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血清谷丙转氨酶活性的测定(改良赖氏法)


血清谷— 血清谷—丙转氨酶活性的 测定(改良赖氏法)

【目的要求】 目的要求】 1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作 方法。 3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。 3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。


【实验原理】 实验原理】 血清中的谷-丙转氨酶(ALT),在37℃ 血清中的谷-丙转氨酶(ALT),在37℃、 pH7.4的条件下,可催化基质(底物)液中 pH7.4的条件下,可催化基质(底物)液中 的丙氨酸与α 的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸:

生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加 生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加 成反应,生成丙酮酸-2,4成反应,生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙,进而在碱性环境中 生成红棕色的苯腙硝醌化合物,其颜色的深浅在一定范围 内与丙酮酸的生成量,亦即与ALT活性的高低成正比关系。 内与丙酮酸的生成量,亦即与ALT活性的高低成正比关系。 据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较,便可算出或通过 标准曲线查出血清中ALT的活性。 标准曲线查出血清中ALT的活性。

尽管基质液中余下的a 尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙 硝醌化合物而影响测定结果,但因其量不多,加之对 505nm的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强, 505nm的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强, 尤其用标准曲线作测定时,所用的酶活性单位通过卡门氏 分光光度速率法矫正,摈弃了赖氏法一些固有弊端,结果 比其他比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使 用连续监测法的单位使用赖氏法。1981年全国常规生化检 用连续监测法的单位使用赖氏法。1981年全国常规生化检 验方法学术讨论会认为赖氏法测定ALT活性较为合理,全 验方法学术讨论会认为赖氏法测定ALT活性较为合理,全 国肝炎协作会议也建议统一使用改良赖氏法。

取干净试管12支,按下表所示标号,要求各S管和U 取干净试管12支,按下表所示标号,要求各S管和U管进行双管平行操 作。先做对照管和测定管,在30min保温期间再做空白管和标准管。 作。先做对照管和测定管,在30min保温期间再做空白管和标准管。

【实验结果】 实验结果】 1.赖氏法测定ALT的标准曲线(即计量反应曲线) 1.赖氏法测定ALT的标准曲线(即计量反应曲线) 在坐标纸上以上表中An- 0之值为纵坐标,相应 在坐标纸上以上表中An-A 0之值为纵坐标,相应 的酶活性的卡门氏单位为横坐标作图,即得赖氏 法测定ALT的标准曲线 法测定ALT的标准曲线 2.标本中ALT活性结果 2.标本中ALT活性结果 ⑴查标准曲线 利用测定所得的吸光度结果(AU- 利用测定所得的吸光度结果(AU- AB),便可从标准曲线上查得标本的ALT结果 AB),便可从标准曲线上查得标本的ALT结果 ⑵计算 将实验测得的AU-AB 、AS 代入下面计 将实验测得的AU- 算公式,即可算得标本中ALT活性 算公式,即可算得标本中ALT活性

【方法评价 】 ALT活性测定主要有两类。一是卡门氏(Karman) ALT活性测定主要有两类。一是卡门氏(Karman) 分光光度法,测定的是酶促反应速率。其原理如 下: 由于NADH在波长340nm处有特异吸收峰,因此ALT 由于NADH在波长340nm处有特异吸收峰,因此ALT 的活性可通过NADH的减少量,亦即通过340nm吸光 的活性可通过NADH的减少量,亦即通过340nm吸光 度的减少量间接作出定量测定。这一方法特异性、 准确性高。但是此法除要加入待测酶ALT的底物外, 准确性高。但是此法除要加入待测酶ALT的底物外, 还需要加入指示酶LDH及其辅酶NADH,又需用紫外 还需要加入指示酶LDH及其辅酶NADH,又需用紫外 分光光度计,因此不易为一般临床化验室推广。

二是比色测定法,如:金氏法(King法)、穆氏法(Mohun 二是比色测定法,如:金氏法(King法)、穆氏法(Mohun 法) 和赖氏法(Reitman-Frankel法)。其原理、试剂、操作步骤及作用温度 和赖氏法(Reitman-Frankel法)。其原理、试剂、操作步骤及作用温度 等完全相同。不同之处在于作用时间:King法 等完全相同。不同之处在于作用时间:King法60min ,Mohun法和 Reiman Mohun法和 法30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义 30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义 是:每1ml血清在37℃条件下与底物作用60 min,生成1μmol丙酮酸称为 是:每1ml血清在37℃条件下与底物作用60 min,生成1μmol丙酮酸称为 一个单位。 Mohun 法单位定义是:每毫升血清在pH=7.4,37℃条件下与 法单位定义是:每毫升血清在pH=7.4,37℃条件下与 底物作用30 min,每生成2.5微克丙酮酸为1 底物作用30 min,每生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的 单位定义,而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1个卡门 单位定义,而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1 氏单位的定义是:在温度25℃,pH7.4,波长340nm,光径1cm的条件下, 氏单位的定义是:在温度25℃,pH7.4,波长340nm,光径1cm的条件下, 1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用 1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用 物质的量浓度,而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单 位的定义条件代入国际单位计算公式,即得卡门氏单位与国际单位的换算 关系:1卡门氏单位=0.4821 IU/L(25℃),便可将卡门氏单位兑换成国际 关系:1卡门氏单位=0.4821 IU/L(25℃),便可将卡门氏单位兑换成国际 单位。

改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度( 改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为 低浓度) 低浓度)的改良赖氏法,对卡门氏单位的科学套用,使比 色法一些缺陷得到了卓有成效的克服,使其结果与速率法 较为一致,能较好反映酶的真实活性。 由于赖氏法设计的底物浓度, 由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足,反应速 度只能达到最大速度的65%;显色剂2,4度只能达到最大速度的65%;显色剂2,4-二硝基苯肼的用 量只及反应液中酮酸浓度的一半;保温30min的酶促反应 量只及反应液中酮酸浓度的一半;保温30min的酶促反应 后,新生成的丙酮酸和未用完的a 后,新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人 为控制的竞争显色的几率问题,如此等等,使赖氏法的重 现性较差,在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。

【临床意义】 临床意义】 肝细胞中含ALT最丰富,因此当肝脏疾病致肝细胞 肝细胞中含ALT最丰富,因此当肝脏疾病致肝细胞 受损伤时,ALT即大量释放入血液,致使血清中 受损伤时,ALT即大量释放入血液,致使血清中 ALT活性增高。测定ALT是检查肝功能的重要指标 ALT活性增高。测定ALT是检查肝功能的重要指标 之一。ALT显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒 之一。ALT显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒 性肝细胞坏死,中等程度增高见于肝癌、肝硬化、 慢性肝炎及心肌梗塞,轻度增高则见于阻塞性黄 疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、多发性肌炎亦 可引起转氨酶活性升高。 思考题】 【思考题】 1.血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意义? 1.血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意义? 2.血清谷丙转氨酶的测定有何注意点?为什么要 2.血清谷丙转氨酶的测定有何注意点?为什么要 避免溶血?


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