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组织和细胞总RNA提取


提取( 组织和细胞总 RNA 提取(TRIzol 法)
TRIzol RNA 提取试剂盒是由 GIBCO BRL 公司推出专供提取 RNA 的产品,其操作方便、快 捷。 Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释 放出的核酸酶。 TRIzol 的主要成分是酚。主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释放。酚

虽可有效的变性蛋白质,但是它不能完全抑制 RNA 酶活性,因此 TRIzol 中还加入了 8-羟基 喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源 RNase。 x0.1%的 8-羟基喹啉的,与氯仿联合使用可增强对 RNase 的抑制 x 异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质,并使蛋白质二级结构 消失,细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离。 xβ-巯基乙醇主要破坏 RNase 蛋白质中的二硫键。 (一)试剂准备 1 . TRIzol 试剂。 2 .氯仿 3 .异丙醇 4 . 75% 乙醇( DEPC H2O 配制) 5 . DEPC H2O (二)操作步骤 1 . 样品处理: (1)培养细胞:收获细胞 1-5×10 7 ,移入 1.5ml 离心管中,加入 1ml Trizol ,混匀,室 温静置 5min 。 (2)组织:取 50-100mg 组织(新鲜或 -70 ℃ 及液氮中保存的组织均可)置 1.5ml 离心 管中,加入 1ml Trizol 充分匀浆,室温静置5 min 。 2 .加入 0.2ml 氯仿,振荡 15s ,静置 2min 。 3 . 4 ℃ 离心, 12000g × 15min ,取上清。 4 .加入 0.5ml 异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置 10min 。 5 . 4 ℃ 离心, 12000g × 10min ,弃上清。 6 .加入 1ml 75% 乙醇,轻轻洗涤沉淀。 4 ℃ , 7500g × 5min ,弃上清。

7. 晾干,加入适量的 DEPC H 2 O 溶解( 65 ℃ 促溶 10-15min )。 (三)注意事项 1 . 样品量和 Trizol 的加入量一定要按步骤 1 ) ( 的比例, 不能随意增加样品量或减少 Trizol 量,否则会使内源性 RNase 的抑制不完全,导致 RNA 降解。 2 .实验过程必须严格防止 RNsae 的污染。 二、总 RNA 定量 RNA 定量方法与 DNA 定量相似。 RNA 在 260nm 波长处有最大的吸收峰。因此,可以 用 260nm 波长分光测定 RNA 浓度, OD 值为 1 相当于大约 40 ? g/ml 的单链 RNA 。如 用 1cm 光径,用 ddH 2 O 稀释 DNA 样品 n 倍并以 ddH 2 O 为空白对照,根据此时读出 的 OD 260 值即可计算出样品稀释前的浓度: RNA ( mg/ml ) =40 × OD 260 读数×稀释倍数 (n)/1000 RNA 纯品的 OD 260 /OD 280 的比值为 2.0 ,故根据 OD 260 /OD 280 的比值可以估计 RNA 的纯度。若比值较低,说明有残余蛋白质存在;比值太高,则提示 RNA 有降解。 RNA 抽提指南 抽提指南(TRIZOL)
警告: 有毒物接触皮肤或者不慎吞服。会导致灼伤。一旦接触皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗。若感不 适,看医生并寻求苯酚和其他成分(JTSRN 80100437-5000p)的正确治疗方案。) TRIZOL 在室温下能稳定保存 12 个月。尽管如此,为达到最佳效果,我们建议保存在 2—8°C 的环境下。 一般描述: 一般描述: TRIZOL 试剂是直接从细胞或组织中提取总 RNA 的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持 RNA 的完整性。加入氯仿 后离心,样品分成水样层和有机层。RNA 存在于水样层中。收集上面的的水样层后,RNA 可以通过异丙醇沉淀来 还原。在除去水样层后,样品中的 DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的 DNA,在 有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化 DNA 对于样品间标准化 RNA 的产量十分有用。 论是人、 动物、 植物还是细菌组织, 该方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g) 和细胞(>107)均有较好的分离效果。TRIZOL 试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在 一小时内完成。 TRIZOL 抽提的总 RNA 能够避免 DNA 和蛋白的污染。 故而能够作 RNA 印迹分析、 斑点杂交、 poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA 酶保护分析和分子克隆。如果是用于 PCR,当两条引物位于单一外显子内时,建议用级联 扩大的 DNase I(Cat. No. 18068)来处理抽提的总 RNA。 RIZOL 试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种 RNA 的析出。例如,从大鼠肝脏抽提的 RNA 琼脂糖凝胶电 泳并用溴化乙啶染色,可见许多介于 7 kb 和 15 kb 之间不连续的高分子量条带,(mRNA 和 hnRNA 成分)两条 优势核糖体 RNA 条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S),低分子量 RNA 介于 0.1 和 0.3 kb 之间 (tRNA, 5S)。当 抽提的 RNA 用 TE 稀释时其 A260/A280 比值≥1.8 酶污染: 预防 RNA 酶污染 提 RNA 过程中任一环节的不正确操作都可能导致 RNA 酶的污染。由于 RNA 酶的活性很难完全抑制,预防其污 染是十分必要的。 在实际的操作中应遵循以下指南: * 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌,可能污染 RNA 的抽提并成为 RNA 酶的来源。培养良好的微

生物实验操作习惯预防微生物污染。 * 使用灭菌的,一次性的塑料器皿和自动吸管抽提 RNA,避免使用公共仪器所导致的 RNA 酶交叉污染。例如, 使用 RNA 探针的实验室可能用 RNA 酶 A 或 T1 来降低滤纸上的背景,因而某些非一次性的物品(如自动吸管) 可能富含 RNA 酶。 * 在 TRIZOL 中,RNA 是隔离在 RNA 酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无 RNA 酶的非一次性的玻璃器 皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在 150°C 的烘箱中烘烤 4 小时。塑料器皿可以在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 分钟,用 水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。 其他注意事项 * 当 TRIZOL 用量少于 2-ml 时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。 * 当 TRIZOL 用量较大时,可以使用玻璃试管(Corex)或聚丙材质试管,事先检验以确保该试管可以耐受加入 TRIZOL 和氯仿后 12,000×g 的离心力。不可使用有裂缝或者破损的试管。 * 离心前小心平衡试管。 * 离心前玻璃管口必须盖上铝箔并用石蜡膜封口,聚丙烯管必须盖紧。 RNA 抽提指南 注意:用 TRIZOL 抽提 RNA 时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸 入。如无例外,所有的操作应该在 15 -30°C 的条件下完成,试剂亦在 15 -30°C 的条件下。 实验所需但试剂未提供的物品: * 氯仿 *异丙醇 * 75%乙醇(用 DEPC 处理过的水配制) *无 RNA 酶的水或 0.5% SDS 溶液[配无 RNA 酶的水,将水加入无 RNA 酶的玻璃瓶中,加入 DEPC 至 0.01% (v/v)。 放置过夜并高压灭菌。SDS 溶液必须用 DEPC 处理过并经高压灭菌的水配制。] 1.匀浆化作用(见注意事项 1-3) a. 组织 用 glass-Teflon?或强力匀浆器(Polytron, 或 Tekmar's TISSUMIZER? 或 equivalent)搅匀组织样品, 每 50—100 mg 组织加 1ml 的 TRIZOL。匀浆化时组织样品容积不能超过 TRIZOL 容积的 10%。 b.单层生长的细胞 直接往直径 3.5 cm 的培养板中加入 1ml 的 TRIZOL 溶解细胞, 通过移液管分次移出细胞裂解 物。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的 TRIZOL 量(每 10 cm2 加 1 ml)。当 TRIZOL 量不 足时可导致抽提的 RNA 中污染有 DNA。 c.悬浮生长的细胞 通过离心来沉淀细胞。 TRIZOL 试剂中用移液管反复吹打来裂解细胞。 5—10×106 的动 在 每 物细胞, 植物或酵母菌细胞或每 1×107 细菌加 1ml 的 TRIZOL。 在加入 TRIZOL 前应避免洗涤细胞因为那样会增 加 mRNA 降解的可能性。破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀浆器。 可选方案: 当样品富含蛋白质,脂肪,多糖或是细胞外物质例如肌肉,脂肪组织和植物的块茎部分时可能需要一额外的分 离步骤。匀浆化后在 2—8°C 的条件下以 12,000×g 的离心力离心 10 分钟,移除匀浆中不溶解的物质,余下的 沉淀中包含有细胞外膜,多糖,以及高分子量 DNA,而上层的超浮游物含有 RNA。在来自于脂肪组织的样品中, 大量的脂肪漂在最上层因而应该除掉。在每一个个案中,将清亮的匀浆溶液转移到一干净的试管中加入氯仿并 继续进行下述的分离步骤。 2. 分离阶段 将匀浆样品在 15—30°C 条件下孵育 5 分钟以使核蛋白体完全分解。 1 ml TRIZOL 加 0.2 ml 氯仿。 每 盖紧样品管盖, 用手用力摇晃试管 15 秒并将其在 30°C 下孵育 2—3 分钟。 2—8°C 下以不超过 12,000×g 的离 在 心力高速冷冻离心 15 分钟。离心后混合物分成三层:下层红色的苯酚-氯仿层,中间层,上层无色的水样层。 RNA 无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加 TRIZOL 容量的 60%。 3. RNA 的沉淀 将水样层转移到一干净的试管中,如果希望分离 DNA 和蛋白,有机层同样要予以保留。通过 将水样层和异丙醇混合来沉淀 RNA。最初均化时的每 1 ml TRIZOL 对应 0.5 ml 异丙醇。将混合的样品在 15—30°C 条件下孵育 10 分钟并在 2—8°C 下以不超过 12,000×g 的离心力高速冷冻离心 10 分钟。RNA 沉淀在 离心前通常不可见,形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。

4 .RNA 的洗脱 移去上层悬液。用 75%的乙醇洗涤 RNA 沉淀一次,每 1 ml 的 TRIZOL 至少加 1 ml 的 75%乙 醇。旋涡振荡混合样品并在 2—8°C 下以不超过 7,500×g 的离心力高速冷冻离心 5 分钟。 5. RNA 的再溶解 在操作的最后,简单干燥 RNA 沉淀(空气干燥或真空干燥 5—10 分钟)不要在真空管里离心 干燥 RNA。尤为重要的是,不能让 RNA 沉淀完全干燥那样会极大地降低它的可溶性。部分溶解的 RNA 样品 其 A260/280 比值< 1.6。用移液管尖分几次移取无 RNA 酶的水或 0.5% SDS 溶液来溶解 RNA,并在 55—60°C 下孵育 10 分钟(当 RNA 以后要用于酶切反应时,避免使用 SDS。 )RNA 还能被 100%甲酰胺(除去离子)再 溶解并保存在–70°C。 RNA 抽提注意事项: 抽提注意事项: 1.从少量的组织(1—10 mg)或细胞(102—104)中分离 RNA 样品:往组织或细胞中加入 800 ?l TRIZOL。待样品 裂解后,加入氯仿并进行步骤 2 中的抽提操作。在用异丙醇沉淀 RNA 之前,加入 5—10?g 无 RNA 酶的脂质体 (Cat.No 10814)作为水样层的载体。为降低其黏度在加入氯仿前用 26 号注射器抽吸两次以切断基因组 DNA。脂 质体会留在水样层中并和 RNA 共析出。在浓缩到 4 mg/ml 之前它不会抑制第一丝状体的合成也不会抑制 PCR。 2.在匀化后和加入氯仿之前,样品可以在–60—–70°C 保存至少一个月。RNA 沉淀(步骤 4,RNA 洗脱)溶于 75%的乙醇在 2—8°C 至少可以保存一周,在–5—–20°C 下至少可保存一年。 3.台式离心机最大能达到 2,600×g 的离心力, 如果将离心时间延长到 30-60 分钟可以满足步骤 2 和步骤 3 中的操 作。 RNA 抽提 每 1 mg 组织或 1×106 培养细胞预期的 RNA 产量 1.肝和脾,6—10?g 2.肾,3—4?g 3.骨骼肌和脑组织,1—1.5?g 4.胎盘,1-4?g 5.上皮细胞(1×106 cultured cells),8—15?g 6.纤维母细胞(1×106 cultured cells),5—7?g ?抽提得率低 抽提得率低 1.样品均化或裂解不完全。 2.终 RNA 不完全再溶解。 ?A260/A280 比率 <1.65 1.在分光光度计测量前用水而不是用 TE 缓冲液稀释 RNA 样品。低离子强度和低 pH 溶液会增加 280 nm 处的 光吸收值。 2.样品匀浆化时所加的 TRIZOL 量太少。 3.匀浆化后样品没有在室温下放置 5 分钟。 4.分离的水样层中污染有苯酚层。 5.终 RNA 没有完全溶解。 ?RNA 降解 1.从动物体取下的组织没有立即进行抽提或冰冻保存。 2.用于抽提的样品,或抽提的 RNA 样品保存于–5—–20°C,而不是存放于–60—–70°C。 3.细胞经胰酶消化而分散。 4.水溶液或试管污染有 RNA 酶。 5.用于琼脂糖凝胶电泳的福尔马林 pH 低于 3.5。 ?DNA 污染 1.样品匀浆化时所加的 TRIZOL 量太少。 2.用于抽提的样品包含有机溶媒(例如,乙醇,DMSO) ,强缓冲液,或碱性溶液。

?蛋白多糖和多糖污染 下述的对 RNA 沉淀方法(步骤 3)的改进能从抽提的 RNA 中移去复合污染。以匀浆化时每 1 ml TRIZOL 为例, 在水样层中加入 0.25 ml 异丙醇后再加入 0.25 ml 的高盐溶液(0.8 M 柠檬酸钠和 1.2 M NaCl)。 将终溶液混匀, 离 心并继续进行前述的抽提操作。改进后的沉淀法能有效地析出 RNA 而多糖和蛋白多糖仍以可溶的的形式留在 溶液中。 对于含有大量多糖的植物, 要抽提其 RNA 将改进后的沉淀法和在最初匀浆化时多加一次离心(RNA 抽 提指南,可选方案)合并使用是十分必要的。

提取组织 RNA

11. 离心后拿回超净台,打开 EP 管(动作 一定要轻),取上清(用小枪头),吸取

1. 取冰、从-70℃冰箱取出样本。 2. 倒入适量的液氮到不锈钢皿中,分一些 液氮到研钵内。 3. 将样本加入研钵内,使其成干燥的固 态。 4. 吸取 1ml Trizol 于 EP 管中, 做好标记。

800ul 上清到 EP 管中,做好标记。(操 作过程中,尤其是打开和关闭 EP 管盖 子,若是不同的样品,要勤换手套,防 止污染) 12. 加入 200ul 氯仿(用于溶解蛋白), 加入 后氯仿沉于下层。 13. 涡旋振荡混匀,冰浴 3-5min。 14. 4℃离心 12000rpm/15min。 15. 配置酸性酚仿,按照酸性酚(有助于 RNA 溶解):氯仿(有助于进一步去除蛋 白)5: 的比例配置, 1 用枪头吹打混匀。 (1ml 酸性酚+200ul 氯仿)具体配置的量 以离心的情况而定,一般离心后取 400ul 上清,等比加入酸性酚仿。 16. 离心后拿回超净台,打开 EP 管(动作 一定要轻),取上清(用小枪头,一定不 能吸到沉淀),吸取 400ul 上清到 EP 管 中,等比加入酸性酚仿。

5. 将取样匙泡在不锈钢皿内预冷。 6. 研磨样品,轻轻研磨,小心不要溅出。 并且随时注意样品的状态,加入液氮, 防止样品融化,加液氮时也要小心,防 止溅出,造成样品损失。研磨成粉状后 分装于 EP 管中。 7. 放在手套内, 置于冰中, 在摇床上振荡 10min, 并将离心机调至 4℃, 贴上标签。 8. 将样品拿入超净台,轻轻打开 EP 管, 用 1ml 枪吹打混匀。 9. 4℃离心 12000rpm/15min。

17. 涡旋震荡混匀(使酚与 RNA 结合, 氯仿 10. 取氯仿、异丙醇。 与蛋白结合,进一步去除蛋白)。 18. 4℃离心 12000rpm/10min。

19. 轻轻取出, 轻轻打开 EP 管(动作一定要 慢),将枪调到 100ul,吸取上清(约 200-300ul),加入 EP 管(相同物质可以 将两管并为一管)。 20. 按量再配置酸性酚仿, 等比加入 EP 管, 涡旋震荡混匀。 21. 4℃离心 12000rpm/10min。 22. 轻轻取出, 轻轻打开 EP 管(动作一定要 慢),将枪调到 100ul,吸取上清(约 200-250ul),加入 EP 管。

23.

加入异丙醇 300ul(大概按照与上清 1∶1 的比例,再多加一点)。

24. 晃动混匀,冰浴 5min。 25. 4℃离心 12000rpm/10min,弃上清。 26. 加入 1ml 75%乙醇,洗脱异丙醇及其它 杂质(这时候要注意不要将 EP 管上的标 记弄掉),晃动 EP 管。 27. 4℃离心 12000rpm/5min, 弃上清。 (到 的时候要小心,容易将 RNA 倒出) 28. 加入 1ml 75%乙醇,晃动 EP 管

29. 4℃离心 12000rpm/5min,弃上清。(到的时候要小心,容易将 RNA 倒出) 30. 倒置,室温干燥。若效果较好,RNA 应成透明状,肉眼不易分辩。 31. 加入 50ul DW 溶解。


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