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杏鲍菇组织分离实验方案


杏鲍菇组织分离实验方案
实验目的
1、通过新鲜杏鲍菇子实体的组织分离得到杏鲍菇纯菌种,学习其原种及栽 培种的制备,并尝试性地进行出菇试验; 2、学习并掌握珍稀食用菌——杏鲍菇菌种的制备过程,理论联系实际,同 时为暑期到榕珍菌业实习做准备; 3、通过亲身实践,发现自身存在的理论及实践方面的不足,为接下来的食 用菌理论知识的系统学习指明方向, 同时锻炼自己对食用菌

菌种分离的操作及相 关知识的熟悉,为以后独立实验打下坚实的基础。

实验内容
1. 杏鲍菇子实体的采集及预处理; 2. 杏鲍菇子实体的组织分离及纯化; 3. 杏鲍菇菌种的观察、鉴定、保藏; 4. 杏鲍菇原种、栽培种制备及出菇试验;

实验原理
1. 杏鲍菇介绍
杏鲍菇(Pleurotus eryngii)又名刺芹侧耳、雪茸,分类学上属于担子菌亚门 ( Basidiomycetes) , 层 菌 纲 (Hymenomycetes) , 伞 菌 目 (Agaricales) , 侧 耳 科 (Pleutotaceae),侧耳属(Pleurotus)。杏鲍菇菌肉肥厚,质地脆嫩,并且食之有一 种特殊的杏仁香味,商品性状好,有“杏鲍菇王”“干贝菇”等美称。 、 杏鲍菇干品含蛋白质 21.44%,脂肪 1.88%,还原糖 2.17%,总糖 36.78%,甘露 醇 2.27%,游离氨基酸 2.36%,总碳水化合物 57.35%,水溶性成分 66.9%,灰分 7.83%,水分 11.56%。杏鲍菇入药有降血压和降血脂的作用,杏鲍菇寡糖含量丰 富,与双歧杆菌共用,有改善肠胃功能和美容的效果。杏鲍菇被列为 21 世纪最 具开发潜力的食用菌之一。由于其生产周期短、见效快、效益相对较高,在农村 种植结构调整中非常受欢迎,种植面积在不断扩大,是近几年深受国际市场欢迎 的珍稀食用菌。

2.

杏鲍菇生物学特性

2.1 形态特征
子实体单生或群生,视基质营养和水分及菌丝生理度而异;菌盖幼时略呈弓 形;后渐平展,成熟时其中央凹陷呈漏斗状,直径 2~12cm 不等,一般单生个

体稍大,群生时偏小;菌盖幼时呈灰黑色,随着菇龄增加渐变浅,成熟后变为浅 土黄、浅黄白色,中央周围有辐射状褐色条纹,并具丝状光泽;菌肉纯白色,杏 仁味明显,破口处短时间变干黄;菌褶延生不齐、白色,与普通杏鲍菇相同;菌 柄长 2~8cm,直径 0.5~3cm,不等粗,基部膨大,呈球茎体状;多侧生或偏生, 中实,肉白色、纤维态,吸水性较强。

2.2 生态习性
杏鲍菇广泛分布于德、意、法、捷、匈及印度、巴基斯坦等国,我国新疆及 川西等地亦有野生分布, 大多着生于朽死的刺芹、 阿魏等植物根部及四周土层中, 具一定寄生性, 故推测可能与其着生基质中有某种成分驱避害虫使其得到有效保 护有关。

2.3 生理特征
营养条件: 营养条件:杏鲍菇分解纤维素、木质素、蛋白质的能力较强,对葡萄糖、果 糖和麦芽糖等碳源的利用率较高,实际生产中,各种农副产品的下脚料和农作物 秸秆可作为杏鲍菇的培养料,将棉籽壳、木屑等作为主要原料,调配氮源时以麦 麸等作为主要辅料,以降低生产成本,并同时提高菌丝长速及其活力。 温度条件: 温度条件 : 温度是在栽培杏鲍菇的关键因素。杏鲍菇居室内生长适温为 20-28℃,子实体生长适温为 10-18℃。 分条件: 水分条件:杏鲍菇菌丝生长阶段培养料含水量一般为 60%-65%,子实体发 育期间空气相对湿度为 85%-95%为宜,但不宜向菇体上喷水。 条件: 光照及 CO2 条件:杏鲍菇菌丝生长不需要光线,却需新鲜空气。CO2 对菌 丝生长有促进作用,出菇期需要 500-1000lx 的光照,并需加强通风换气。 pH 条件:菌丝生长最适 pH 为 6.5-7.5,出菇期最适 pH 为 5.5-6.5。 条件:

3.杏鲍菇母种培养基 杏鲍菇母种培养基
3.1 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) g/1000mL 马铃薯(去皮) 200,葡萄糖 20,琼脂 20,水 1000mL。 3.2 杏鲍菇母种培养基 [1] g/1000mL 马铃薯 200,葡萄糖 20,琼脂 20,蛋白胨 2,KH2PO4 0.6,MgSO4 0.5, 水 1000mL 3.3 马铃薯葡萄糖酵母粉琼脂培养基 马铃薯葡萄糖酵母粉琼脂培养基(PDYA) [2] g/1000mL 马铃薯(去皮) 45,葡萄糖 30,琼脂 25,蛋白胨 1.5,酵母膏 3,水 1000。

4.杏鲍菇子实体预处理及组织分离: 杏鲍菇子实体预处理及组织分离: 杏鲍菇子实体预处理及组织分离
杏鲍菇的菌种分离方法有组织分离法、孢子分离法等。

4.1. 组织分离法
组织分离法(tissue isolation)是用子实体内部菌肉组织来获得菌种的一种最 简便的方法,是生产上常用的一种分离菌种的方法。 子实体组织分离法,选择优良的种菇作为分离材料,用无菌水冲洗后,用 75%的酒精溶液表面消毒。取消毒锅的刀片从菌柄或菌盖中部纵切、撕开,挑取 菌盖与菌柄交界处的一小块组织(火柴头大小) ,接种到培养基上 3~5 天后,组 织块上即可长出白色绒毛状菌丝,说明分离成功。 组织分离是一种无性繁殖过程,所得到的菌种室营养后代,后代不易变异, 菌株可保持原品种的优良品质。但如采用感染病毒的子实体进行组织分离时,常 得到带病毒的菌丝体。 金针菇盖小而薄, 可取菌柄上方生长点作为分离部位; 胶质菌类 (如黑木耳) 最好采用尚未展开耳片的耳基团内的组织进行分离,则可能获得较好的效果。

1.2. 孢子分离法
在无菌操作条件下使孢子在适宜的培养基上萌发, 长成菌丝体而获得纯菌种 。其特点是:菌丝菌龄短,因时有性繁 的方法称为孢子分离法(spore isolation) 殖产物,其菌丝生命力强。侵染病毒的菌类可用孢子分离法脱毒。在一般菌种分 离中,为了避免异宗接合的菌类如香菇、杏鲍菇产生单孢子不孕现象,一般都采 用多孢子分离法(muti-spore isolation) 。单孢子分离法(single-spore isolation) 主要应用于食用菌的杂交育种。但双胞蘑菇、草菇等同宗接合菌类可采用单孢子 分离法。 整菇插种法:整菇插种法,需用一套孢子收集器来收集孢子,将钟罩上的孔 整菇插种法 加上棉塞或包上 6~8 层纱布,放在垫有 4~6 层纱布(浸过 0.1%升汞液)的搪瓷 盘上,纱布上放一培养器,用 0.1%升汞溶液或 0.25%新洁尔灭浸泡 2~3min,以 杀死表面的杂菌。按无菌操作要求移入孢子收集器,插在支架上,在适宜的温度 中培养。2~3 天后孢子散落在培养皿中,加入无菌水,用针筒吸取孢子液,接种 在斜面培养基中央,置于 22~26℃恒温培养箱中培养即 可。 钩悬法:在生产上,采集木耳、银耳孢子常用此法, 钩悬法 伞菌也可采用此法。先将新鲜成熟的耳片用无菌水冲 洗,然后用无菌纱布将水吸干,取一小片挂在灭菌的钩 子上(伞菌则消毒后挂上) ,钩上的另一端挂在三角瓶 口,瓶内装有培养基,在 25℃下培养 24h.孢子落到培 养基上后,取出耳片,塞上棉塞继续培养,然后再转入 试管中培养。

5.杏鲍菇菌种鉴定 杏鲍菇菌种鉴定
(1)母种 菌丝洁白、浓密、粗壮、生长整齐,有光泽、匍匐状、气生菌丝发 ) 达、不产生色素。居室内生长速度快,在 20-22℃条件下,6-8d 长满斜面,接种 块周围无菌丝稀疏区。 菌丝粗壮, 生长整齐, 气生菌丝少, 有清香的为优良品种。

(2)原种、栽培种 菌丝密集、洁白,长势均匀、粗壮,呈绒毛状,有爬壁现 )原种、 象,在培养基表面有少量珊瑚状小菇蕾出现。 原种长满瓶(袋)10d 左右使用, 栽培种长满瓶(袋)15d 内使用。

6.杏鲍菇菌种保藏 杏鲍菇菌种保藏 杏鲍菇
常用的保藏方法有以下几种: 斜面低温保藏法 一、斜面低温保藏法 斜面低温保藏,又叫定期移植保藏法。是常用的最简便的保藏法,将需要保藏的 菌种接种在适宜的斜面培养基上,培养到接近成熟后,放在 4℃~5℃的冰箱中 保藏。 二、矿油保藏法 矿油(主要是液体石蜡)保藏,又称液体石蜡覆盖保藏。用此法保藏,不需要太 多的设备,操作简便,只需在菌苔上灌注一层无菌的液体石蜡,即可使菌种与外 界空气隔绝,达到防止培养基水分散失,抑制菌种新陈代谢,延长保存时间的目 的。一般室温下可保藏 5~7 年,期间 1~2 年应移接 1 次。用此法保藏的菌种不 必置于冰箱内,室内保藏即可。

7.杏鲍菇栽培工艺 杏鲍菇栽培工艺

实验器材
1. 药品: 药品:
药品名称 马铃薯 葡萄糖(蔗糖) 蛋白胨 KH2PO4 MgSO4 琼脂 数量(类型) 2-3 个 20-22g 2g 0.6g 0.5g 25g

2.仪器: 仪器: 仪器
仪器名称 试管 三角锥形瓶 烧杯 接种环(针) 量筒 玻璃棒 电热干燥箱 手提式高压灭菌锅 精密 pH 试纸 恒温恒湿培养箱 显微镜 (OLYMPUS) 数量(类型) 20-25 支 2-3 个(250mL、500mL) 5-8 个(50mL、500mL) 1-2 个 1000mL 1根 1个 1个 pH=4.5-7.0 1个 载玻片,盖玻片,擦镜 纸

其他必备物品: 其他必备物品: 仪器: 、棉花、报纸、牛皮纸、纱 仪器:长颈漏斗、培养基分装器(见微生物实验书) 布、麻绳、标签、牛角匙、天平 、打火机、水果刀等

实验步骤
1. 杏鲍菇子实体准备及预处理: 杏鲍菇子实体准备及预处理: 子实体准备及预处理
在市场上购买新鲜的杏鲍菇作为实验材料,准备好试管,以及各种工具。

培养基的配制及灭菌: 培养基的配制及灭菌:
按照上述的培养基配方配制好相应的培养基, 自然 pH, 用高压灭菌锅在 0.1MPa, 121℃下灭菌 30min,趁热分装到已灭菌的试管中,制得试管斜面培养基。 具体过程: 具体过程:

1.配制柠檬酸溶液(0.08%) ; 2.斜面培养基配制具体操作: 称取马铃薯(新鲜、去皮、切成小块) ,置于加热锅中,加水 1000mL,然后煮沸 30min,期间用玻璃棒定时搅拌防糊底。然后用双层纱布过滤取滤液加入其它成 分 (除琼脂) 充分溶解, 加热煮沸后加入琼脂, 继续加热融化并补足失水至 950mL, 调节 pH 值至 5.5。此溶液置于 1000mL 锥形瓶中,然后分装到试管中,5 支为一 单位扎捆在一起,包上牛皮纸,在 0.1MPa,121℃,高压蒸气灭菌 30min。待 PDA 培养基冷却到 60℃左右,摆斜面,斜面长度以斜面顶端距棉塞 40-50mm 为标准 (距试管口 1/4 处即可) 。在培养基凝固之前,不宜再行摆动。

2. 杏鲍菇组织分离: 杏鲍菇组织分离:
把斜面培养基和工具放入超净工作台中,紫外线照射 30min。再把子实体放入其 中,子实体表面不需要任何的药物消毒。在超净工作台中无菌操作,用接种铲或 手术刀、接种针等工具取菌柄中央或菌盖中央的菌肉组织,在每支试管的斜面中 央放一粒黄豆大小的组织块,将试管放置于 25℃恒温培养箱中培养并观察。

原种及栽培种制作: 原种及栽培种制作:
原种和栽培种其营养条件相似,制作方法基本相同。原种和栽培种培养基的种类 很多。

常用配方

发菌管理: 发菌管理 : 一般应调控温度在 15~30℃范围;最佳 25℃,空气相对湿度
65%-70%左右;并有少量通风,尽管杏鲍菇菌丝可耐受较高浓度二氧化碳,但 仍以较新鲜空气对菌丝发育有利;此外,密闭培养室使菌袋在黑暗条件下发菌, 既是菌丝的生理需求,同时也是预防害虫进入的有效措施之一。一般 40 天左右, 菌丝可发满全瓶(袋) 。

出菇管理: 出菇管理:杏鲍菇的出菇温度因菌株而异,一般为中温型,利用自然温度进行
室内栽培,可在气温稳定在 10℃,但最高温度不超过 30℃时安排出菇;利用塑 料大棚安排出菇时,宜在气温 8℃~25℃时进行,这样,经升温保温,棚温可保 持在 13℃左右;或经加厚覆盖、喷水降温,降至 20℃以下,该温度范围内,一 般可满足杏鲍菇子实体生长需求。 催蕾阶段: 催蕾阶段:菌袋发满后,再维持 7 天左右令菌丝充分生理成熟,然后移入菇

棚,剪掉扎口或拔除棉塞、去掉套环后将袋口翻下,也可剪掉,露出料面。调控 棚湿至 95%左右,光照强度 1000xl,并有少量通风,经约 15 天左右,袋口料表 面即有白点状原基形成,秋栽时采取措施适当降低棚温,春栽时则应设法予以提 高,并稍加大通风量,保持原有棚湿,原基数量不断增加,继之连片,随之原基 分化,幼蕾现出。该阶段棚温应严格控制在 20℃以下,否则,不能现蕾。 幼蕾阶段 幼蕾阶段:幼蕾体微性弱,需较严格、稳定的环境条件,该阶段可将棚温稳 定在 15℃ ~20℃、棚湿 90%~95%、光照度 500~700xl,以及少量通风,保持 棚内较凉爽、高湿度、弱光照及清新的空气,约 3~5 天,幼蕾分化为幼菇,即 可见子实体基本形状。 幼菇阶段: 幼菇阶段:子实体幼时尽管较蕾期个体大,但其抵抗外界不利因素的能力仍 然较弱,该阶段仍需保持较稳定的温、水、气等条件,为促其加快生长速度及其 健壮程度,可适当增加光照度至 800xl,但随着光照的提高,子实体色泽将趋深, 故需掌握适度。经 3 天左右,即转入成菇期。 幼蕾及幼菇阶段,是发生萎缩死亡的主要阶段,其主要原因是温度偏高,尤 其是秋栽的第一潮菇和春栽的二潮菇,处于温度较高的大气环境中,管理中稍有 疏忽或措施不当、管理不及时等,将会令棚温急骤上升,一旦达到或超过 22℃, 幼蕾即大批发黄、萎缩、继之死亡,幼菇阶段亦如此。因此,严格控制棚温,将 是杏鲍菇菇期管理的重要任务,所以,根据其生物学特性,严格、有效地调控各 项条件,正确处理温、气、水、光之间的矛盾,使子实体各阶段均处于较适宜的 环境中,最大限度的降低死亡率,已成为菇期管理工作优劣的评判标准。 成菇阶段: 成菇阶段: 为获得高质量的子实体,该阶段应创造条件进一步降低棚温至 15℃左右,控制棚湿 90%左右,光照度减弱至 500xl,尽量加大通风,但勿使强 风尤其温差较大的风吹拂子实体;风力较强时,可在门窗及通风孔处挂棉纱布并 喷湿,或缩小进风口等,以控制热风、干风、强风的进入,既保证棚内空气清新, 又可协调气、温、水之间的平衡、稳定的关系,将使子实体处于较适宜条件下, 从而健康、正常地生长。 采收: 采收:当子实体基本长大,基部隆起但不松软、菌盖基本平展并中央下凹、 边缘稍有下内卷、但尚未弹射孢子时,即可及时采收,此时大约八成熟。如生产 批量较大时,可掌握七分熟时采收。采收的子实体应随即切除基部所带基料等杂 物,码放整齐以防菌盖破碎,并及时送往保温库进行分级、整理及包装,或及时 送往加工厂进行加工处理,不得久置常温下,以防菌盖裂口、基部切割处变色而 影响商品质量;更不得浸泡于水中,使其充分吸水以增加重量,否则,商品质量 将大打折扣。 采后管理: 采后管理:将出菇面清理干净,并清洁菇棚,春栽时喷洒一遍菊脂类杀虫药 及多菌灵等杀菌剂后, 密闭遮光, 使菌袋休养生机, 秋栽时只喷一遍杀菌剂即可。 待见料面再现原基后, 可重复出菇管理。 一般可收 1~3 潮菇, 生物学效率 50%~ 60%,商品率 80%~90%

结果及讨论

参考文献
[1]方白玉,柯野,郑秋桦.杏鲍菇母种培养基的优化初探[J].食用菌 EDIBLE FUNGI 2006(4) :25. [2] 邹莉,李绍鹏,袁玲.杏鲍菇最佳培养基的筛选[J].菌物研究 JOURNAL OF FUNGAL RESEARCH,2006,4(1):38-41.


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