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微生物基因敲除技术的研究进展


研究论文

微生物基因敲除技术的研究进展‘
刘建密1’2邵铁梅2李国勋3
宋福平2”
(1河北农业大学植物保护学院,保定071001; 2中国农业科学院植物保护所、植物病虫害生物学国家重点实验室,北京100094; 3莱阳农学院,青岛266000)

摘要:随着微生物基因组学的发展,基因敲除技术在微生物基因功能

方面的研究得到 广泛的应用。本文概述了基因敲除技术的概念,起源及原理,微生物基因敲除系统和微生物 基因敲除的技术要点,并对微生物基因敲除技术的应用情况作了简要的叙述。 关键词:基因敲除;同源重组;插入型载体;置换型载体

自1995年第一个细菌即流感嗜血杆菌(Haemophilusfluenzae)的全基因组序列发表以 来,到2006年8月27日为止,已经完成了包括大肠杆菌、痢疾杆菌在内的413种微生物 全基因组序列的测定…。这些全基因组序列的测定为进一步研究各种微生物的基因功能 奠定了基础。研究基因功能的重要方法之一是构建基因的突变体来检测其表型的变化,以 推测该基因在生长过程中起到的作用。最直接的方法是将目的基因敲除,这样可以保证被 研究的基因功能完全失活。 下面就基因敲除技术的概念、起源及原理,微生物基因敲除系统,微生物基因敲除的 技术要点及应用情况进行了介绍。

1基因敲除的概念、起源及原理
1.1

基因敲除的概念 基因敲除(gene
knock

out),又称基因打靶,是同源重组技术的形象说法。它是指用

外源的DNA与受体细胞基因组中顺序相同或非常相近的基因发生同源重组,整合至受体 细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术【2 J。此种技术的优点在于整合位点确 定、精确,转移基因频率较高,既可以用正常基因敲除突变的基因,以进行性状(一个 生物的任何可以鉴别的表型特征)的改良和遗传病的治疗,又可以用突变的基因敲除正 常的基因,以研究此基因在发育和调控方面的作用。基囚敲除技术在微生物方面的研究主 要集中在将正常的基因敲除以研究其功能方面。 1.2基因敲除的起源与原理 生物界同源重组现象的发现,为基因敲除技术奠定了坚实的理论基础。早在20世纪 初,Morgan等人通过对果蝇眼色遗传的分析揭示了同源染色体之间的DNA重组是产生交

?基金项目:国家973项目:(2003CBll4201和2001CBl09005)资助 作者简介:刘建密,硕士研究生,从事抗生素Zwittermicin A生物合成相关基因的研究。 ??通讯作者:宋福平,Tel:010—62817545,E.mail:fpsong@ippcaas.cn

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换的基础。同源重组(homologous recombination)是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程 中相同或者相似DNA序列问的重组【l J。基因的同源重组是较普遍的生物现象,其分子机

理尚未阐明,但活细胞内确有一酶系可使DNA的同源序列在细胞内发生重组,如大肠杆
菌中的RecA和RecBCD、T4噬菌体中的Uvs和哺乳动物中的RAD51、DMEl、XRCC2和 XRCC3等。 关于同源重组的分子机制目前尚未阐明,但现在已相继提出了多种解释同源重组的模 型,其中Meselson—Radding模型不仅可以解释交互重组现象,而且还可以圆满地解释基 因转变现象,所以被广泛接受∞J。Szostak等提出的双链断裂修复模型(DSBR)能更好地 毹释双链断裂可大大提高同源重组的效率这一现象H】。Lin等于1984年提出完全不同的 单链退火模型(SSA),提供了理解同源重组机制的全新视角”j。此外,一些学者还提出 了其他的同源重组模型,如三链DNA模型、RNA介导重组模型等№刊。随着研究的深入 对同源重组的机制会有更合理的解释。

2微生物基因敲除系统
在大肠杆菌中进行的基因敲除系统有:RecBCD--sbcB重组系统、RecA依赖的重组 打靶系统、Chi位点刺激的重组、利用单链DNA进行的重组工程、转座子突变系统p。; 在酵母中最常用的基因打靶技术包括两类,一类是转座子标记的突变系统,另一类是 PCR介导的基因删除系统¨刨;噬菌体重组系统有:Rac编码的ReeET系统、Red重组系 统、噬茵体退火蛋白介导的寡核苷酸重组系统;其他微生物中进行基因打靶的系统有:转 座子突变系统、自杀载体策略等¨“。

3微生物基因敲除的技术要点 微生物基因敲除的技术要点如下:①基因敲除载体的构建:将与靶序列同源的序列重 组到带标记基因的载体上;②打靶载体的导人:在微生物中,一般用电穿孔方法将打靶载 体导人受体细胞内;③同源重组子的筛选;④突变体的形态观察和分子生物学鉴定。
3.1

基因敲除载体的构建

基因敲除载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等非同源
序列,其中同源序列是同源重组效率的关键因素。基因打靶载体的同源重组序列~般先通 过特异性探针从基因组DNA文库中分离得到的含有目标基因(靶基因)的克隆后,选取 适当DNA片段后得到,也可利用PCR对基因组目标位点的DNA序列进行扩增得到。 根据同源重组时载体插入基因组的方式,可将打靶载体分为两种类型:插入型载体 (又称O型载体)和置换型载体(又称Q型载体)。这两种载体的区别在于载体DNA同 源序列双链断裂位点的位置不同。插入型载体的断裂位点在同源重组指导序列内,载体与

染色体靶位点进行一次交换完成同源重组,其结果是整个载体整合到染色体靶位点上;置
换型载体的断裂位点在同源重组指导序列的两侧或外侧,同源重组指导序列与染色体靶位 进行两次交换完成同源重组,重组的结果是只有载体的同源重组指导序列及其以内的部分 取代染色体的靶位序列,同源重组指导序列以外的部分被切除¨21;与此相应的基因敲除

方法根据载体与基因组的交换次数可分为单交换(single crossover)013 J和双交换(double
crossover)【14_18]。

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到目前为止,置换型载体的应用越来越多,现就插入型载体与置换型载体的优缺点作

一比较:①插入型载体发生单交换,插入染色体的外源片段相对而言较长,容易发生移
码,影响其他基因的表达;②单交换完成的突变体中,含有基因打靶载体,所以必须设 立转入空载体的野生菌为负对照;这就增加了实验的复杂性;③单交换产生的突变体进行 基因的恢复比较困难;④使用置换型载体,可以设置正选择标记基因,同源重组发生时, 同源臂外侧的负向选择标记基因被切离,同源臂之间的正向选择基因整合人基因组,获得

抗药性,这有利于突变体的筛选¨钉;⑤使用置换型载体,可以不设置正选择标记基因,
这就是利用重叠PCR法构建的置换型载体,它足利用PCR的方法将目的基因上游及下游 DNA片段扩增出来,再以这两段片段共同为模板,进行第二次扩增,将此突变盒与载体 相连,构建基因敲除载体㈣]。它操作简便,省时省力。综合上述优缺点,不难发现置换 型载体广泛应用的原因。
3.2

同源重组的筛选及鉴定 由于在微生物中发生同源重组的频率比较低,因此要筛选出发生定点整合的细胞就成

为基因敲除要解决的关键技术问题。载体本身所携带的抗性是筛选的标准之一,对于插入

型载体而言,同源重组体带有相应的抗性。对于置换型载体,在同源片段内部插入抗生素
抗性基因,相应的同源重组体便有抗性。一般的正选择标记基因有壮观霉素抗性基因嵋1。, 卡那霉素抗性基因¨4“8|,链霉素抗性基因∞20等。 基因敲除实验的本质是通过构建基因敲除载体,将载体DNA导人细胞后,利用载体 DNA所含有的与内源基因的同源片段发生同源重组,达到改造或修饰内源基因组的结构

和组成的目的。要实现这一目的,设计构建合适载体、载体DNA的基因转化和适当的药
物选择策略等都非常重要,最终得到的细胞的基因组是否真正被人为修饰,则必须在 DNA结构水平上得到证实,这就是基因敲除实验中细胞发生同源重组事件的分子鉴定。 目前常用的鉴定同源重组子的方法有PCR法、Southern杂交法等。 多聚酶链式反应技术在过去的十多年里得到了长足发展,应用面也越来越广,已成为

公认的灵敏度高、操作简单的分子检测技术,适合于对大量样品的快速鉴定。基因打靶实
验中,从大量的细胞中鉴定出发生了同源重组的细胞克隆,直接进行Southern鉴定工作量 较大,用PCR技术进行初步筛选显得非常必要L23 J。如设计一对分别来自染色体DNA及

载体上外源DNA序列的引物,以此对引物对筛选的细胞染色体DNA进行PCR,如有PCR
特异产物,便可确定突变体。

同源重组事件的最终确认需要进行基因组Southern印迹杂交鉴定,此时,限制性内切 酶的选择和探针的设计是鉴定出真正发生同源重组事件的关键。对于用置换型载体进行的
基因打靶,探针最好是用载体外的片段(extemalp robe),限制性内切酶则选用载体中没 有切点的酶。但这种理想的探针和限制性酶经常由于对靶基因位点及其附近的基因组结构 了解得不够而难以设计,许多文献报道的探针均用载体内片段,有的甚至用正向选择标记 基因作为探针,结合PCR鉴定,常可得到理想的结果¨引。

还有一些验证方法,如从RNA、蛋白层面的验证。对于与抗生素生物合成相关的基
因而言,进行HPLC分析Ⅲ1也是验证的方法之一。如Zwittermicin A是由蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus,Bc)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)产生的一类新型广谱 的抗生素瞵],它可以抑制多种真核生物与原核生物,其中包括多种植物病原菌,而且该

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抗生索与Bt毒素共同使用能显著提高其杀虫活性。将野生菌株与其生物合成相关基因的 基因敲除突变体进行HPLC分析,可以定量的比较Zwittermicin A活性物质,从而验证基 因的功能。 3.3突变体的形态观察 除了分子方面的验证以外,对突变体形态的观察在定性方面尤为重要。如在芽孢杆菌

中,敲除了与芽孢形成有关的基因后,可能会影响芽孢的形成;对于产生抗生素的细菌而 言,敲除了抗生素的生物合成基因,那么抗生素的合成将受到抑制,用相应的指示菌做生
物活性测定就显得非常必要。本实验室利用微生物基因敲除方法,对Zwittermicin A的部

分生物合成相关基因进行功能研究,用得到的突变体与产Zwittermicin A的Bt野生菌株分
别做指示菌的生物活性测定,发现突变体菌株没有可见的抑菌效果(待发表)。

4基因敲除技术的发展前景及展望
基因敲除技术是20世纪80年代后期发展起来的新兴的分子生物学技术。它具有定位 性强、打靶后新的基因随染色体DNA稳定遗传的特点,它克服了随机整合的盲目性和偶 然性,是一种理想的研究基因功能的、修饰改造生物遗传物质的方法。基因敲除技术一经 产生便在生物学领域引起了人们的极大关注,它对于解决目前生物学领域的许多难题提供 了新的思路和方法,无论在基础理论研究还是在实践应用方面都有着广阔的前景。

微生物基因敲除技术在农业方面有着广泛的应用,尤其是生物技术与植物保护相结 合,使得生物防治有了长足的发展。随着化学农药的滥用,害虫抗性和农药残留发生严
重,直接危害了农业的可持续发展道路。生物防治直接解决并弥补了化学防治的缺憾。在 生物防治中微生物防治和农用抗生素是不可或缺的部分。目前越来越多的杀虫或抑菌微生

物得到人们的关注,对于这些有益微生物的基础研究越来越受到关注。随着生物技术的发 展,从分子水平了解这些微生物功能基因的作用成为可能,可以利用微生物基因敲除技术
验证了微生物杀虫防病基因的功能,为微生物的应用奠定了良好的基础。 相对而言,基因敲除技术在农用抗生素生物合成相关基因方面的应用更加广泛。阿维 菌素是迄今发现最有效的杀昆虫剂,杀螨虫剂和杀寄生虫剂之一。对其生物合成相关基因

功能的研究,有利于生物合成途径的明确,这使得人们可阻断特定基因表达构建新型菌
株,以增加有效组分及新型的抗生素的产出,还可通过化学修饰的方法来提高阿维菌素活 性m J。尼可霉素是一种能够竞争性抑制几丁质合成酶的抗生素,它对真菌、昆虫和螨类 有很高的活性,因此在农业上有潜在的应用价值。尼可霉素主要的生物活性组分包括x 组分和z组分。运用基因敲除技术对尼可霉素生物合成基因sanO进行敲除,发现突变株 的x组分消失,而z组分与野生菌株的水平相当,证明sanO基因是x组分生物合成所必 需的¨5‘。把包含sanO基因的重组质粒pW06转化人野生菌株后发现,X组分的产量是野 生菌株的两倍。可见sanO基因的过量表达会提高X组分的产量瞄7J。 微生物基因敲除技术的应用,为我们更深入的了解生物及生命现象提供了有效工具。 可以预见基因敲除技术将会为生命科学领域特别是微生物的研究带来新的突破。 参考文献
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微生物基因敲除技术的研究进展
作者: 作者单位: 刘建密, 邵铁梅, 李国勋, 宋福平 刘建密(河北农业大学植物保护学院,保定,071001;中国农业科学院植物保护所、植物病虫害 生物学国家重点实验室,北京,100094), 邵铁梅,宋福平(中国农业科学院植物保护所、植物 病虫害生物学国家重点实验室,北京,100094), 李国勋(莱阳农学院,青岛,266000)

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纳塔,也称细菌纤维素(Bacterialcellulose,BC),是由微生物产生的一类纯纤维素。它是由β-D-葡萄糖通过β-1,4-葡萄糖苷键结合成的直链 ,直链间彼此平行,不呈螺旋构象,无分支结构,又称为β-1,4-葡聚糖。BC的发现至今已有一百多年的历史,但由于生产成本高,对其物理特性了解不 够充分,以致其应用受到限制。最近十几年随着对BC生物合成机制的深入了解,以及发酵条件的改善,BC的工业应用逐步加速。目前,BC主要应用于附 加值较高的领域。在声音振动膜、高强度纸、新型伤口包扎材料等产品的研制中已进入实用化阶段,在其他方面也具有广泛的商业化应用潜力。关于 BC的研究已成为当今新的微生物合成材料研究的热点之一 纤维素合成酶对BC合成具有重要的影响。BC的最终合成是依赖于纤维素合成酶完成的 ,纤维素合成酶活力的高低,表达量的多少,直接影响到BC的合成及产量高低。然而纤维素合成酶的活力又与环鸟苷酸相关,环鸟苷酸 (cyclicdiguanylicacid,c-di-GMP)是纤维素合成酶的变构激活剂,在BC的生物合成中,如果纤维素合成酶的变构位点上没有结合环鸟苷酸,纤维素合 成酶将不具有活性。环鸟苷酸的合成与降解又与二鸟苷酸环化酶(GC)和磷酸二酯酶(PDE)有关。二鸟苷酸环化酶催化环鸟苷酸的合成,磷酸二酯酶催化环 鸟苷酸的降解。 本课题的研究思路就是通过提高纤维素合成酶变构激活剂的量,达到提高细菌纤维素合成酶活力,使更多的脲苷二磷酸葡萄糖 (UTPG)转化为纤维素的目的。因此,利用插入失活的原理,敲除编码PDE的基因pde基因,阻断PDE的合成,提高细菌纤维素合成酶活力,在理论上是可行 的、合理的。虽有学者推测在培养基中添加PDE抑制剂,提高纤维素合成酶活力,但未见有研究性资料。因此,利用基因工程技术阻断PDE对环鸟苷酸的 抑制,提高细菌纤维素合成酶活力是本课题的创新点。 本研究以筛选的BC生产菌为试验菌,通过敲除对纤维素合成酶变构激活剂有抑制作用的 pde基因,解除磷酸二酯酶(PDE)对细菌纤维素合成酶激活剂的降解作用,构建高产菌株。研究内容包括:1)提取并扩增pde基因,通过试验确定能大量扩 增pde基因的最佳条件;2)利用基因敲除法获得pde基因;3)选择合适的载体,将失活基因重组到试验菌株中,确定适宜的重组条件;4)筛选、鉴定重组 子并对所得重组菌株进行遗传稳定性研究;5)对重组菌株进行发酵验证研究。 本研究确定了一种纤维素生产菌株菌体细胞收集方法,收集条件为 :种子液接种量2mL,涂布于φ12cm的平板培养基,培养24h,刮膜至10mL无菌水中,漩涡混合仪振荡1min,无菌脱脂棉过滤,滤液在12000r/min下离心 10min即可。 本研究分别考察了pde基因片断、ampr基因PCR扩增时影响最大的两个因素:Mg2+浓度和复性温度。确定pde基因片断PCR扩增时Mg2+浓 度为3mM,复性温度为50℃;ampr基因PCR扩增时Mg2+浓度为为2mM,复性温度为36℃。 本研究利用基因敲除的原理,成功构建了pde-基因,同时将 pde-基因重组到试验菌株中,构建了pde-基因型重组菌株。 本研究对pde-基因型重组菌株进行了发酵研究,比较了重组菌株与出试验菌株BC产量 ,得出:所筛选10株pde-基因型重组菌株BC产量均稍有提高,最大产率提高了4.8%,但提高幅度不是很大,原因可能是细胞体内PDE不能表达后,引起 代谢途径发生改变。原来的发酵条件可能已经不适合重组菌株的发酵生产。因此pde-基因型重组菌株BC产量的提高还有待于进一步研究。 本研究 最后对重组菌株遗传稳定性进行了考察,结果证明,连续转接三代之后,重组菌株pde-基因型仍然存在,说明其遗传稳定性良好。 本项目的意义 在于从基因水平探索改造BC生产菌种的途径,为选育高产菌株,构建适用于规模化生产的工程菌,降低生产成本奠定了理论基础,提高我国BC的规模化 生产水平,促进BC在国内的市场开发和应用。

5.学位论文 黄蓓蓓 遗传改造的酿酒酵母分析技术平台的建立及其在萜类生物合成途径上各代谢物分析中的应用 2009
萜类化合物广泛分布于植物及微生物初级代谢物和次生代谢物中,其种类繁多,不仅在植物的生命活动中扮演重要的作用,而且还被广泛的应用于 工业、医药卫生等方面,如倍半萜中的青蒿素、双萜中的紫杉醇可分别作为抗疟、抗癌的有效药物。但是萜类在生物体内的产量很低,而且分离和纯化 操作复杂。由于萜类结构复杂,化学合成需要的步骤烦琐,非常困难。由于酵母自身存在甲羟戊酸(Mevalonate,即MVA)途径,可自我合成萜类前体,为 利用代谢工程改造细胞代谢途径为提高萜类产量提供了一个很好的操作平台,然而酵母中萜类前体库不足够提供高产,有必要调节其参与萜类前体生物 合成的代谢途径以提高产量。 本研究中,我们选择酿酒酵母作为宿主细胞,以酿酒酵母中的萜类生物合成途径为主要研究对象,建立遗传改造的 酿酒酵母的分析技术平台,将最先进的分析技术用于测量代谢物及其在一定条件下含量的变化,有助于阐释遗传干预对感兴趣的途径的影响,同时对微 生物的应激反应进行整体性无偏的描述,以进一步理解通过这个途径的代谢流的控制分子机制,得到如下结果: (1)首次将基因敲除的分子生物学 方法,引入酿酒酵母的次生代谢途径萜类生物合成途径中,以调节其代谢,增加其萜类前体库供给。酿酒酵母中的萜类生物合成途径主要分成六异戊二 烯基焦磷酸合成途径以及麦角甾醇生物合成途径两个部分。为了增强通往萜类前体的代谢流,构建敲除盒,将负责FPP转为角鲨烯,竞争FPP的erg9基因 ,位于萜类前体下游的coql基因分别敲除,减少旁路消耗。用 (2)PCR方法构建敲除盒LoxP-kanMX/URA3-loxP,分别敲除erg9基因和coql基因,剔 除筛选标记ura3后,分别得到新菌型BY4743-△erg9和BY4743-△ coql。在BY4743-△erg9基础上,再利用敲除盒LoxP-URA3-loxP,敲除coql,基因,经 PCR验证,并剔除筛选标记ura3,得到新菌型BY4743-△ erg9-△ coql。同时考察其基础时间生长曲线的变化,为下一步的基因.生理机能机制深入研究 ,提供基础。野生菌株生长最快,缺失株生长较慢,双缺失菌生长最慢,形成的菌落也较小。 (3)为了考察上述遗传改造对萜类前体积累的效果 ,测定酿酒酵母的萜类生物合成途径上重要的指标性成分GGPP(二萜成分的前体),分析它的变化,表征其随erg9,coql基因缺失的关联性,为阐明酿酒 酵母中萜类合成途径的调节分子机制提供现实依据。本研究首次建立LC-MS方法测定遗传改造后酿酒酵母中GGPP含量的变化。应用4.6 mm×25 cm SB-Aq C185-μm(Agilent Tech.,USA)色谱柱进行液相分离,流动相75%(10mM三丁胺水溶液用15mM醋酸调成pH4.95):25%甲醇,质谱负离子模式扫描质荷比

范围50-600,选择离子检测GGPP([M-H]-),质荷比449.2。标准曲线线性范围0.1-50ng/ml。在这个范围内的,日内相对标准偏差<10%,日间相对标准 偏差<14%,精密度范围96.5-105.4%。结果显示,遗传改造有效,BY4743-△erg9-A coql的积累量在72小时后增加非常显著。遗传改造后的菌株与野 生型菌株比较,含量有显著差异(P<0.01);随时间的长短,含量显著增高。说明erg9与coql对GGPP的代谢显著影响。 (4)为了研究遗传改造对萜 类生物合成途径代谢流的影响,建立GC-MS方法测定萜类生物合成途径上各代谢物及其在酿酒酵母中的应用。本研究首次建立一个精确灵敏的非放射性的 方法,同时定量酿酒酵母中萜类合成途径上的GPP,FPP,GGPP,角鲨烯,麦角甾醇和羊毛甾醇,考察代谢流的变化。这个方法建立在GPP,FPP和GGPP去 磷酸化成相应的烯萜醇,用GC-SIM-MS分析。本研究考察了三种转化方法:酸解法、碱解法、酶解法。酸解法和碱解法的转化率都低于15%,不能应用于 此,酶解法在不同的缓冲体系中的转化率相差很大,50mM Bis-Trispropane/HCl,1mM MgCl2,pH7.0,转化率<1%;0.1M2-amino-2methylpropanol/NaOH1mM MgCl2,pH10.35,转化率<1%;50 mM Tris-HCl,10 mMMgCl2,pn9.0,转化率<1%;0.1 M glycine/1 M NaCl/40%MeOH,pH10.4,转化率<2%,1 M diethanolamine,0.5 mM MgCl2,pH9.8,转化率可>88%,符合研究的需要。本研究综合比较全发酵液提 取法、细胞液离子交换柱提取法、细胞液超声提取法三种提取方法,正己烷、石油醚、乙酸乙酯、氯仿:乙酸乙酯(1:10)四种提取溶剂,0.5min、 1.5min、3min这样3个涡旋时间,比较其效率,确定最终的前处理方法为:细胞液超声提取法,正己烷提取,涡旋3min。应用TRACETR-5MS柱 (30m×0.25mm×0.25μm)进行气相分离,单重四极杆质谱选择离子监测GOH,FOH,GGOH,角鲨烯,麦角甾醇和羊毛甾醇,以保留时间和碎片信息进行定 性定量分析。结果显示,方法准确有效,标准曲线线性良好,日内和日间精密度良好,加样回收率准确度高。将此方法应用于酿酒酵母中,发现不同基 因对于酿酒酵母中萜类合成途径上的各个代谢物的代谢过程的作用是不一样的,双缺失erg9和coql,使得GPP、FPP、GGPP大量积累,而角鲨烯、麦角甾 醇、羊毛甾醇的含量可维持细胞正常生理功能。 (5)通过考察不同遗传改造的酿酒酵母基础时间生长曲线的变化,发现其生理活动发生了变化。为 了考察遗传改造对细胞生理活动的影响,建立荧光分析和化学发光方法测定分子操作后,与细胞生理特性和基因功能相关代谢物及其含量的变化,有助 于阐明萜类代谢途径的基因敲除后,对细胞功能的影响。利用罗丹明6G,测得BY4743-△ erg9-△ coql离子外排作用低于野生型和单缺失菌,并且酿酒 酵母的外排作用是能量依赖型的。利用JC-1,测得erg9与coql对线粒体膜电位的影响巨大,两者的缺失打破线粒体膜电位分布的平衡,但24h后,不同遗 传改造的酿酒酵母建立的新的膜电位平衡无明显差别。利用DCFA-DA,测得erg9与coql的缺失引发大量内源性活性氧的产生。利用荧光素酶的化学发光 ,测得BY4743-△erg9-△ coqlATP的含量低于野生型和单敲除菌。 当前的工作力求将代谢工程,化学分析,数据处理等多个领域结合,在细胞水 平分析代谢物的变化以详细地认识基因一代谢产物、基因一代谢流之间关联的分子机制,分析生理状态的变化以认识基因功能。本研究涉及多种技术的 联用。这些方法包括分子生物学技术,微生物代谢活性瞬时淬灭,化合物的酶法衍生化、相关胞内代谢产物的提取,色谱与质谱的偶联(GC-MS,LCMS),荧光与化学发光的应用以及统计学上的数据挖掘等等。多种技术的创新和联用必将提供大量的代谢途径信息,有助于反映有机体的生理活动,理解 潜在的调节机制,对以酿酒酵母为平台生产多种重要价值的萜类化合物具有重要意义。

6.期刊论文 徐民俊.田小群.付京花.周世宁.XU Min-jun.TIAN Xiao-qun.FU Jing-hua.ZHOU Shi-ning 酿酒酵母无 标记转化子两种筛选方法比较 -酿酒科技2008(5)
基于食品安全性的要求,在涉及食品工程菌株的基因工程改造中不能使用抗生素或抗药性标记,无标记遗传育种法是这一领域的有益尝试,但由于缺乏 一种快捷的筛选方法,转化子的筛选成为该方法的瓶颈.通过对传统的羧肽酶Y活性验证和实验室独创的96孔板结合茵落PCR两种筛选方法进行了无抗生素 标记的酿酒酵母转化子筛选并对这2种方法进行比较.结果表明,在酵母菌株尚处于杂合基因的状态下,羧肽酶Y活性验证无效;通过96孔板结合茵落PCR的筛 选方法可以实现高通量筛选.

7.期刊论文 陆晓慧.王德良.傅力.赵传仕.LU Xiao-hui.WANG De-liang.FU li.ZHAO Chuan-shi 通过修饰ALD6基因 降低啤酒酵母产乙酸量 -酿酒科技2007(3)
酿酒酵母中乙醛脱氢酶(ALD6)活性的高低控制着啤酒中乙酸含量的多少.通过醋酸锂一步转化法,将一段对遗传霉素有抗性的DNA片段转入酵母细胞中 ,与ALD6基因的ORF(open reading frames)进行同源重组,经过抗性筛选得到ald6基因突变菌.通过筛选、验证、驯化获得一株性能稳定的ald6基因缺陷型 突变菌.

8.学位论文 赵建华 Hog1类Bbhog1的基因敲除对球孢白僵菌毒力和抗逆性的影响 2006
昆虫病原真菌是一类重要的杀虫微生物,在害虫生物防治中具有广阔的应用前景。但目前有关昆虫病原真菌侵染致病的分子机理研究尚缺乏明晰的 认识,限制了真菌杀虫剂的开发利用。MAPK是一类广泛存在于真核生物的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶。MAPK级联反应逐级磷酸化将胞外信号放大 并传递。微生物能够通过该级联反应对外界信号的诱导作出相应的反应。近年来的研究表明,MAPK胞外信号传导途径与植物和人类病原真菌的发育、分 化及致病性密切相关,成为研究病原真菌发育分化及侵染致病分子机理的重要对象。但MAPK信号途径在昆虫病原真菌的毒力和抗逆性有何影响?目前尚无 报道。 本实验室从昆虫病原真菌球孢白僵菌(Beauveriabassiana)中克隆了与酵母HOG1类MAPK同源的基因Bbhog1。为了弄清该基因的功能,本文利 用同源重组的方法敲除球孢白僵菌Bbhog1基因,并分析了Bbhog1的缺失对菌株的抗逆能力和毒力的影响,为研究昆虫病原真菌发育分化与侵染致病中 MAPK信号传导途径奠定了基础。 主要结果如下:1.利用同源重组方法获得了4个敲除Bbhog1基因的球孢白僵菌缺失突变体,分别命名为 △Bbhog1255、△Bbhog1456、△Bbhog1461和△Bbhog1484。Southern杂交验证表明:外源片段以单拷贝整合到基因组中,4个突变体均无随机插入突变 ;球孢白僵菌基因组中的Bbhog1基因(2.3kb)被含有破坏的该基因序列和标记基因的约6kb片段成功置换。 2.表型分析表明: ①在 0.4MNaCl渗透条件下,敲除Bbhog1基因的缺失突变体的孢子萌发和菌丝生长受到明显抑制;在0.8MNaCl渗透条件下,完全抑制其菌丝生长。而野生型菌 株和空载(pk2-bar::GFP)转化子在上述条件下,虽然生长速度受到一定影响,但仍可以萌发和生长。说明敲除Bbhog1的缺失突变体对高渗透压敏感性 增加。 ②在亚高温条件(32℃)下,敲除Bbhog1基因的缺失突变体孢子几乎不萌发。但是将生长正常的菌丝打孔接种到新鲜的培养基上培养,发现 与野生型菌株和pk2-bar::GFP空载转化子没有明显差别。由此可见,亚高温逆境条件下,Bbhog1基因的缺失突变体的孢子萌发明显受到抑制。 ③紫外照射处理表明,敲除Bbhog1基因的缺失突变体的孢子萌发率显著降低,突变体△Bbhog1255,△Bbhog1456、△Bbhog1461和△Bbhog1484菌株在 24hr孢子萌发率分别比野生菌株降低了27.42﹪、63.86﹪、36.45﹪和27.11﹪。而空载(pk2-bar::GFP)转化子经紫外照射后的萌发率与野生菌株没有 明显差异。可见Bbhog1基因与球孢白僵菌对紫外辐射抗性的调节也相关。 上述结果表明,Bbhog1基因与球孢白僵菌对渗透压、温度和紫外辐射等 环境胁迫因子的抗性密切相关。 3.生物测定的结果发现,Bbhog1基因与球孢白僵菌的毒力密切相关。在107个/mL分生孢子浓度下,突变体 △Bbhog1255、△Bbhog1456、△Bbhog1461和△Bbhog1484菌株对桃蚜的半致死时间(LT50)明显延长,达236hr、228hr、185hr和283hr,分别是野生菌株 的LT50137hr的1.7、1.7、1.3和2.1倍。而空载(pk2-bar::GFP)转化子与野生菌株相比,半致死时间没有明显差异。Bbhog1基因敲除使菌株对桃蚜的毒 力显著降低。 上述结果表明,敲除Bbhog1基因导致球孢白僵菌的毒力下降,对高渗、亚高温和紫外线的抗性降低;推测Bbhog1基因与球孢白僵菌 毒力和抗逆密切相关。

9.学位论文 郭静一 福氏志贺菌2a型301株uhpT突变体的构建及功能分析 2009
本文以基因敲除方法研究志贺氏菌的功能基因,以RecA重组系统为基础,采用低拷贝自杀质粒pCVD442作为本敲除体系的重组载体,为了克服该质粒 在进行分子克隆操作中的困难,将Gateway技术应用在敲除前期的重组质粒构建过程中,成功构建了福氏志贺菌2a型301株uhpT基因部分缺失的突变体 MT,从而建立了在福氏志贺菌中进行定位插入或缺失突变的敲除技术平台。 对突变株分别在培养基、细胞水平进行了功能检测。在普通LB培养基 及TSB培养基中突变株与野生株的生长没有显著差异;突变株在U937细胞的胞内存活增殖能力与野生株没有显著差异,在HeLa细胞的胞内存活增殖能力突 变株比野生株下降了12.7%。这说明uhpT基因在志贺氏菌的胞内存活增殖中仍然具有一定的作用。上述结果提示志贺氏菌中uhpT基因与细菌在细胞内的 存活和增殖有关,可能由于细菌中其它碳源物质转移酶系统的存在代偿了敲除基因的功能缺陷,因此突变体在生长水平没有特别显著的变化。 利 用Gateway技术与自杀质粒相结合的敲除体系具有高效高通量的特点。本研究建立了一种对福氏志贺菌功能基因组研究有效的基因敲除技术平台,并且提 供了对志贺氏菌中未知功能基因研究值得参考的新思路。

10.期刊论文 唐雪明.邵蔚蓝.王正祥.方慧英.诸葛健 整合型碱性蛋白酶基因工程菌中抗性基因的敲除 -微生物学 通报2003,30(3)
利用大肠杆菌载体pET-28a和穿梭载体pHY300PL构建了敲除载体pHK,通过DNA变性技术和同源重组技术成功地敲除了整合型碱性蛋白酶基因工程菌 BP071中的卡那霉素抗性基因(Kanr),得到11株敲除卡那霉素抗性基因的阳性克隆,并使产酶水平保持稳定.该方法的建立为基因敲除技术在工业微生物研

究中应用提供了经验,并为微生物来源的转基因产品安全性的研究提供了模型.

本文链接:http://d.g.wanfangdata.com.cn/Conference_6310874.aspx 下载时间:2009年12月31日


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