度差,蜡的温 度要适宜,不能过高使组织烫坏或使碎小组织变脆,变硬,也不能温度过低使组织 与石蜡脱离,蜡块中不能出现气泡、裂隙,斑点,对于碎小组织要尽可能使其处于 同一平面,否则会造成切片不全与漏切,此时要尽可能使碎小组织下沉,并防止其 重叠。 4、切片 手工切片时,用力要均匀一致,不宜过重过猛,容易造成切片厚薄不均,甚至 毁坏蜡块。 在夏季切片时,为保持蜡块硬度,可把蜡块放于冰柜中,切时取出,组织 蜡块四周在切片前应修齐,大小适当,切片机要放稳,不能震动,切片刀要置好,倾 斜角要大小适宜,一般以20 —30 为宜[9]。 5、染色 染色过程中出现的总是较多,除了要防止染色效果不佳外,还要注意不能脱 水。为此首先要注意染色液的配制浓度要准确,PH 值要适当,且不能有沉淀。染 色前切片脱蜡要彻底。染色时间要根据染液的新旧适当调整,必要时在染色过程 中用显微镜观察,染色过程中避免阳光照射。 防止脱片的主要措施有:载玻片要洗 涤干净,切片贴附时,水温要足够,使切片与玻片贴紧,贴附之后不宜马上染色要 烤干。染色过程中,水冲洗不宜太猛。 6、封固 切片封固不良,易出现色素颗粒、气泡、云雾状物等,其原因大致为:封固时 二甲苯已挥发完毕,封固剂过稀,切片厚薄不匀,切片未展开,封固方法不当,组织 脱水不净等,故在封固前,当二甲苯挥发后,应重新放入到二甲苯中透明,封固剂

要浓度适当,封固时先将盖玻片一侧放置于滴有树胶的组织切片上,然后缓慢放 下将空气完全排除,封固时避免水蒸气进入[10]。 我认为制作优质切片的关键在于责任心, 如果每一个人每一天都能真正做 到设身处地为患者着想, 严格遵守操作规程, 常规石蜡切片的质量一定会越来 越好。

参考文献: [1] 王明书, 孙敏, 白志川.结构植物学试验指导[M].西南师范大学出版社, 2003. [2]黄南平.N-烷基-ε -己内酰胺的合成及其在植物材料染色中的应用[J].江西 科学,2003,21(1):64-66. [3]荣伟,刘海燕.关于石蜡切片在染色中脱蜡的探讨[J].解剖学杂志,2006 29(1):91. [4]叶创兴,冯虎元,等.植物学试验指导[M].清华大学出版社,2006. [5]何凤仙,主编.植物学实验[M].高等教育出版社,2000. [6]丘安经主编.植物学实验[M].华南理工大学出版社,2003. [7]李正理,编著.植物制片技术[M].2 版.北京:科学出版社,1987. [8]龚志锦,詹榜洲主编,病理组织制片和染色技术[M] . 上海:上 海科学技术出版社,1994 ,l —30. [9]张宜玲,于颖彦,一种改良快速石蜡制片技术[J] . 诊断病理 学杂志,1998 ,5 (3) :169 —170. [10]王伯云,李玉松,黄高 ,张远强主编,病理学技术[M] . 北京:人

民卫生出版社,2000 ,61 —94.


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