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原核表达载体的构建


新城疫病毒NP、P、M、F、HN 原核表达载体的构建

一 实验所需材料

原核表达载体pET-32a(+);

Ecoli DH5α菌株;
限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ、Hind Ⅲ、XhoⅠ; LB液体培养基(未加Amp+和加Amp+); LB固体培养基(含Amp+); 0.1mol/L CaCl2溶

液; 凝胶回收试剂盒。

二 实验步骤

1、将鉴定为阳性的重组质粒pGEMT-NP、pGEMT-P、 pGEMT-M、pGEMT-F和pGEMT-HN与原核表达载体pET32a分别用相应的限制性内切酶进行双酶切。以 pGEMT-NP为例,双酶切体系(30μL体系)如下:
ddH2O 10×buffer H pGEMT-NP EcoRI Sal I 21 ?L 3 ?L 4 ?L 1 ?L 1 ?L ddH2O 10×buffer H pET-32a EcoRI Sal I 22 ?L 3 ?L 3 ?L 1 ?L 1 ?L

二 实验步骤

1、将鉴定为阳性的重组质粒pGEMT-NP、pGEMT-P、 pGEMT-M、pGEMT-F和pGEMT-HN与原核表达载体pET32a分别用相应的限制性内切酶进行双酶切。以 pGEMT-NP为例,双酶切体系(30μL体系)如下:
ddH2O 10×buffer H pGEMT-NP EcoRI Sal I 21 ?L 3 ?L 4 ?L 1 ?L 1 ?L ddH2O 10×buffer H pET-32a EcoRI Sal I 22 ?L 3 ?L 3 ?L 1 ?L 1 ?L

2、双酶切反应条件:37 ℃ 3 h。进行1%琼脂糖凝 胶电泳鉴定,然后在紫外灯下切取目的条带,用凝 胶回收试剂盒回收目的片段和原核表达载体片段。 3、目的基因片段与原核表达载体pET-32a的连接, 连接体系为10μL:
ddH2O 10×T4 Buffer 目的基因片段 载体片段 T4 DNA Ligase 2 ?L 1 ?L 5 ?L 1 ?L 1 ?L 4℃连接过夜

4、制备大肠杆菌DH5α感受态细胞,冰上放置4h以 上备用。 5、连接产物转化DH5α感受态细胞,将转化的细菌 涂于Amp+ LB平板,37℃倒置培养过夜待菌落长出。 6、从Amp+ LB平板上随机挑取生长的单菌落,于3mL LB液体培养基(含Amp+)中培养12-16h。

7、碱裂解法提取质粒,然后用相应的限制性内切酶 进行双酶切鉴定。以待鉴定的pET-32a-NP为例,双 酶切体系为20μL:
ddH2O 10×buffer O pET-32a-NP EcoRI Sal I 15.5 ?L 2 ?L 1.5 ?L 0.5 ?L 0.5 ?L 37℃酶切3h

8、酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,将阳性质 粒送去测序,序列分析正确的重组原核表达载体用 于下一步的原核表达。

注:各目的基因两端酶切位点及双酶切通用Buffer
NP基因两端带有的酶切位点为EcoRI和SalI,通用buffer为10×buffer H P基因两端带有的酶切位点为EcoRI和HindⅢ,通用buffer为10×buffer M M基因两端带有的酶切位点为EcoRI和SalI,通用buffer为10×buffer H F基因两端带有的酶切位点为EcoRI和SalI,通用buffer为10×buffer H HN基因两端带有的酶切位点为SalI和XhoI,通用buffer为10×buffer H

EcoR Ⅰ

Sal Ⅰ

Xhol Ⅰ

Hind Ⅲ

第一组
目的基因酶切体系
ddH2O 10×buffer H pGEMT-NP EcoRI Sal I 21 ?L 3 ?L 4 ?L 1 ?L 1 ?L

原核表达载体酶切体系
ddH2O 10×buffer H pET-32a EcoRI Sal I 22 ?L 3 ?L 3 ?L 1 ?L 1 ?L

第二组
ddH2O 10×buffer M pGEMT-P EcoRI HindⅢ 21 ?L 3 ?L 4 ?L 1 ?L 1 ?L 22 ?L 3 ?L 3 ?L 1 ?L 1 ?L

ddH2O 10×buffer M pET-32a EcoRI HindⅢ

第三组
ddH2O 10×buffer H pGEMT-M EcoRI Sal I 21 ?L 3 ?L 4 ?L 1 ?L 1 ?L ddH2O 10×buffer H pET-32a EcoRI Sal I 22 ?L 3 ?L 3 ?L 1 ?L 1 ?L

第四组
ddH2O 10×buffer H pGEMT-F EcoRI Sal I 21 ?L 3 ?L 4 ?L 1 ?L 1 ?L ddH2O 10×buffer H pET-32a EcoRI Sal I 22 ?L 3 ?L 3 ?L 1 ?L 1 ?L

第五组
ddH2O 10×buffer H pGEMT-HN Sal I Xhol I 21 ?L 3 ?L 4 ?L 1 ?L 1 ?L ddH2O 10×buffer H pGEMT-HN Sal I Xhol I 22 ?L 3 ?L 3 ?L 1 ?L 1 ?L

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