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分子荧光分析法


第五章 分子荧光分析法
荧光 自然界存在这样一类物质,当 吸收了外界能量后,能发出不同波长

和不同强度的光,一旦外界能源消失,
则这种光也随之消失,这种光称为荧 光。

外界提供能量的方式有多种,如
光照、加热、化学反应及生物代谢等。 通过光照激发产生的荧光称为光致荧

光。


根据激发光的波长不同,荧光可
分为X射线荧光、紫外可见荧光和红 外荧光等。根据发射荧光的粒子不同,

荧光又可分为分子荧光和原子荧光。

由于不同的物质其组成与结构不
同,所吸收光的波长和发射光的波长 也不同,利用这个特性可以进行物质

的定性鉴别。如果该物质的浓度不同,
它所发射的荧光强度就不同,测量物 质的荧光强度可对其进行定量测定。

荧光分析法(fluorescence analysis)
就是利用物质的荧光特征和强度,对 物质进行定性和定量分析的方法。

荧光分析法的特点是灵敏度高、
选择性好、样品用量少和操作简便。 它的灵敏度通常比分光光度法高 2~3

个数量级。在卫生检验、环境及食品
分析、药物分析、生化和临床检验等 方面有着广泛的应用。

第一节 基本原理
一、荧光的产生

物质分子的能级包括一系列电子
能级、振动能级和转动能级。

分子吸收能量后,从基态最低振动能
级跃迁到第一电子激发态或更高电子 激发态的不同振动能级(这一过程速

度很快,大约10-15 s),成为激发单
重态分子。激发态分子不稳定,可以 通过以下几种途径释放能量返回基态。

1. 振动驰豫
这一过程只能发生在同一电子能级

内,即分子通过碰撞以热的形式损失部
分能量,从较高振动能级下降到该电子 能级的最低振动能级上。由于这一部分

能量以热的形式释放,而不是以光辐射
形式发出,故振动驰豫属于无辐射跃迁。

2. 内转换
即激发态分子将多余的能量转变 为热能,从较高电子能级降至较低的 电子能级。内转换也属于无辐射跃迁。

3. 荧光 较高激发态分子经无辐射跃迁降 至第一电子激发单重态的最低振动能 级后,仍不稳定,停留较短时间后

(约10-8 s,称作荧光寿命),以光
辐射形式放出能量,回到基态各振动

能级,这时所发射的光称为荧光。当
然也可以无辐射跃迁形式返回基态。

4. 系间窜跃
有些物质的激发态分子通过振动驰豫和内 转换下降到第一电子激发态的最低振动能级后, 有可能经过另一个无辐射跃迁转移至激发三重 态,这一过程伴随着自旋方向的改变,称为系 间窜跃。对于大多数物质,系间窜跃是禁阻的。 如果分子中有重原子(如I、Br等)存在,由 于自旋-轨道的强偶合作用,电子自旋方向可 以改变,系间窜跃就变得容易了。

5. 磷光
经系间窜跃的分子再通过振动驰豫降至

激发三重态的最低振动能级,停留一段时间
(10-4~10 s,称作磷光寿命),然后以光辐

射形式放出能量返回到基态各振动能级,这时
发出的光称为磷光(phosphorescence)。由于

激发三重态能量比激发单重态最低振动能级能
量低,故磷光辐射的能量比荧光更小,即磷光

的波长比荧光更长。

二、激发光谱和荧光光谱
(一)荧光的检测
光源发出的紫外可见光通过激 发单色器分出不同波长的激发 光,照射到样品溶液上,激发 样品产生荧光。样品发出的荧 光为宽带光谱,需通过发射单 色器分光后再进入检测器,检 测不同发射波长下的荧光强度 F。由于激发光不可能完全被 吸收,可透过溶液,为了防止 透射光对荧光测定的干扰,常 在与激发光垂直的方向检测荧 光(因荧光是向各个方向发射 的)。

(二)激发光谱与荧光光谱的形成 任何荧光物质,都具有两种特征
光谱,即激发光谱(excitation spectrum) 和荧光发射光谱(fluorescence emission

spectrum)。

1. 激发光谱
保持荧光发射波长不变(即固定发

射单色器),依次改变激发光波长(即
调节激发单色器),测定不同波长的激 发光激发下得到的荧光强度F(即激发光

波长扫描)。然后以激发光波长为横坐
标,以荧光强度F为纵坐标作图,就可得

到该荧光物质的激发光谱。

激发光谱上荧光强度最大值所对
应的波长就是最大激发波长,是激发 荧光最灵敏的波长。物质的激发光谱

与它的吸收光谱相似,所不同的是纵
坐标。

2. 荧光光谱
荧光光谱,又称发射光谱。保持激发

光波长不变(即固定激发单色器),依次
改变荧光发射波长,测定样品在不同波长 处发射的荧光强度F。以发射波长为横坐 标,以荧光强度F为纵坐标作图,得到荧 光发射光谱。荧光发射光谱上荧光强度最

大值所对应的波长就是最大发射波长。

(三)荧光光谱与激发光谱的关系 1. 荧光光谱形状与激发光波长无关 由
于荧光是分子从第一电子激发态的最 低振动能级返回到基态的各振动能级

时释放的光辐射,与分子被激发至哪
一个电子激发态无关。

2. 荧光光谱比激发光谱波长为长
由于分子吸收激发光被激发至较

高激发态后,先经无辐射跃迁(振动
驰豫、内转换)损失掉一部分能量, 到达第一电子激发态的最低振动能级,

再由此发出荧光。因此,荧光发射能
量比激发光能量低,荧光光谱波长比

激发光波长长。

3.镜像对称
对于高度对称的有机分子,其荧光光

谱与吸收光谱呈镜像对称关系。

解释1:能级结构相似性

荧光为第一电子激发单重态的最
低振动能级跃迁到基态的各个振动能

级而形成,即其形状与基态振动能级
分布有关。 激发光谱是由基态最低振动能级 跃迁到第一电子激发单重态的各个振 动能级而形成,即其形状与第一电子

S1

激发单重态的振动能级分布有关。
由于激发态和基态的振动能级分 布具有相似性,因而呈镜像对称。

S0

三、影响荧光产生及荧光强度的因素 (一)物质产生荧光的必要条件
一种物质能否发荧光以及荧光强度

的高低,与它的分子结构及所处的环境
密切相关。能够发射荧光的物质都应同 时具备两个条件:

1. 物质分子必须有强的紫外吸收(有
?~?*跃迁); 2. 物质具有较高的荧光效率

(fluorescence efficiency)。荧光效率
也称荧光量子产率,用?f 表示。

kF 发射的荧光量子数 Φf ? ? 吸收的光量子数 k F ? kVR ? k IC ? k ISC ? k EC ? k P

可见,凡是使 kF 增加,使其它去活化

常数降低的因素均可增加荧光量子产
率。通常,kF 由分子结构决定(内

因),而其它参数则由化学环境和结
构共同决定。

(二)影响荧光及其强度的因素。
跃迁类型:如上所述,物质必须在紫 外可见区有强吸收和高荧光效率才能

产生荧光。具有 ? —?* 跃迁的分子才
有强吸收。?—?* 跃迁的?大。

共轭效应:大多数能产生荧光的物
质都含有芳香环或杂环,具有共轭

的?~?* 跃迁。其共轭程度愈大,
荧光效率也愈大,且最大激发和发 射波长都向长波长方向移动,如苯、

萘、蒽三种物质。







维生素A

? ex
?em
?
?em

205nm
? ex

286nm 321nm
0.29

356nm 404nm
0.36

327nm 510nm

278nm
0.11

刚性平面结构:当荧光分子共轭程度
荧光效率越大。
-

相同时,分子的刚性和共平面性越大,
-

O

O C COO
-

O

O C COO
-

O

荧光物质(荧光素)

菲荧光物质(酚酞)

CH2 芴(?????)

联苯(?????)

有些物质本身不发荧光或荧光较
弱,但和金属离子形成配合物后,如

果刚性和共平面性增加,就可以发荧
光或增强荧光。如8-羟基喹啉是弱荧 光物质,与Mg2+、Al3+ 等金属离子形

成的配合物的荧光增强,利用这一特
点可以间接测定金属离子。

N OH 8-羟基喹啉
O Al/3 8-羟基喹啉-铝 N

取代基团
荧光分子上的各种取代基对分子的荧光光 谱和荧光强度都有很大影响。给电子取代基 如—NH2、—OH、—OCH3、—CN、— NHR、—NR2等,能增加分子的π电子共轭程度, 使荧光效率提高。而-COOH、—NO2、—

C=O、—F、—Cl等吸电子取代基,可减弱分子
π电子共轭性,使荧光减弱甚至熄灭。还有一类

取代基则对荧光的影响不明显,如—R、—

温度 温度对被测溶液的荧光强度有明 显的影响。当温度升高时,介质粘度

减小,分子运动加快,分子间碰撞几
率增加,从而使分子无辐射跃迁增加, 荧光效率降低。故降低温度有利于提

高荧光效率及荧光强度。

由于荧光仪器光源的光强度大、温度较高,容 易引起溶液温度升高,加之分析过程中室温可 能发生变化,从而导致荧光强度改变。另外, 有些荧光物质的溶液在激发光较长时间的照射 试样不应长时间受光照射,只在测定荧光强度 时才打开光闸,其余时间应关闭。在较高档的

下,还会发生光分解,使荧光强度下降。因此,

荧光分光光度计中,样品室四周设有冷却水套
或配有恒温装置,以使溶液的温度在测定过程

中保持恒定。

溶剂:同一种荧光物质在不同的溶
剂中,其荧光光谱的位置和荧光强

度可能会有一定的差别,尤其是那
些分子中含有极性取代基的荧光物 质,它们的荧光光谱易受溶剂的影

响。

溶剂的影响可以分为一般溶剂效应
和特殊溶剂效应。一般溶剂效应是

指溶剂极性的影响。通常情况下,
随着溶剂极性增大,?~?* 跃迁所 需的能量差? E 减小,跃迁几率增加,

从而使荧光波长长移,荧光强度增
大。

特殊溶剂效应是指溶剂与荧光物质形成 化合物,或溶剂使荧光物质的电离状态

改变,使荧光峰的波长和荧光强度都发
生较大变化。如在萘胺的乙醇溶液中加

入盐酸,随着溶液中盐酸浓度的增加,
萘胺的—NH2基逐渐被—NH3Cl基所代替,

而—NH3Cl基对萘环特征频率的影响小
于—NH2 ,因此溶液的荧光光谱趋近于

萘的荧光光谱。

pH值:溶液的酸度(pH值)对荧光
物质的影响可以分两个方面:

1.若荧光物质本身是弱酸或弱碱时,

溶液pH值改变,物质分子和其离子
间的平衡也随之发生变化,而不同

形体具有其各自特定的荧光光谱和
荧光效率。例如苯胺

+ NH3

OHH
+

NH2 pH7~12

OHH
+

NH pH>13

-

pH<2 无荧光(离子形式)

蓝色荧光(分子形式)

无荧光(离子形式)

2. 对于金属离子与有机试剂生成的荧光
配合物,溶液pH值的改变会影响配合 物的组成,从而影响它们的荧光性质。

例如Ga3+ 离子与邻-二羟基偶氮苯,在
pH3~4的溶液中形成1:1配合物,能产

生荧光。而在pH6~7的溶液中,则形
成1?2的配合物,不产生荧光。

总之,溶液pH值对荧光物质的荧光
光谱、荧光效率及荧光强度均有影响。 需通过条件实验找出pH与荧光强度的

关系,确定最适宜的pH范围,以提高分
析的灵敏度和准确度。

荧光熄灭
由于荧光物质分子间或与其它物质相互 作用,引起荧光强度显著下降的现象叫

做荧光熄灭(quenching)或猝灭。引
起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂,如

卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基
化合物、重氮化合物和羧基化合物等。

造成荧光熄灭的原因有多种:
(1)激发态荧光分子和熄灭剂分子碰

撞,将能量转移到熄灭剂而使荧光熄灭;

(2)荧光分子与熄灭剂分子作用生成
了本身不发光的配合物;(3)荧光物

质分子中引入重原子后,易发生系间窜
越而转变为三重态;

(4)当荧光物质浓度较大时,激发态
分子和基态分子发生碰撞,产生荧光自 熄灭现象。溶液浓度越高,自熄灭现象

越严重;(5)溶液中溶解的氧分子能
引起几乎所有的荧光物质产生不同程度

的荧光熄灭。

荧光熄灭是荧光分析的不利因素。但是如果一
个荧光物质在加入某种熄灭剂后,荧光强度的

减小和熄灭剂的浓度呈线性关系,则可以利用
这一性质建立熄灭剂的荧光分析法,称为荧光

熄灭法。荧光熄灭法比直接荧光法更灵敏、更
有选择性。例如铝-桑色素配合物的荧光强度

因微量氟离子的存在而引起荧光熄灭,利用这
种性质可测定样品中微量氟离子的含量,这时

溶液的荧光强度和氟离子浓度成反比。

散射光(scattering light)
当一束光照射在被测溶液上,其中一部 分光被吸收后发出荧光,一部分光透过 溶液,还有一小部分光则由于光子与溶 剂分子的相互碰撞,使光子的运动方向

发生改变而向不同方向散射,称为散射
光。

1. 瑞利(Reyleigh)散射光
光子和物质分子发生弹性碰撞,不发生能

量的交换,只是光子运动方向发生改变,
其波长和激发光相同,这种散射光称为瑞

利散射光。它的强度与波长的四次方成反
比,即波长越短,瑞利散射光越强。但因

瑞利散射光波长与激发光波长相同,只要
选择适当的荧光测定波长或选用滤光片即

可消除其影响。

2. 拉曼(Raman)散射光
光子和溶剂分子发生非弹性碰撞,在运动 方向发生改变的同时,光子与溶剂分子还 发生能量的交换,使光子能量减小或者增 加,光的波长增长或变短,这两种散射光 均称为拉曼(散射)光。其中波长较长的 拉曼光因其波长与物质的荧光波长相接近, 故对测定的干扰较大。

由于拉曼光波长随激发光波长的改变而
改变, 而荧光物质的荧光波长与激发光 波长无关, 故通过选择适当的激发光波 长,就可以将二者区分开。

320nm

448nm
激发320nm 硫酸奎宁

350nm

448nm
激发350nm 硫酸奎宁

320nm
散射光谱

350nm
散射光谱

360nm

400nm

第二节 定性定量分析
一、荧光强度与溶液浓度的关系

分光光度法是测定物质对光的吸收
程度;荧光分析法是测定物质吸收了一 定频率的光之后,物质本身所发射的荧 光强度。当溶液中的荧光物质被入射光 激发后,可以在各个方向观察到荧光, 由于激发光一部分可透过溶液,所以在 透射光方向观察荧光是不适宜的,一般 是在与透射光垂直的方向观察荧光。

测定荧光强度时,要选择两个不同
的波长:一个是物质吸收的光,即激发 光的波长;另一个是被激发物质发射的 光,即荧光的波长。 溶液的荧光强度与该溶液对光的吸

收程度以及溶液中荧光物质的荧光效率
有关。

根据Beer定律

I - abc ? 10 I0
所以

I ? I 010

- abc

I a ? I 0 - I ? I 0 (1 - 10

- abc

)

由于溶液的荧光强度与溶液对
光的吸收程度及荧光效率成正比, 即

F ? ΦI a
F ? K Φ I 0 (1 - 10 ? K Φ I 0 (1 - e
- abc

) )
- abc

-2.3abc

I a ? I 0 - I ? I 0 (1 - 10

)

e

- 2.3abc

(-2.3abc) ? 1 ? (-2.3abc) ? ?? 2!
2

F ? KΦ I 0 (1 - e

-2.3abc

)
2

(-2.3abc) F ? KΦ I 0 {1 - [1 ? (-2.3abc) ? ? ?]} 2! 2 (-2.3abc) F ? KΦ I 0 [-2.3abc ? ? ?] 2!

当abc≤0.05(即溶液很稀)时,
(-2.3abc) F ? KΦ I 0 [-2.3abc ? ? ?] 2!
2

F ? -2.3KΦ I 0 abc

对于一定的荧光物质,当测定条件

固定时,
F ? K 'c

即对一定的荧光物质的稀溶液
(abc≤0.05),在一定的温度下,当 激发光的波长、强度和液层厚度都固

定后,其荧光强度与该溶液的浓度成
正比。这是荧光分析定量的基础。

二、定性分析
荧光物质的特征光谱包括激发光 谱和荧光光谱,因此用它鉴定物质比

吸收光谱可靠。

三、定量分析
1. 标准曲线法

F

Fx
cx

c

2. 直接比较法 如果荧光物质的标准曲线过零
点,且线性良好,可用直接比较法 测定。
Fs - F0 ? Kc s Fx - F0 ? Kc x
Fs - F0 cs ? Fx - F0 c x Fs - F0 cx ? ? cs Fx - F0

第三节 仪器
一、仪器的构造及原理

仪器类型很多,基本结构相似,一般包括 五部分:激发光源、单色器、样品池、检

测器和记录显示部分。
1. 光源 能发射 紫外到可见区 波长的光、强 度大、稳定。 常用的有溴钨 灯、高压汞灯、 氙灯。

2. 单色器

两个单色器

3. 样品池 通常用石英制成 4. 检测器 光电

倍增管

二、仪器类型
1. 光电荧光计 用滤光片作单色器

(激发滤光片和荧光滤光片),溴钨
灯或高压汞灯作光源,光电管为检测 器。

2. 荧光分光光度计 用氙灯作光源、
光栅作单色器,光电倍增管为检测器。

可连续扫描激发光谱和荧光光谱。

第五节 荧光分析法的应用

(一) 有机物的荧光分析
由于荧光分析的高灵敏度、高选择性,使它

在医学检验、卫生检验、药物分析、环境检测及
食品分析等方面有广泛的应用。

芳香族及具有芳香结构的物质,在紫外光照
射下能产生荧光。因此,荧光分析法可直接用于

这类有机物的测定,如:多环胺类、萘酚类、嘌
呤类、吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂环

结构的氨基酸及蛋白质等,约有200多种。

食品中维生素含量的测定是食品分析的 常规项目,几乎所有种类的维生素都可

以用荧光法进行分析。多环芳烃普遍存
在于大气、水、土壤、动植物及加工食

品中,大家所熟知的苯并[a]芘是致癌
活性最强的一种,通过萃取或色谱分离 后,可采用荧光法进行测定。该方法准

确可靠,测定最低浓度可达 0.1 ?g/ml。

应用实例:食品中VB2(核黄素)的测定 其测 定原理是VB2在440~500 nm波长的光照射下, 发出黄绿色荧光,在波长525 nm下测定其荧光 强度,在稀溶液中其荧光强度与VB2的浓度成 正比。为消除试液中共存荧光杂质的干扰,可 在测定过荧光强度的溶液中加入连二亚硫酸钠 (Na2S2O4),将VB2还原为无荧光的物质,然

后再测定试液中残余的荧光杂质的荧光强度,
两者之差即为食品中VB2的荧光强度。该方法

被作为食品分析的国家标准分析方法。

(二) 无机元素的荧光分析
能产生荧光的无机物较少,对其进行分 析通常是将待测元素与荧光试剂反应,生成

具有荧光特性的配合物,进行间接测定。目
前利用该法可进行荧光分析的无机元素已近 70种。常见的有铬、铝、铍、硒、锗、镉等 及部分稀土元素。

例如Al3+与桑色素或8-羟基喹啉的配合物就可产 生荧光,从而用于铝的测定。有些元素虽不能与

有机试剂形成能产生荧光的配合物,但它可使荧
光物质的荧光熄灭。例如F-离子在一定pH的溶液

中,能从Al3+与桑色素的荧光配合物中夺取Al3+,
从而导致荧光配合物的荧光强度降低,其荧光强

度与F-离子的浓度成反比,利用这一性质可间接
测定样品中的氟离子含量。

应用实例:硒的测定 其测定原理是将
样品用HNO3和HClO4湿式分解,硒被

氧化成H2SeO4,再加HCl加热,还原为
H2SeO3。在酸性溶液中Se(Ⅳ)与2,3-二 氨基萘发生特异反应,生成能发荧光的

4,5-苯并苤硒脑,用环己烷萃取后进行 是测定硒的国家标准分析方法。

荧光测定。此方法灵敏度高,选择性好,

(三)在生命科学中的应用
荧光分析法常用于临床测定生物样品中某些成 分的含量,由于这些物质荧光量子产率较低, 所以常用各种荧光探针来间接测定。荧光探针 还被广泛应用于研究蛋白质大分子构象及构象 动力学信息。此外,荧光光谱可用以研究 DNA 的烷基化损伤与修复;荧光偏振、荧光猝灭及 多维荧光检测技术可用来研究蛋白质与配体之 间的相互作用及动力学;时间分辨荧光免疫技 术越来越多地用于许多蛋白质、激素、病毒抗 原乃至 DNA杂交体等的分析。总之,荧光分析 法在生命科学领域中的应用前景十分广阔。


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