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基因敲除技术及其在微生物代谢工程方面的应用


Aug 2007 .   ? 10 ?  

生 物 加 工 过 程
Chinese Journal of B iop rocess Engineering

第 5 卷第 3 期 2007 年 8 月

基因敲除技术及其在微生物代谢工程方面的应用
谢承佳 ,何冰芳 ,李   霜
(南京工业

大学   制药与生命科学学院 ,南京 210009 )
3

摘   : 应用基因工程技术对微生物细胞内的代谢通量进行重新设计 ,是获得高产高效的工业菌株的重要手段之 要 一 。基因敲除是 20 世纪 80 年代发展起来的一项重要的分子生物学技术 ,利用基因敲除技术可阻断细胞的代谢旁 路 ,或通过引入突变位点改变目的产物的产量或质量而达到调节代谢流 ,优化代谢途径的目的 。简单介绍了基因 敲除技术的操作过程 ,重点讨论基因敲除技术的敲除策略及在微生物代谢工程方面的应用 , 并展望了相关技术在 诸多领域的发展趋势 。 关键词 : 基因敲除 ; 代谢工程 ; 同源重组

中图分类号 : Q784      文献标识码 : A      文章编号 : 1672 - 3678 (2007) 03 - 0010 - 05

Gene knockout and its applica tion s in m icrobe m etabolic eng in eer in g
X IE Cheng2jia, HE B ing2fang, L I Shuang

( College of L ife Science and Pharmaceutical Engineering, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China)

Abstract:App lication of genetic engineering technology in the redesigning of the metabolic flux is one of ly efficient molecular biology technology termed‘gene knockout’has been developed since 1980 s The . the most important p latform technology for strain im p rovement A homologous recom bination based, high2 . technology can regulate metabolic flux by inserting, deleting, cloning or substituting genom ic DNA se2

   微生物种类繁多 , 数量庞大 , 是大自然提供的 天然宝藏 。随着科技的发展 , 发酵工业与生物催化 向人们提出了更高的要求 , 进一步提高目的产物的 产量 、 纯度及开发有价值新化合物等都是有待解决 的问题 ,因此微生物应用的难题集中到如何对菌种 进行改造 ,以获得高产高效的工业菌株 。传统的育 种手段存在工作量大 , 效率低 , 遗传稳定性差等缺 点 。随着对微生物代谢机理认识的不断加深 , 随着 生物化学 、 细胞生物学 、 应用分子生物学 、 遗传工程
3 收稿日期 : 2006 2 2 11 28

quences at any desired position. The p rincip les and operation p roeedure of gene knockout were briefly in2 troduced, and its app lications in m etabolic engineering were discussed. Key words: gene knockout; metabolic engineering; homologous recombination
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( 20336010) 作者简介 : 谢承佳 ( 1982 - ) ,女 ,江苏南京人 ,硕士研究生 ,研究方向 : 生物化工 。 联 系 人 : 何冰芳 ,教授 ,博士生导师 , E 2 mail: bingfanghe@ njut edu. cn .

的发展 ,定向操纵遗传变化成为可能 , 代谢工程应 运而生 。 [1] 代谢工程的概念诞生于 1991 年 , 具体而言 , 代谢工程就是利用重组 DNA 及其他技术 ,有目的地 改变生物中已有的代谢和表达调控网络 , 以更好地 理解细胞的代谢途径 , 并用于化学转化 、 能量转移 [2] 及大分子装配过程 。对于工业微生物育种来说 , 从野生出发菌株到高效生产菌株 , 需要经过代谢分 析— 设计策略 — 遗传修饰 — 代谢分析这一流程 , 不

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谢承佳等 : 基因敲除技术及其在微生物代谢工程方面的应用

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断的循环调整 ,对宿主进行遗传修饰为其中的重要 一环 ,包括 DNA shuffling, genom e shuffling及基因敲 除技术 ,这些 DNA 重组手段可以快速改变分散在基 因组不同位置上的一个或数个基因 , 从而改变相应 的细胞表型 , 快速优化代谢途径 , 极大地促进代谢 工程的进一步发展和应用 1 基因敲除是 20 世纪 80 年代发展起来的一项重 要的分子生物学技术 , 利用微生物体内的同源重组 系统 ,在一定选择压力下使体外改造的某功能基因 与受体细胞染色体上的功能基因之间发生同源重 组 ,从而改变细胞的遗传特性 。利用基因敲除技术 可阻断细胞的代谢旁路 , 或通过引入突变位点改变 目的产物的产量或质量 , 从而达到微生物育种的 目的 。

1  基因敲除的操作步骤

图 1  基因敲除流程
Fig 1  Flow chart of gene knockout .

基因敲除的一般流程见图 1, 基本程序是 : 用 PCR 技术扩增目的基因序列 , 在体外插入卡拉霉 素、 四环素等受体菌原先不具有的抗性标记 , 使目 的基因失活 ,再将失活的目的基因构建至一环状载 体上 ,用电转化 、 显微注射等方法将构建好的载体 转化入受体细胞内 , 以抗性标记初步筛选阳性菌或 进行目的基因功能的失活检测 , 再以 PCR , southern 杂交等做进一步验证 。现在 , 为了更好地区别单交 换与双交换造成的重组 , 通常使用两个抗性标记 , 在发生单交换时 ,阴性和阳性抗性标记都会整合至 基因组 ,而发生双交换时 , 第二次同源重组会导致 基因回复至野生型或敲除目的基因 , 在前一种情况 下 ,两种标记都不存在 ; 在后一种情况下 , 基因组上 只有阳性标记 ,因此这样的敲除子可以通过正负筛 选鉴别出 。但如果载体构建时在同源序列内部引 入一些突变 ,就不会回复至野生型 , 这样 , 既能实现 基因的失活 , 基因组上又不会带有抗性标记 , 这对 构建“ 食品级 ” 的安全菌株是有益的 。 在了解微生物代谢途径相关基因的基础上 , 通 过构建合适的敲除载体 , 利用微生物原有原因与构 建的同源重组系统发生交换 , 进行代谢旁路的阻 断 ,防止副产物或有毒产物的形成 , 促进目的产物 积累 ,从而达到调节代谢流 , 优化代谢途径的目的 。 基因敲除技术既对敲除载体的要求不高可用于原 核细胞 ,也可用于真核细胞 ,用途广泛 。

2  敲除策略的选择
基因敲除过程中 , 敲除载体的设计及构建是非 常重要的 。同时 ,在载体构建的过程中要考虑建立 合理 、 可靠的筛选方法 。同源重组的效率较低 , 故 对重组子的筛选和检测是基因敲除的关键步骤 。 目前根据不同的目的和要求 , 基因敲除的策略主要 有以下几种 。
211   非复制型质粒载体敲除法
[3]

对野生菌做基因敲除 , 可以先考虑用非复制型

载体 。由于构建好的敲除载体在受体菌中是不复 制的 ,因此转化之后 , 在选择压力下 , 未发生重组的 转化子由于敲除载体不能复制随着菌体生长而被 稀释 。丁晓明等 利用在地中海拟无枝菌酸菌中 不复制的敲除质粒 PDK110, 成功地用 α2 粉酶基 淀 氨基 2 2 基苯甲酸合成酶基因 。此法的主要缺点 5羟 是整合几率低 , 需要数千碱基的同源序列 , 且对受 体菌的感受态效率要求较高 。
212   不稳定型质粒载体敲除法

因取代了地中海拟无枝菌酸菌 U32 染色体上的 3 2 若受体菌感受态较难制备 , 可考虑采用不稳定 型敲除载体 。例如 : 2 2 基 2 2 龙酸 ( 2 2KLG) 是维 酮 L古 生素 C 合成的重要前体 ,但发现存在高水平的 2 2 酮

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生物加工过程
senko 等
[8]

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基醛糖还原酶 ( 2 2KR ) 活力 。由于 2 2KR 能够利用 NADPH 或 NADH 辅酶将 Vc 生产菌代谢中重要的 中间产物 2, 5 2 酮基 2 2 萄糖酸 ( 2, 5 2 二 D葡 DKG) 及 2 2 将失活的 2 2KR 基因构建到 pBR322 衍生质粒上 , 这种质粒在受体 菌中分配不稳定 ,在无压力选择或低磷条件下培养
KLG转化为其他副产物 , 陈芳等
[4]

5 ~10 代会出现很多质粒丢失的细胞 。因此转化后

可先控制培养条件使敲除载体随细胞复制以增加 转化子的数目 ,然后再在无压力选择或低磷条件下 让质粒丢失 ,最后在选择压力下筛选敲除子 。目前 已成功敲除 2 2KR 基因 。 213   温度敏感型 ( Ts型 )质粒载体敲除法
1993 年 , B is was 等
[5]

利用 Ts型质粒建立了革

兰氏阳性菌高效的基因敲除系统 。B iswas所用质粒
pG + host5 在 37 ℃ 时不复制 , 而 28 ℃ 时以滚环模

式进行复制 。因此转化后在选择压力下 37 ℃ 培养 ( single 2crossover) , 之后 会导致第一次同源重组 sco 将温度降至 28 ℃,会促使质粒发生滚环复制 , 这种 复制机制会导致发生第二次重组 dco ( double 2cross2 over) 。重组后 , 目的基因或是被敲除 , 或是回复成 野生型 。由于使用了 Ts型质粒 ,因此转化后可先在 复制温度下培养促进转化子的生长及繁殖 。即使 外界无抗性选择压力重组机率也会增加 。该技术 可避免使用抗生素抗性标记 , 可用于构建“ 食品安 全级 ” 的菌株 。由于质粒是以滚环机制复制 , 重组 效率高 。B iswas的研究表明在有抗性选择压力时 , 50%以上的菌发生了替换重组 ; 无抗性选择压力时 , 替换重组的效率为 1% ~40% 。此外 , Ts型质粒宿 主谱广 ,可在很多革兰氏阳性菌中使用 。
214   线形转化敲除法 1998 年 , M urphy 等
[6]

报道了利用 λ噬菌体的

线性 Red同源重组系统获得高重组率 。 Red系统主 要包 含 3 种 蛋 白 质 分 子 , 分 别 称 为 Exo、 eta 和 B Gam。 Exo 蛋白具有 DNA 外切核酸酶活性 , 从双链
DNA 末端按 5 ’ 3 ’ → 的方向消化单链 DNA。B eta 蛋

白可结合在由 Exo 消化产生的 3 ’ 单链 DNA 末端 , 促进该单链 DNA 末端与互补链退火和体内重组 。 Gam 抑制宿主菌的重组蛋白 RecBCD 的线性双链 DNA 外切酶活性 , 协助 Exo 和 B eta 完成同源重组 。
Red 系统相对于宿主菌来说是一个外来的功能单
[7]

位 ,因此必须对其表达进行调控 。 Yu 等 将部分 λ 噬菌体的基因整合至 E1 coli 染色体上 , exo, beta 和 gam 3 个基因受 C2857 阻遏蛋白的调控表达 ; Dat2

将 Red 系统构建在一个以 arac 2ParaB 为 启动子的 Ts型质粒上 ,在阿拉伯糖的诱导下可进行 有效表达 ,而在温度控制下可快速去除此质粒 。王 [9] 恒  等 利用此类质粒快速敲除了痢疾杆菌中的 asd 基因 ,之后又利用编码 FLP 重组酶的 Ts型辅助 质粒去除了抗性基因 , 为 Red 系统在 E1 coli以外的 微生物中的应用进行了尝试 。 利用 λ噬菌体的 Red 同源重组在大肠杆菌中 做基因敲除的优点在于其所需的同源序列只需 30 ~ 50 bp ,如此短的核酸序列完全可以人工合成 , 从而 避免了繁琐的酶切及连接过程 。通过 PCR 产生的 两端带有同源臂的 DNA 片段即可在 Red 系统指导 下快速实现基因敲除 。 [ 10 ] 在链霉菌中 ,廖军等 利用含缺口的变性双链 DNA 敲除了葡萄糖异构酶的基因 , 推测可能是单链 DNA 的构型有利于其与链霉菌染色体序列的同源 重组 , 而碱变性后的双链 DNA 中的部分氢键的断 裂 ,造成部分单链区域成为同源重组的较佳底物 。 在酿酒酵母中 ,由于双链 DNA 缺口修复途径十 分有效 ,也可直接用由 PCR 产生的两端带同源序列 [ 11 ] 的线形 DNA 转化 , B audin 等 通过同源重组用酵 母筛选标记基因 (如 H IS3 )替换酵母中的目的基因 , 可快速产生大量的基因缺失突变体 。 采用线形基因不需采用特定的载体 , 这使构建 过程得以简化 ,并且可以避免采用环形载体时非同 源片段的干扰 。 215   结合转化敲除法 [ 12 - 13 ] 芮贤良等 利用宿主 2 体平衡致死系统筛 载 选致贺氏 3 价疫苗候选株 。首先使目的基因体外失 活 ,将其克隆到“ 自杀转移载体 ” pXL275 上获得质 粒 pXL312, 转 化 大 肠 杆 菌 受 体 菌 S λ ir。以 M10 p λp ir为供体菌 ,与受体菌 T32 进行固相滤膜交 S M10 配 ,由于重组质粒 pXL312 含有 RK2 的 mob 位点和 特殊的 R6K复制子 ,不仅可被供体菌内的 RP4 系统 诱导转移至受体菌 T32,而且在 T32 菌内不能复制 , 是一自杀型质粒 。因此 , 当用载体的抗生素抗性进 行选择时 ,可筛选到转移质粒和染色体发生同源重 组形成的共整合结合子 。因此 , 如果要进行基因敲 除的目标菌不易制备感受态或感受态效率很低 , 则 可以通过寻找“ 中介菌 ” 来完成基因转移的过程 。

3  基因敲除在代谢工程中的应用

代谢工程的难题就是如何使微生物的代谢主

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谢承佳等 : 基因敲除技术及其在微生物代谢工程方面的应用

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流流经理想载流途径 。在发酵生产中 , 为了达到这 一目的 ,从营养物质进入细胞到产物产生通常需要 从三个方面加以控制
[ 14 ]

, 即 : 使来自上游和各个注

入分支的碳架物质能畅通地流向目的产物 ; 阻塞或 去除与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支 流 ,使碳架物质相对集中地流向目的产物 ; 消除或 削弱目的产物进一步代谢的途径 。在上述各过程 中 ,起关键作用的无疑是酶 , 而基因敲除技术的出 现使快速失活成为现实 , 从而达到调节代谢流 , 优 化代谢途径的目的 。以下例子论述基因敲除技术 在代谢工程方面的应用 。 311   降低能耗 长链二元酸是合成工程塑料 、 香料 、 液晶等物 质的一种重要的化工原料 , 目前主要利用热带假丝 酵母转化烷烃进行生产 。在热带假丝酵母代谢烷 烃的过程中 , 烷烃的 β2 化过程 , 既是细胞生命活 氧 动所必需 ,但也存在原料的无益消耗 。高弘等 将 在脂肪酸向 β2 化转运过程中起到关键作用的肉 氧 毒碱乙酰基转移酶 ( CAT) 单拷贝敲除 , 减少 β2 化 氧 过程中脂肪酸的无谓消耗 , 经过初步检测 , 重组菌 的 CAT酶活降低了 43% ,十三碳二元酸的产量与摩 尔转化率分别提高了 1310%和 1118% 。 312   阻断或降低副产物的合成 乙酸是大肠杆菌代谢的末端产物 , 乙酸累积抑 制菌体生长和外源蛋白的表达 , 目前一般采用改变 发酵温度和限制补料速率等方法控制发酵液中乙 酸的浓度 ,近年来用代谢工程方法降低乙酸的累积 获得成功 。主要思路包括 : 阻断乙酸产生的主要途 径 ,限制糖酵解途径中的碳代谢流 , 转换过量的丙 酮酸为其他低毒性的副产物以及分流碳代谢流等 [ 16 ] 几个方面 。在大肠杆菌磷酸转移酶系统中 ,葡萄 糖主要由 ptsG 基因编码的酶转运入细胞 。降低葡 萄糖的摄取速率 , 减少了乙酸累积 , 有利于菌体生 [ 17 ] 长 。韩聪等 利用基因敲除技术构建 ptsG基因缺 陷株 ,净化葡萄糖的摄取速率 , 减少了乙酸累积 , 有 利于菌 体 生 长 。在 含 有 葡 萄 糖 的 LB 培 养 基 中 , ptsG基因缺陷株最高菌密度分别是原始菌的 3147 倍和 4125 倍 ,在大肠杆菌高密度发酵研究方面具有 良好的应用前景 。 的条件下水解蛋白质肽键的酶类 , 广泛应用于各种 [ 18 ] 洗涤剂 。唐雪明等 构建了带卡那霉素和碱性蛋
313   去除重组菌的抗性 碱性蛋白酶 (A lkaline p rotease ) 是指在 pH 碱性
[ 15 ]

白酶基因的质粒 ,通过逐步提高培养液中卡拉霉素 的水平 ,促进载体不断整合至染色体上 , 从而实现 碱性蛋白酶基因在宿主染色体的扩增 。但是 , 带多 拷贝卡拉霉素基因的构建菌可能会给环境造成转 [ 19 ] 基因污染 ,故又构建载体敲除了卡拉霉素基因 , 筛选得到了 11 株不含抗性基因的整合型碱性蛋白 酶工程菌 ,并使产酶水平保持稳定 。 314   提高产物纯度 乳酸在食品 、 医药 、 化工 、 环保等领域有广泛的 用途 。乳酸菌 L actobacillus helveticus CNRZ32 既有 Kyla 2 2 酸脱氢酶基因 ( ldhL ) ,又含 L 2 酸脱氢酶 D乳 乳 [ 20 ] 基因 ( ldhD )等 。用基因替代的方式构建了 2 株 菌 GRL86 和 RL89, 其中 GRL86 菌株缺失了 ldhD 的启动子区域 ; GRL89 菌株中用另一个 ldhL 基因替 代了 ldhD 基因 ,新增加的 ldhL 在原来 ldhD 启动子 的调控下表达 1敲除后 ,两株菌都只生产 L 2 酸 ,且 乳 L2 LDH 的 最 高 活 性 分 别 比 原 始 菌 株 高 出 53% 和 93% 。 315   降低或阻断骨骼代谢 奎尼酸是一种具有光学活性的环状多羟基化 合物 ,可广泛用于合成抗肿瘤制剂 、 免疫抑制剂 , 助 溶剂及光学材料等 。在大肠杆菌中 , 奎尼酸的前体 化合物是莽草酸途径的中间代谢产物 , 是由糖酵解 和磷酸戊糖途径分别产生的磷酸烯醇式丙酮酸和 赤鲜糖 2 2 酸缩合而来 , 这是决定芳香化合物合成 4磷 [ 21 ] 速率及产量的关键 。B erry等 将糖酵解途径中的 限速酶 —— — 丙酮酸激酶的 2 个同工酶基因都敲除 后 , DAHP 的产量增加了 3 倍 。后来又采取扩增 DAHP合成酶基因 roG 和编码转酮酶 A 的 tk tA 基 因 ,同时失活两个丙酮酸激酶同工酶 , DAHP 产量 [ 22 ] 明显提高 。 在微生物芳香族氨基酸的生物合成中 , 至少有 17 种酶参与 , 且具有复杂的调控机制 。在大肠杆菌 中 ,发现了苯丙氨酸合成的中心代谢途径及其他生理 特性的调控因子 —— — 贮碳因子 ( Carbon Storage Regu2 lator A , Csr A ) ,敲除 Csr A 可增强糖质新生 ,降低糖 酵解 ,因此提高了芳香族氨基酸的前体物质 —— — 磷酸 烯醇式丙酮酸的量 ,整体水平上实现对芳香族氨基酸 的中心代谢途径的调控 ,敲除 Csr A 并优化条件后苯 [ 23 ] 丙氨酸的产量是出发菌株的两倍 。

4    展 望

作为一项新兴的微生物育种技术 , 基因敲除克

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生物加工过程

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服了传统诱变方法的盲目性和偶然性 , 敲除后被改 变的基因会随染色体 DNA 进行复制 ,改良的菌种可 稳定地用于后续的研究和生产 。 随着大量模式生物及重要功能微生物全基因 组的解明以及功能基因的定位 , 人们从基因水平上 更加清楚的认识微生物代谢的规律 , 同时敲除载体 及相关技术的完善可进一步推动代谢工程的广泛 应用 ,通过基因敲除手段改变微生物细胞的代谢流 向 ,阻断有害代谢产物积累 , 可望降低成本 , 大幅度 提高生产水平及产品纯度 。 除了微生物代谢工程 , 基因敲除技术还可用于 [ 24 ] 基因结构与功能研究 、 细胞生活周期调控机制 研究 、 无毒活体疫苗的制备研究以及遗传病的基因 治疗等诸多方面 。随着人类基因组计划的完成以 及疾病分子机理的解明 , 基因敲除技术还可有效用 于遗传病及癌症的基因治疗 。该技术可望在发酵 , 医药 ,轻工食品等多项领域作出重大贡献 。 参考文献 :
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