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人教版教学课件生物选修1之蛋白质的提取和分离


血红蛋白含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁
血红素基团,此基团可携带一分子氧或一分子二 氧化碳,血红蛋白因含有血红素而呈红色。

专题5 DNA和蛋白质技术
课题3 血红蛋白的提取和分离

一、基础知识: 学生活动1:
1 、分离生物大分子的基本思路是什么? 2 、不同蛋白质的特性在哪些方面存在差异? 3

、本课题我们将利用血红蛋白与杂质蛋白哪 方面的差异进行提纯? 4 、为什么不用鸡的血红细胞而用人的血红细 胞作为实验材料? 5 、用什么方法分离相对分子质量不同的蛋白 质 ?

一、基础知识--蛋白质提取和分离原理
蛋白质提取与分离的依据--蛋白质的物理化学 性质:

形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、 亲和力等千差万别。
提取 分离 方法 凝胶色谱法 凝胶电泳法

(一)凝胶色谱法

(1)原理: 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙,路程短,流动快; 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部,路程长,流动慢。 (2)材料

多孔性的多糖类化合物,如葡聚糖、琼脂糖。

(一)凝胶色谱法
(3)分离过程
混合物 上 柱 洗 脱 大分子流动快 小分子流动慢

收 集 大分子

收 集 小分子

洗脱:从色谱柱上端不断注入缓冲液, 促使蛋白质分子的差速流动。

(一)凝胶色谱法



凝胶色谱法(分配色谱法):

学生活动2:
1、什么是凝胶? 2、什么是凝胶色谱法? 3、凝胶色谱法的原理是什么? 4、请用自己的话总结出凝胶色谱法分离 相对分子质量不同蛋白质的具体过程。

(二)、缓冲溶液
学生活动3: 1 、什么是缓冲液? 2、 缓冲液的作用是什么?

3、 缓冲液是如何配制的?你所学过的人体 血液的缓冲物质有哪些?
4、 本实验加的是什么缓冲液?为何要 加缓冲液?

(二)、缓冲溶液
缓冲溶液--洗脱剂 组成:
由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。 如H2CO3/NaHCO3,醋酸/醋酸钠,NaH2PO4/Na2HPO4等

配制: 作用:
抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。

调节缓冲剂的比例,可配制不同pH的缓冲液。

(三)、电泳
学生活动4: 1 、什么是电泳? 2、 影响电泳迁移速度的因素有哪些? 4、电泳分离各种分子的原理是什么? 5 、请描述电泳的过程?

3、 如何消除电荷对电泳迁移速度的影响?

(三)电泳
1.电泳的概念 指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程. 2.凝胶电泳法: (1)原理: 不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同, 在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同, 导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不 同。 影响蛋白质分子运动速度的因素

影响蛋白质分子运动速度的因素
决定 运动方 向 电荷性 质 电荷量 分子形 状 分子大 小 形成 库仑力 形成 阻力 决定 运动速 率

√ √ √




√ √

(三)电泳
(2)分离方法:
琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

(3)分离过程:
在一定pH下,使蛋白质基团带上正电或负电;
加入带负电荷多的SDS,形成“蛋白质-SDS复 合物”,使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

电泳检测结果

琼脂糖凝胶电泳

二、实验操作
蛋白质的提取和分离一般分为四步: (1)样品处理:包括洗涤红细胞;血 红蛋白释放;离心分离等操作收集到 的血红蛋白溶液。 (2)粗分离:透析除去分子较小的杂 质。 (3)纯化:通过凝胶色谱法将分子量 较大的杂质蛋白质除去。 (4)纯度鉴定:通过聚丙烯酰胺凝胶 电泳鉴定。

(一)样品处理
? 1、红细胞的洗涤: ? 目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血 液凝固;离心将血液分层,用胶头吸管吸出 黄色血浆;用生理盐水洗涤。 ? 2、血红蛋白的释放: ? 在蒸馏水和甲苯作用下,红细胞破裂释放 ? 3、分离血红蛋白溶液: ? 离心分层;滤纸过滤去除脂溶性沉淀层;分 液漏斗分出红色透明液体。 ? 4、透析:装入透析袋并置于磷酸缓冲液中 (PH为7.0)透析。

二、实验操作
样品处理 粗 分 离 2.释放血红蛋白 血液组成成分 1.洗 涤 红 细 胞





3.分离血红蛋白
4.透析血红蛋白

纯度鉴定

血液组成成分
阅读思考: 血浆 血细胞 1. 血液由______和________两部分组成。 2. 血细胞中________细胞数量最多,红细胞的含 红细胞 量最高的有机化合物是_____________。 血红蛋白 2条β-肽链 2条α-肽链 3. 该化合物是由 _____________和____________ 构成的,其中每个亚基中都含有一个能与O2和 亚铁血红素 CO2结合的___________基团。 返回

1.洗 涤 红 细 胞 阅读思考:洗涤的目的是什么? 洗涤过程: 3g柠檬酸钠
吸出血浆 5倍体积生理盐水

血液 100mL

低速离心 2 min



浆 红细胞
搅拌10min

红细胞

重复洗涤3次,直至上清液没有黄色

采集得到鸡血

初次离心后的结果

3次洗涤后的结果

返回

2.释放血红蛋白 阅读思考:

1. 释放血红蛋白过程中,在洗涤好的红细胞加入了 哪些物质?
2. 为了加速释放过程,采取了什么措施? ①目的分析: 使红细胞大量吸水胀裂 ②蒸馏水的作用是______________________________。

③加入甲苯的作用是____________________________。 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 ④充分搅拌的目的是____________________________。

(2)血红蛋白的释放: 加蒸馏水到原血液体积,再加40 %体积的甲苯 ,置于磁力搅拌器上充分搅拌 10分钟(加速细胞破裂),细胞破裂释放出血 红蛋白。

磁力搅拌器

返回

3.分离血红蛋白
分离过程

红细胞 混合液
高速离心 10min
离心 管

脂类物质

滤纸
过滤
烧杯

(3)分离血红蛋白溶液:
①过程:将搅拌好混合液转移到离心管 内,以2000r/min的速度离心10 min。②试 管中溶液层次:第1层(最上层):甲苯层 (无色透明);第2层(中上层):脂溶性 物质沉淀层(白色薄层固体);第3层(中 下层):血红蛋白的水溶液层(红色透明 液体);第4层(最下层):杂质沉淀层 (暗红色)。③分离:用滤纸过滤,除去 脂溶性沉淀层,于分液漏斗中静置片刻后, 分出下层的红色透明液体。

试管中溶液层次

甲苯层(无色透明) 白色薄层固体 红色透明液体

杂质沉淀层(暗红色) 返回

4.透析血红蛋白

1mL

1mL

20mmol/L磷酸缓冲液

利用透析袋透析

透析过程

返回

纯化--凝胶色谱操作
1.凝胶色谱柱的制作: 2.凝胶色谱柱的装填: 3.样品的加入和洗脱 教材图5-19

(二)凝胶色谱操作

(1)凝胶色谱柱的制作: ①取长40厘米,内径1.6厘米的

玻璃管,两端需用砂纸磨平。②底塞的制作:打孔→挖出凹 穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网,再用100目尼龙纱包好, 插到玻璃管的一端。注意事项:底塞中插入的玻璃管的上部 不得超出橡皮塞的凹穴底面,否则难以铺实尼龙网,还会导 致液体残留,蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作:打孔→安 装玻璃管。④组装:将上述三者按相应位置组装成一个整体 ⑤安装其他附属结构。

装配好的凝胶柱

返回

2.凝胶色谱柱的装填:
材料:交联葡聚糖凝胶G-75;20mmol/L磷酸缓冲液 装填:
步骤 操作要求

① ② ③
④ ⑤

固定色谱柱
计算称量凝胶

色谱柱垂直固定在支架上 根据色谱柱体积计算凝胶用量
凝胶颗粒+蒸馏水→充分溶胀 凝胶颗粒+洗脱液→沸水浴 一次性缓慢倒入;轻轻敲打

配制悬浮液
装填悬浮液 洗涤平衡

立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h

(2)凝胶色谱柱的装填

①凝胶的选择:A、材料:交联葡聚糖凝胶(G-75)。B、 代表意义:“G”表示凝胶的交联程度,膨胀程度及分离范 围。75表示凝胶的得水值,即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 ②凝胶的前处理:配制凝胶悬浮液:计算并称取一定量的 凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后,配成凝胶悬浮 液。 ③凝胶色谱柱的装填方法:A、固定:将色谱柱装置固定在 支架上。B、装填:将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内 装填时轻轻敲动色谱柱,使凝胶填装均匀。注意:1、凝胶 装填时尽量紧密,以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填 凝胶柱时不得有气泡存在:因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白 质的洗脱次序,降低分离效果。

④洗涤平衡:装填完毕后, 立即用缓冲液洗脱瓶,在 50cm高的操作压下,用 300ml的20mmol/l的磷酸缓 冲液(pH为7.0)充分洗涤 平衡12小时。注意:1、洗 脱液面不要低于凝胶表面, 否则可能有气泡混入,影 响液体在柱内的流动与最 终生物大分子物质的分离 效果。2、不能发生洗脱液 流干,露出凝胶颗粒的现 象。

3.样品加入与洗脱

①调节缓冲液面:打开下端出口,使柱内缓冲液缓慢下 降到与凝胶面平齐,关闭出口。 ②滴加透析样品:吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端, 滴加样品时,吸管管口贴着管壁环绕移动加样,同时注意 不要破坏凝胶面。 ③样品渗入凝胶床:加样后打开下端出口,使样品渗入 凝胶床内,等样品完全进入凝胶层后,关闭下端出口。 ④洗脱:小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到 适当高度,连接缓冲液洗脱瓶,打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集:待红色的蛋白质接近色谱柱底端时,用试管收 集流出液,每5ml收集一试管,连续收集。(在分离过程中 如果红色区带均匀一致的移动,说明色谱柱制作成功) ⑥注意:正确的加样操作:1、不要触及并破坏凝胶面。 2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。

3.样品的加入和洗脱

3.样品加入与洗脱

注意:正确的加样操作是:1、不要触及并破坏凝胶面。 2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。

收集得到的纯化后的血红蛋白

注意事项
1. 2. 3. 红细胞的洗涤:

洗涤次数不能过少;低速、短时离心。
凝胶的预处理: 色谱柱的装填:

为什么?

沸水浴法时间短,还能除去微生物和气泡
装填尽量紧密,降低颗粒间隙;无气泡;洗脱 液不能断流。 4. 色谱柱成功标志:红色区带均匀一致地移动。

三、实验结果分析与评价
1、你是否完成了对血液样品的处理?你能 描述处理后的样品发生了哪些变化吗? 观察你处理的血液样品离心后是否分层(见 教科书图5-18),如果分层不明显,可能是洗 涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外, 离心速度过高和时间过长,会使白细胞和淋巴 细胞一同沉淀,也得不到纯净的红细胞,影响 后续血红蛋白的提取纯度。

三、实验结果分析与评价

2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生?你 的色谱柱装填得成功吗?你是如何判断的? 由于凝胶是一种半透明的介质,因此可以在 凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯,检查凝 胶是否装填得均匀。此外,还可以加入大分子的 有色物质,例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖, 观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平 整,说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出 现纹路或是气泡,轻轻敲打柱体以消除气泡,消 除不了时要重新装柱。

三、实验结果分析与评价
3、你能观察到蛋白质的分离过程中,红色 区带的移动吗?请描述红色区带的移动情况, 并据此判断分离效果?
如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离 操作也正确的话,能清楚地看到血红蛋白的红 色区带均匀、狭窄、平整,随着洗脱液缓慢流 出;如果红色区带歪曲、散乱、变宽,说明分 离的效果不好,这与凝胶色谱柱的装填有关。

知识总结
血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 蛋白质分子的差异性

凝胶色谱法
凝胶电泳法 缓冲溶液

原 组

理 成 作

分离过程 用

蛋白质的
提取分离

样品处理 纯度鉴定

粗 分 离 纯 化

教学反馈
1.凝胶色谱法是根据( B )分离蛋白质的有效方法。 A分子的大小 B相对分子质量的大小 C带电荷的多少 D溶解度 2.缓冲液的作用是:在一定范围内,抵制外界的影响来 维持( B )基本不变。 A温度 B pH C渗透压 D氧气浓度 3.电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷 ( B )的电极移动。 A相同 B相反 C相对 D相向 4. 哺乳动物和人的成熟的红细胞中的( A )与氧气的 运输有关。 A血红蛋白 B肌红蛋白 C肌动蛋白 D肌球蛋白

5.血液由血浆和各种血细胞组成,其中( C ) 的含量最多。 A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞 6.为防止血液凝固,在采血容器中要预先加入抗 凝血剂( D )。 A. NaCl B.甲苯 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠 7.将搅拌好的混合液转移到离心管中,离心后, 可以明显看到试管中的溶液分为4层,其中第 3层是( C ) A无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物

练习巩固
1、随着人类跨入蛋白质组时代,对蛋白 质的研究和应用越来越深入,首先要做 的一步是 A 弄清各种蛋白质的空间结构 B 弄清各种蛋白质的功能 C 弄清各种蛋白质的合成过程 D 获得高纯度的蛋白质

2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中, 关于蛋白质的叙述,正确的是 A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于 相对分子质量较大的蛋白质 B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于 相对分子质量较大的蛋白质 C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于 相对分子质量较大的蛋白质 D 二者根本无法比较

3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中,不同蛋 白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异

4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是 A 调节pH B 维持红细胞的能量供应 C 防止微生物生长 D 防止血液凝固

5、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数 和CO2分子数分别是

A
C

4、2
2、1

B

4、4

D、1、1

6、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后 分层顺序自上而下是: 有机溶剂-----脂类物质-----血红蛋白溶液 ------红细胞破碎物沉淀


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